Metoder til billeddannelse intracellulære pH af follikel stamcelle afstamning i Live Drosophila æggestokkene væv

Summary

Vi leverer en protokol for imaging intracellulære pH af en epitel stamcelle afstamning i live Drosophila æggestokkene væv. Vi beskriver metoder til at generere transgene fluer udtrykker en pH biosensor, mCherry::pHluorin, billede biosensor ved hjælp af kvantitative fluorescens imaging, generere standard kurver og konvertere fluorescens intensitetsværdierne til pH-værdier.

Abstract

Ændringer i intracellulære pH (pHi) spille en vigtig rolle i reguleringen af mange cellulære funktioner, herunder metabolisme, spredning og differentiering. Typisk, pHi dynamics bestemmes i kulturperler celler, som er indstillet til måling og eksperimentelt manipulere pHi. Den seneste udvikling af nye værktøjer og metoder har dog gjort det muligt at studere pHi dynamikken i intakt, levende væv. For Drosophila forskning, en vigtig udvikling var generation af en genetisk modificeret linje transporterer en pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Her, beskriver vi en protokol, der vi rutinemæssigt brug for billeddiagnostiske live Drosophila ovarioles til at måle pHi i epitelial follikel stamceller (FSC) slægt i mCherry::pHluorin transgene vildtype linjer; de metoder, der beskrives her kan dog let tilpasses til andre væv, herunder wing diske og øjet epitel. Vi beskriver teknikker til at udtrykke mCherry::pHluorin i FSC afstamning, opretholde æggestokkene væv under live imaging, og erhverve og analysere billeder for at få pHi værdier.

Introduction

Nylige undersøgelser afslørede en rolle for ændringer i pHi under cellulære differentiering og dysplasi i vivo^1,2. Disse undersøgelser fandt at pHi er bemærkelsesværdigt konsekvent i celler af samme type på den samme fase af differentiering, men at det ændrer som celler overgangen fra én fase til en anden. I nogle tilfælde forstyrrer blokerer ændringer i pHi delvist differentiering, tyder på, at ændringen i pHi er ikke blot en konsekvens af ændringer i celle skæbne, men i stedet bidrager til at fremme ændringer i celle skæbne, måske gennem effekter på pH-følsom regulerende proteiner eller kemiske reaktioner påkrævet for differentiering. Fremtidige undersøgelser har potentiale til at afsløre mere indsigt i de mange forskellige roller i pHi dynamics i vivo. En af udfordringerne ved at studere pHi under differentiering i vivo er imidlertid at få nøjagtige målinger af pHi. I modsætning til andre funktioner af differentiering, såsom ændringer i cellulære morfologi og genekspression, er pHi labile kemisk egenskab for den celle, der ikke er bevaret i celler, der har været fast og permeabilized med standardmetoder. Derudover kan pHi ikke være stabil i celler, der er stresset eller døende som følge af eksperimentel manipulation. Det er således vigtigt at holde celler i live og så sunde som muligt når måling pHi. Flere vitale farvestoffer findes at arbejde godt for måling pHi af celler i kultur³, men i mange tilfælde de ikke egner sig til i vivo undersøgelser, fordi de ikke trænge ind i vævet dybt eller jævnt nok til at give nøjagtige målinger .

For at omgå problemet med dårlig farvestof penetration, har vi og andre brugt en genetisk kodet sonde, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, der kan udtrykkes konkret i cellen typer af interesse og afbildet i levende væv. pHluorin er en variant af normal god landbrugspraksis med en højere pKa (~ 7.0 vs. ~ 4.0), folder mere let på højere pH; så samlede fluorescens-intensiteten udsendes fra en befolkning på pHluorin molekyler i cellen stiger med stigende pHi⁸. Vigtigere, er fluorescens lineær i det cytosole normalområdet af pHi værdier. I kontrast, fluorescens af mCherry (pKa ~ 4,5) er ufølsom over for pH-ændringer inden for det cytosole interval. Disse to journalister er kovalent knyttet sammen som en enkelt kimære protein, kodet af en enkelt åben behandling ramme, så de er altid til stede i lige store mængder. Derfor, forholdet mellem pHluorin til mCherry fluorescens intensitet giver en måling af pHi, der er normaliseret til koncentrationen af sonden i hver celle. Nøgletal kan derefter konverteres til skøn over pHi værdier ved hjælp af en standardkurve, der er genereret af anskaffelse af pHluorin til mCherry nøgletal fra væv, der har været ekvilibreres til kendte pH-værdier.

Her, beskriver vi metoder til at bruge mCherry::pHluorin til at måle pHi af epitel FSC slægt i Drosophila æggestokken. Denne godt karakteriseret væv er blevet brugt til at modellere mange forskellige aspekter af epithelial biology, såsom stamcelle selvfornyelse og differentiering^9,10,11, kollektive celle migration¹² , samt udvikling og vedligeholdelse af celle polaritet^13,14. Follikel epitel er produceret af to FSCs, der er placeret på den forreste kant af væv i en struktur kaldet germarium^15,16. Disse celler deler sig regelmæssigt i voksenalderen selv forny og producere afkom, kaldet prefollicle celler (PFC), der kan enten genindtræde niche og blive en FSC eller differentiere i en af tre forskellige follikel celletyper: polar celler, stilk celler, eller hoveddelen follicle celler. Vi viste tidligere, i vildtype væv, pHi stiger støt i de tidlige stadier af differentiering, fra en pHi af ca 6,8 i FSCs 7.0 i PFC, 7.3 i follicle celler². Blokerer denne stigning af RNAi knockdown af en allestedsnærværende udtrykt natrium/proton varmeveksler, DNhe2, alvorligt svækker pFC differentiering, der henviser til, at øge pHi ved overekspression af DNhe2 forårsager en mild overskydende differentiering fænotype. Disse resultater viser at pHi bevares stabilt i den tidlige FSC afstamning, og at det kan være eksperimentelt steget eller faldet i vivo. De metoder, der beskrives her kan bruges til at måle pHi i enten vildtype væv eller forskellige former for mutant væv, herunder RNAi knockdown eller overekspression ved hjælp af en Gal4 af interesse og mitotiske kloner.

Protocol

Bemærk: for at måle pHi i FSC afstamning, vi beregne forholdet mellem fluorescens intensiteter af pHluorin til mCherry i FSCs, PFC'er og hårsækken celler i fysiologiske tilstande, og omforme nøgletal i pHi værdier med standard kalibreringskurverne for hver celle type ⁷. Første, live imaging forsøg er udført for at måle fluorescens intensiteter i pHluorin og mCherry i germaria dissekeret i en buffer, som indeholder NaHCO ₃, som efterligner fysiologiske forhold ^{1 , 7}. næste, standard kurver genereres ved at måle pHluorin og mCherry fluorescens intensiteter i en Na ⁺-gratis, K ⁺ buffer indeholdende ionophor nigericin justeret til to forskellige pH-værdier, 6,5 og 7,5. I overværelse af nigericin afbalanceres pHi med pH-værdien af bufferen over plasmamembran, forårsager pHi til at matche den ekstracellulære pH. Endelig, de standard kurver bruges til at konvertere pHluorin til mCherry nøgletal til anslåede pHi værdier.

1. forud for retssagen: forberedelse før måling pHi In Vivo

Bemærk: for at måle pHi i vivo, mCherry::pHluorin transgenet skal udtrykkes i celletype af interesse. Nedenfor er nogle almindelige måder at generere transgene pHluorin flyver i FSC afstamning. Generere mCherry::pHluorin kloner er især nyttig til at identificere FSCs, som er placeret på den forreste kant af en FSC klon. Væv specifikke mCherry::pHluorin udtryk er nyttige til måling af pHi på tværs af hele væv og er også mere praktisk, når man kombinerer med udtryk for et RNAi eller transgenet.

1. Generation af transgene pHluorin flyver
   1. mCherry::pHluorin-mærket FSC kloner
      1. at gøre mCherry::pHluorin FSC kloner, krydse UAS-mCherry::pHluorin ¹ til en akt-Gal4 flipout eller andet lager med et Flp/FRT inducerbar Gal4.
      2. For at gøre heatshock inducerbar kloner, heatshock voksen F1s i 2 dage post eclosion i tomme hætteglas til 1 h i et 37 ° C vandbad, fire gange ca hver 12 h.
      3. For at sikre normal vækst og maksimale satser for oogenesen i denne periode, opretholde fluer ved at levere frisk våd gær (ca lige dele tørre baker ' s gær og vand) dagligt i mindst 6 dage efter klon induktion.
   2. Væv specifikke mCherry::pHluorin udtryk
   3. krydse UAS-mCherry::pHluorin ¹ til en follikel celle specifik driver, y ¹ w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington ID: 7023).
   4. 3 dage efter fluer begynder eclosing, indsamle og placere dem i hætteglas indeholdende vådt gær i mindst 24 timer før dissektion.
2. At lave løsninger
   Bemærk: det er vigtigt at forberede de følgende buffere på dagen af forsøget, fordi pH og opløst stof koncentrationerne i bufferen kan ændre sig over tid.
   1. Forbered bikarbonat, nigericin og dissektion buffere. Tilføje komponenter i rækkefølgen, der er anført for at undgå dannelse af bundfald (der henvises til tabel 1, tabel 2 og tabel 3).

2. Forsøg: Måling af pHi i FSC slægt

Bemærk: dissektion, montering, og live imaging trin til bikarbonatbuffer og de to nigericin buffer betingelser muligvis skal udføres to gange: én gang for at bestemme mikroskopet indstillinger og et anden gang at indsamle eksperimentelle data. Se afsnit 2.2 nedenfor for flere oplysninger.

1. Dissektion og montering
   Bemærk: For materialer, der kræves for at udføre dette trin henvises til figur 1 og Tabel af materialer. For 3D trykte montering kamre leveres 3D printerfiler som supplerende fil 1 og supplerende fil 2.
   1. Dissektion:
      1. Forbered montering kamre ved at anvende en tynd belægning af vakuum fedt at de fladere side af 3D trykt montering kammer. Læg denne side på en 22 x 40 mM coverslip at forsegle coverslip til montering afdeling.
   2. Dissekere æggestokke fra kvindelige voksne fluer i 500 µL dissektion buffer (bikarbonat eller nigericin buffer, tabel 3)
      1. Anesthetize 3-4 fluer ved hjælp af CO ₂ gas og overførsel flyver på en flyve pad perfunderet med CO ₂ gas.
      2. Afhente en bedøvede flyve med pincet og sted i dissektion media.
      3. Knivspids thorax af flyve med en forcep, mens tugging på spidsen af sit underliv, indtil dens æggestokkene udsættes.
      4. Efter afmontering æggestokke fra andre organer, drille hinanden ovarioles ved hjælp af 22 ^1/2 sprøjte nåle. Omhyggeligt separat musklen jakke fra æggestokkene og separate individuelle ovarioles fra klyngen af ovarioles. En effektiv teknik til at isolere muskel kappe er at bruge en sprøjte nål til at holde klyngen af ovarioles på plads i den forreste ende, og slagtilfælde nedad langs længden af indre ovarioles.
      5. Ruger dissekeret æggestokkene i dissektion medier i nøjagtigt 10 min inden vi går videre til montering trin, således at der er tilstrækkelig tid til pHi af celler til fuldt reagensglasset med pH nigericin dissektion mediernes.
         Bemærk: Sikre at muskel kappe er fjernet fra ovarioles. Muskel kappe kan dæmpe fluorescens signal, hvilket gør det vanskeligt at identificere enkelte celler ved hjælp af Concanavilin-A, og kan forårsage ovarioles til at flytte spontant under live imaging.
   3. Montage
      1. Anbring en lille dråbe af dissektion medier på glas coverslip i montering afdeling.
      2. Overførsel adskilt ovarioles ved hjælp af pincet.
      3. Adskille senere fase æg kamre fra germaria forbundet med tidligere fase æg kamre, og forsøge at sikre, at de dissekerede germaria er placeret i midten af dissektion media drop.
      4. Tilføje to små dråber af neglelak på modsatte sider af en rund 12 mm coverslip og lad det lufttørre for omkring 10 s.
      5. Sted at runde coverslip på dråbe af dissektion medier indeholdende adskilt germaria sådan, at siden med neglelak vender nedad og kontakter dissektion medier. Tryk ned på delene af kanten med neglelak til at flade og sikre germaria i stilling. Vi anbefaler at bruge ældre neglelak, fordi det udstrygningspræparater mindre over overfladen af coverslip som det er at blive fastgjort.
      6. Fylde montering kammer med yderligere dissektion medier. Betingelse specifikke buffer, som ikke indeholder Concanavalin-A farvestof kan bruges til at fylde salen.
         Bemærk: Den samlede tid brugt dissekere og montering bør ikke overstige 15 min. Det er vigtigt at minimere virkningerne af vævsskader og celle død.
2. Live imaging:
   NOTE: på dette trin skal først indsamle billeder fra bikarbonat tilstand og de to nigericin betingelser at fastlægge de rette mikroskop indstillinger; justere indstillingerne mikroskop som nødvendigt, og derefter indsamle billeder til eksperimentelle data. Bruge en Konfokal mikroskop i stand til at billeddannelse i 3 kanaler: normal god landbrugspraksis (475 excitation/509 emission), mCherry (575 excitation/610 emission), og far-red (633 excitation/647 emission).
   Bemærk: Sæt mikroskop indstillinger: pixel intensiteter af billederne indsamlet vil kvantificeres for at bestemme skøn over pHi, så det er vigtigt at intensitetsværdierne af signalet i hvert billede sæt er hverken for lavt eller mættet. Rækken af støtteintensiteter, der kan blive fanget i et billede er defineret af billedet bitdybde. 8-bit billeder genereres som standard i mange tilfælde, men vi anbefaler erhverve data som 16-bit billeder, som har et bredere dynamikområde. Det er vigtigt at sikre, at krydstale mellem fluorescerende kanaler minimeres, så indstillingerne skal justeres således, emission spektrum indsamlet fra hver fluorophore ikke overlapper. At teste disse indstillinger, tage en prøve billede ved hjælp af excitation spektrum for normal god landbrugspraksis og indsamle i emission spektrum for mCherry og vice versa. Hvis indstillingerne er blevet justeret korrekt, bør der være noget signal i begge tilfælde. Angive indstillingerne mikroskop (dvs., spænding indstillinger på en laser scanning Konfokal, laser power og pinhole størrelse), så pixel intensitet af signalet i alle tre billede sæt er inden for det dynamiske område af billedfilen. For alle vores eksperimenter brugte vi en hvid lys laser scanning Konfokal mikroskop med en 40 x mål for at erhverve 16-bit billeder i 1.024 × 1.024 format, mens vi optimeret spændingsforstærkningen for hvert eksperiment efter behov. For eksempel, i et eksperiment, vi indstille spændingsforstærkningen for normal god landbrugspraksis, mCherry, og far-red som 37,8%, 72.9% og 260%, henholdsvis.
   1. Image ovarioles i nigericin dissektion buffer pH-værdi på 6,5 og justere indstillinger, sådan at pixel intensiteten af pHluorin og mCherry billederne er lav, men ikke under grænserne for påvisning af kameraet.
   2. Billede et andet sæt af ovarioles i nigericin dissektion buffer pH-værdi på 7,5 og justere indstillingerne, så pixel intensiteterne af billederne, pHluorin og mCherry er høj, men ikke mættede.
   3. Billede æggestokkene i bikarbonat dissektion buffer og sikre, at pixel intensiteten af pHluorin og mCherry billederne ikke er mættet med de valgte indstillinger. Hvis pixel er mættet, justere indstillingerne efter behov.
      Bemærk: Mikroskop indstillingsparametre kan variere baseret på nøjagtige mikroskop opsætningen bliver brugt, og skal være optimeret til hvert eksperiment. Når mikroskopet indstillinger har oprettet, ændrer ikke dem for resten af forsøget. Indstillingerne skal være konsistent på tværs af kontrol og forsøgsbetingelser. I vores indledende pHi eksperimenter, vi genereret 2 og 3 punkt nigericin kalibreringskurverne og fandt ingen signifikant forskel mellem beregnede pHi ved hjælp af enten metoden. Imidlertid i almindelighed, forventes tilføjelse af flere punkter i kalibreringskurven at forbedre nøjagtigheden. Vi anbefaler derfor, generere kurver med forskellige antal point til at bestemme, hvor mange der er behov for en given række forsøgsbetingelser.
3. Dataindsamling:
   1. udføre dissektion, montering, og imaging prøver under bikarbonat og nigericin buffer forhold. Efter dissektion og montering, den maksimale tid brugt imaging ét sæt prøver bør ikke overstige 45 min. for at sikre, at fluorescens intensitet målinger i live, sundt væv.
   2. For hver betingelse, erhverve billeder for mindst 5 germaria.

3. Efter retssagen: Billedanalyse

1. foranstaltning fluorescens intensiteter i FSCs, PFC'er, og hårsækken celler
   1. baggrund subtraktion:
      1. åbent ubehandlede billeder i FIJI med hver kanal i et separat vindue ( figur 4 c).
      2. Brug rektangelværktøjet til at tegne en region af interesse (ROI) i vinduet pHluorin kanal i en del af billedet uden signal.
      3. Valgfrit trin: angive den nedre grænse af tærsklen, så pixels med intensitetsværdierne under baggrund er udelukket og angive den øvre grænse på tærsklen til maksimum. Når tærsklen, der er angivet på denne måde, områderne i billedet uden signal er for det meste blå og signalet er tydeligt synlige ( figur 4A).
      4. Måler den gennemsnitlige fluorescens intensitet i ROI. Hvis tærsklen, der blev angivet i trin 3, Sørg for at tjekke den " grænse tærskel " i dialogboksen sæt målinger.
      5. Trækkes fra de målte baggrund intensitet fra hver kanal og udsnit af billedet ved hjælp af funktionen Subtraher, fundet i processen → Math menu.
      6. Gentag trin 3.1.1.2-6 for vinduet mCherry kanal bortset fra at, i trin 3.1.1.2, i stedet for at tegne en ny rektangel med rektangelværktøjet, skal du bruge funktionen Gendan udvalg, fundet i Rediger → valgmenuen, at tilføje et rektangel med det samme dimensioner og placering på billedet.
   2. Identificere FSCs, PFC'er og hårsækken celler:
      1. identificere FSCs, PFC'er og hårsækken celler af morfologi og placering ved hjælp af Concanavalin-A farvning for at finde cellegrænserne ( figur 2).
      2. FSCs er tynde trekantede celler beliggende på kanten af germarium ved Region 2a/2b grænse. Hvis mCherry::pHluorin er udtrykt i en FSC klon, FSC kan også identificeres som den forreste de fleste celle af klonen.
      3. PFC er uregelmæssig formet celler i regionen 2b, umiddelbart støder op til og neden for FSCs.
      4. Hårsækken celler er firkantede eller kolonneformat celler, der omgiver kønscelle cyste i Region 3.
   3. At opnå fluorescens intensitet nøgletal
      1. vælge en eller flere skiver hvor cellen i interesse har højeste fluorescens intensitet i mCherry kanalen og sørg for at Concanavalin-A farvning, set i den far-red kanal, er i foc os inden for det valgte udsnit.
      2. Tegner ROI omkring hver FSC og foranstaltning betyde fluorescens-intensiteten af pHluorin og mCherry i alle skiver valgte målinger.
      3. Opdele gennemsnitlige fluorescens intensiteten af pHluorin kanalen af gennemsnitlig fluorescens intensiteten af mCherry kanalen til at beregne et forhold på pHluorin at mCherry fluorescens.
2. Derive pHi værdier og generere pseudocolored billeder
   1. Derive pHi værdier
      1. i alle tilfælde, lineær regression kurven skal genereres ved hjælp af æggestokkene fra fluer af samme genotype for både eksperimentelle og styre betingelser. Generere en lineær regression kurve for hver celle ved hjælp af data fra to nigericin buffer betingelser ( figur 3). I Excel, kan dette gøres ved at plotte dataene på en graf og tilføje en lineær tendenslinje. Skiftevis, se:
      2. Brug hældningskoefficienten og y-skæringspunktet af lineær regression kurven beregnet ud fra nigericin betingelserne og ligningen for en linje (y = mx + b) til at konvertere pHluorin til mCherry ratio værdierne beregnet ud fra prøverne i bikarbonat tilstand til pH-værdier. I denne ligning, erstatte formen hældning (y-skæring) b, sætte ratio værdien i til x og løse for y.
   2. Generere en pseudocolored billede afspejler forholdet mellem værdierne i FIJI.
      1. Følg ovenstående fremgangsmåde for baggrunden subtraktion (trin 3.1.1 og figur 4).
      2. Dele pHluorin-kanalen fra mCherry kanal ved hjælp af funktionen Image regnemaskine, findes i menuen proces. Sørg for at " Opret nyt vindue " og " 32-bit (float) resultatet " afkrydsningsfelterne er begge to kontrollerede. Ændre opslagstabel (LUT), findes under menuen billede til termisk eller LUT valg. Se figur 4 andre egnede muligheder.
      3. i dialogboksen Juster lysstyrke og kontrast (billede → Juster → lysstyrke/kontrast), klik på den " angive " knappen. Sæt et Minimum vises værdien til 0 og maksimalt vises værdien til et forhold, der bedst indfanger data, normalt 1,0-2,0 ( figur 5).

Representative Results

Her har vi beskrevet processen med måling pHi i hårsækken epitel, der består af flere trin. Først, æggestokkene er dissekeret fra fluer af passende genotype ved hjælp af værktøjer til dissekere og montering (figur 1). Ovarioles er derefter afbildet ved hjælp af kvantitative Fluorescens mikroskopi og billederne er analyseret for at få målinger af pHi. For hvert billede, er celletyper af interesse identificeret som beskrevet i afsnit 3.1 (figur 2). Forholdet mellem fluorescens intensiteter i normal god landbrugspraksis og mCherry kanaler konverteres til pHi værdier ved hjælp af en standardkurve (figur 3A), som beskrevet i afsnit 3.2. Med denne metode, fandt at pHi stiger med differentiering i starten FSC afstamning, fra 6,8 i FSCs, 7.0 i prefollicle celler, til 7.3 i follicle celler (figur 3B). PHi værdierne i hver celletype kan gengives grafisk, som i figur 3B, eller som en pseudocolored Mikrograf der viser forskelle i pHluorin til mCherry nøgletal (figur 4 og figur 5). I disse billeder vises forskelle i pHluorin at mCherry nøgletal som forskelle i farve, som defineret af en LUT. Det er vigtigt at vælge en LUT og maximum og minimum værdier for rækken af farver til at producere et billede, der er mest repræsentative data. Selv om valget af LUT og område indstillinger ikke giver generelt udseendet af forskelle, der ikke findes i billedet, kan en mindre egnet valg af LUTs obskure pHi forskelle i Mikrograf (figur 5).

Figur 1: Materialer til dissektion og montering Drosophila ovarioles. (A) et billede viser: (1) neglelak; (2) vakuum fedt og bægerglas og afpipetteres tip bruge til anvendelse af fedt; (3) 23-gauge sprøjten nåle; (4) Dumont Inox pincet, størrelse 5; (5) 3D trykte montering kammer; (6) 22 x 40 mM glas coverslips; (7) runde glas Coverslips, diameter 12 mm, 0,13-0,16 mm tykkelse; og (8) 9-godt glas dissekere parabol. (B) en close-up billede af 3D trykte montering kammer. (C) et billede viser en dissekeret par vildtype æggestokke. (D) et billede viser vel adskilte ovarioles. (E) A billede af 3D salen med dissekeret æggestokkene monteret under en runde glas coverslip. De sorte prikker er dråber af neglelak, der bruges til at holde den runde coverslip på plads. (F) en afbildning af dissekerede ovarioles nedenunder en runde glas coverslip efter montering. Den sorte boks angiver et område af billedet med en enkelt dissekeret ovariole. Skala søjler repræsenterer cirka 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: identificerer FSCs, PFC'er og hårsækken celler. To eksempler på germaria med UAS-mCherry::pHluorin og 10930-Gal4 farves med Concanavilin-A. En ROI skitserer en FSC, en pFC og en follikel celle er vist i hvert billede. De gennemsnitlige fluorescens intensiteter i pHluorin og mCherry kanaler bruges til at beregne pHluorin til mCherry nøgletal. Skala søjler repræsenterer ca 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: pHi øger under differentiering i FSC slægt. Repræsentative resultater taget fra Ulmschneider et al. ² viser: (A) en typisk lineær regression kurven bruges til at beregne pH værdier fra pHluorin til mCherry nøgletal; og (B) den beregnede pHi værdier med 95% konfidensintervaller for FSCs, PFC'er og hårsækken celler. Dette tal er blevet tilpasset efter tilladelse fra Ulmschneider et al. ². venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: ved hjælp af FIJI til at generere en pseudocolored ratiometric billede. (A) billeder viser resultaterne af hvert trin i baggrunden subtraktion proces. Start med et uforarbejdet billede (venstre paneler), er det første skridt at angive tærskelværdierne for så at pixels med intensitetsværdierne under baggrund er udelukket. Den øvre grænse for tærsklen, der er indstillet til maksimal. FIJI vil farve de udelukkede pixels blå, hvilket resulterer i et billede med en blå baggrund og en tydelig germarium (midterste paneler). Bemærk, dette trin er valgfrit. Det andet skridt er at tegne en ROI i en del af billedet uden signal (røde firkanter i midterste paneler), foranstaltning betyde fluorescens-intensiteten af ROI og trække dette beløb fra hele billedet, hvilket resulterer i en baggrund trækkes billede (højre paneler). Det tredje skridt er at bruge beregning-funktionen til at opdele billedet i pHluorin kanalen af billedet i mCherry kanalen. Resultatet bliver et billede, vises med grå opslagstabel og billede display værdier angivet til span hele dynamiske område leveres af bitdybde på billedet. Det sidste trin er at justere indstillingerne billede display til en mere passende vifte og vælge en opslagstabel. (B) prøve billeder viser resultatet af et billede beregning med minimum vise værdien er angivet til 0 og den maksimale viste værdi sat til 2,5 ved hjælp af fire forskellige opslagstabeller. Rektangel ved siden af hvert billede viser de farver, der anvendes på tværs af det dynamiske område for hver opslagstabel. Bemærk at forskellige farver til HiLo, 16 farve, og termiske, der bruges til pixel med en intensitetsværdien 0 eller maksimum (f.eks.blå og rød, henholdsvis i HiLo). Dette giver en nem visuel reference over grænserne for det dynamiske område, giver beskueren til at se, at signalet er inden for det dynamiske område. (C) skærmbillede viser de valgte når du importerer en fil til ImageJ indstillinger ved hjælp af Bio-formater Import Plug-In. skala søjler repræsenterer 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Lass = "jove_content" fo:keep-together.within-side = "1" >
Figur 5: indstille billedet display værdier af pseudocolored ratiometric billeder. Minimum og maksimum billede display værdier skal indstilles, så signalet i billeder fra bikarbonat betingelse fra begge nigericin betingelser er inden for det dynamiske område. For at illustrere dette, to billeder fra hver af de tre betingelser er vist med fire forskellige billede display opsætning (0-0,5, 0-1, 0-2,5 og 0-5) ved hjælp af den termiske opslagstabel. Bemærk, at for alle tre forsøgsbetingelser, når billederne vises med den maksimale viste værdi sat til 0,5, meget af signalet er på eller i nærheden af maksimum på de kolorimetriske skala, og når den er indstillet til 5.0, meget af signalet er på eller i nærheden af minimum på farven imetric skala. I begge disse tilfælde blive ikke forskelle i pHluorin at mCherry forholdet på tværs af væv let værdsat så disse indstillinger ikke er ideel. Derimod er maksimale visningsværdier 1.0 eller 2.5 meget mere passende. Med disse indstillinger, forskelle i nøgletal på tværs af væv kan være let værdsat og signaler i billeder fra alle tre forsøgsbetingelser vises i farver, der er inden for det dynamiske område af de kolorimetriske skala. Skala søjler repræsenterer ca 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her, beskriver vi en metode til måling af pHi af celler i FSC afstamning i vildtype væv. Denne protokol er blevet udviklet og raffineret i de seneste fem år, siden vi først begyndte at studere pHi i Drosophila æggestokkene væv. I løbet af denne tid, har protokollen været anvendt med succes af flere efterforskere i vores laboratorium og på mindst fire forskellige spinning disc og laser scanning mikroskoper. Reproducerbarhed af vores oprindelige observation, at pHi stigninger som celler i FSC afstamning differentiere fra stamceller til pFC follikel celle staten, på tværs af disse flere forsøg viser begge, dette biologisk fænomen er robust, og at metoden er pålidelig. Imidlertid vores erfaring er dette en udfordrende procedure til master. Det kræver meget opmærksom på detaljer ved hvert skridt, og hurtig, meget dygtige udførelse af dissektion, montering, og imaging trin. Som anført i protokollen, proceduren dissektion og montering indeholder en 10 min inkubation men må ikke overstige 15 min samlede og den billeddiagnostiske procedure skal være afsluttet i 45 min. Under ideelle betingelser, Drosophila ovarioles kan opretholdes i kultur for op til 14 h¹⁷, men vi fandt, at væv begynder at dø meget hurtigere i nigericin buffere anvendes til at generere de standard kurver. Vores retningslinjer sikre, at alle data er indsamlet mens vævet er stadig godt inden for vindue af tid, at det ser sundt og morfologisk normale. Dette efterlader ikke meget tid til hvert enkelt trin, selv om, så det er vigtigt at planlægge for at sikre at alt er klar til at gå fra et trin til næste. Faktisk er det meget mere effektivt, hvis to mennesker arbejder sammen på dissektion, montering, og imaging procedurer, med én person udfører et skridt mens anden personen forbereder næste trin.

Da pHi kan være følsomme over for de eksperimentelle manipulationer kræves til at afbilde væv ex vivo, såsom temperatur og buffer sammensætning, er denne metode bedst at identificere relative ændringer i pHi. I betragtning af at sonden består af to forskellige fluorescerende proteiner, deres fluorescens-egenskaber som kvanteudbytte, levetid, og folde egenskaber kan blive påvirket forskelligt i forskellige celletyper. Derfor er det vigtigt at medtage prøver behandlet med nigericin buffer betingelser og bruge dem til at generere en ny kalibreringskurve for hver celle i hvert forsøg. For at minimere yderligere kilder til variation, er at holde alle betingelser konsekvent i løbet af imaging understreget. Prøver i nigericin buffer betingelser bør forberedes og afbildet på samme dag som dem i bikarbonat buffer betingelsen og forberedelse og image erhvervelse af alle prøver skal holdes så konsekvent som muligt. Dette er vigtigt fordi pHi målinger er baseret på en sammenligning mellem billede sæt, så eksperimenterende forskelle, der påvirker påvisning af mCherry og pHluorin i en eller flere af de billede sæt kan reducere nøjagtigheden af pHi skøn. Faktorer som ændringer i spænding indstillinger af photomultiplier rør (hvis du bruger en laser scanning Konfokal) eller eksponeringstider (hvis du bruger en roterende disk Konfokal) eller et snavset linse, der reducerer mængden af lyset nå kameraet, vil klart påvirke resultaterne . Men der er et utal af andre mere subtile faktorer, der kan variere fra den daglige og kan også påvirke resultaterne, som hvis fluerne velnærede, er alder af fluer, og hvor længe laserne har været på før billeddannelse. Forberede og imaging alle tre betingelser på samme dag minimerer disse forskelle og vil derfor producere de mest ensartede resultater. Navnlig, hver gang vi skiftede til en ny mikroskop eller komponenter af mikroskopet blev opgraderet, var det nødvendigt at reoptimize indstillinger på det nye udstyr. Dette resulteret ofte i en ændring af gennemsnitsværdierne for de enkelte målinger, men så længe nye kalibreringskurverne blev genereret med hvert forsøg, ændringer i udstyr havde en minimal indvirkning på pHi skøn. Derudover er relevant sammenligningen ofte mellem forskellige celletyper, der er inden for det samme væv (f.eks.FSCs, PFC'er og hårsækken celler) og dermed er internt kontrolleret for experimental variationer.

Selv om denne protokol har fokuseret på måling pHi vildtype væv, er metoden, der kompatibel med standard Drosophila metoder til at manipulere genekspression, som udtryk for RNAi eller en transgenet ved hjælp af UAS/Gal4 og mosaik analyse. Da mCherry::pHluorin er drevet af en UAS promotor, vil det altid være co udtrykt med RNAi eller transgen, og MARCM¹⁸ kan bruges til at generere homozygot mutant kloner med mCherry::pHluorin som den klonal markør. Af de grunde, der er beskrevet ovenfor, bør vildtype væv analyseres som et kontrolelement sammen med hver prøveversion med en mutant genotype. Endelig, de generelle principper beskrives her kan anvendes på brugen af mCherry::pHluorin til at måle pHi i andre væv. Denne protokol blev tilpasset fra en protokol for at bruge mCherry::pHluorin til at måle pHi i Drosophila øje⁷, og vi har brugt lignende metode til at afbilde mCherry::pHluorin i hjernen, larver. Generelt, de værktøjer og metoder, der beskrives her giver nye muligheder for at undersøge de mange forskellige funktioner i pHi i vivo inden for levende, intakt væv.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO	Bloomington Stock Center	7023
Act-Gal4 flipout stock	Bloomington Stock Center	4409
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
KCl	Sigma Aldrich	P-3911
glucose	Mallinckrodt	4912
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310
MgSO4	Thermo Fisher Scientific	M63
CaCl2	Sigma Aldrich	C-5080
HCO3	Sigma Aldrich	S-5761
MgCl2	Sigma Aldrich	M-9272
NMDG+	Sigma Aldrich	M-2004
K2HPO4	Mallinckrodt	7088	Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362	Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	C21421	0.25 mg/ml dilution
Nigericin	Thermo Fisher Scientific	N1495
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5)	Thermo Fisher Scientific	NC9473431
2 23-gauge syringe needles	Sigma Aldrich	Z192457
9-well glass dissecting dish	Thermo Fisher Scientific	13-748B
Vacuum Grease	Dow Corning	1018817
22 X 40 mM glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness	Ted Pella, Inc.	26023
3-D mounting chamber	custom manufactured		.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other equipment
pH meter	Thermo Fisher Scientific	13-620-183A	Model: Accumet AB15
Dissection microscope	Olympus Corporation	0H11436	Model: SZ2-ST
Confocal Microscope	Leica Biosystems		SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3