Summary

Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe

Published: September 26, 2017
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Summary

Wir bieten ein Protokoll für imaging intrazelluläre pH-Wert von einer epithelialen Stammzellen Abstammung in live Drosophila Ovargewebe. Wir beschreiben Methoden, um transgene fliegen mit dem Ausdruck einer pH-Wert-Biosensor, mCherry::pHluorin, Bild der Biosensor mit quantitativen Fluoreszenz-Bildgebung zu generieren, generieren Standardkurven und pH-Werte Fluoreszenz Intensitätswerte umwandeln.

Abstract

Änderungen im intrazellulären pH (pHi) spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der viele zelluläre Funktionen, einschließlich Stoffwechsel, Proliferation und Differenzierung. In der Regel sind pHi Dynamik in kultivierten Zellen bestimmt, die Mess- und experimentell manipuliert pHi zugänglich sind. Allerdings machte es die jüngste Entwicklung von neuen Instrumenten und Methoden möglich, pHi Dynamiken intakt, live Gewebe zu studieren. Für die Drosophila -Forschung, eine wichtige Entwicklung war die Erzeugung einer transgenen Linie tragen eines Biosensors pHi mCherry::pHluorin. Hier beschreiben wir eine Protokoll, mit denen wir routinemäßig für bildgebende live Drosophila Ovariolen pHi in der epithelialen Follikel Stammzellen (FSC) Linie in mCherry::pHluorin transgenen Wildtyp-Linien zu messen; die hier beschriebenen Methoden kann jedoch für andere Gewebe, einschließlich der Flügel Scheiben und Auge Epithel leicht angepasst. Wir beschreiben Techniken für den Ausdruck von mCherry::pHluorin in der FSC-Linie die Aufrechterhaltung Eierstockgewebe während live imaging und Erwerb und Analyse von Bildern um pHi Werte zu erhalten.

Introduction

Neuere Studien gezeigt eine Rolle für Änderungen in pHi während zelluläre Differenzierung und Dysplasie in Vivo1,2. Diese Studien herausgefunden, dass pHi bemerkenswert konsistent in den Zellen des gleichen Typs auf der gleichen Stufe der Differenzierung, ist aber, dass es ändert als Übergang von einer Stufe zur anderen Zellen. In einigen Fällen stört die Änderungen in pHi teilweise Sperrung Differenzierung, was darauf hindeutet, dass die Veränderung der pHi nicht nur eine Folge von Veränderungen der Zelle Schicksal ist aber stattdessen hilft, die Veränderung der Zelle Schicksal, vielleicht durch Einfluß auf pH-Sensitive regulatorischen zu fördern Proteine oder chemische Reaktionen zur Differenzierung erforderlich. Zukünftige Studien haben das Potenzial, einen tieferen Einblick in die vielen verschiedenen Rollen der pHi Dynamik in Vivozu offenbaren. Jedoch ist eine der Herausforderungen des Studiums pHi während der Differenzierung in Vivo genaue Messungen der pHi erhalten. Im Gegensatz zu anderen Funktionen der Differenzierung, wie Veränderungen in der zellulären Morphologie und Genexpression ist pHi eine labile chemische Eigenschaft der Zelle, die nicht in den Zellen, die wurden behoben, und permeabilized mit Standardmethoden bewahrt wird. Darüber hinaus möglicherweise pHi nicht stabil in Zellen, die gestresst sind oder sterben durch experimentelle Manipulation. Daher ist es wichtig, die Zellen lebendig und so gesund wie möglich zu halten, bei der Messung von pHi. Mehrere wichtige Farbstoffe zur Verfügung, die funktionieren gut für Messung der pHi der Zellen in Kultur3, aber in vielen Fällen sie eignen sich nicht für in Vivo Studien, weil sie das Gewebe nicht tief oder gleichmäßig eindringen, genaue Messungen zu machen .

Um das Problem der schlechten Farbstoff Penetration zu umgehen, haben wir u.a. eine genetisch codierte Sonde, mCherry::pHluorin4,5,6,7, verwendet, die speziell in der Zelle ausgedrückt werden kann Arten von Interesse und abgebildeten in lebender Gewebe. pHluorin ist eine Variante der GFP mit einer höheren pKa (~ 7,0 vs. ~ 4.0), die Falten leichter bei höheren pH-Werten; so steigt der gesamten Fluoreszenzintensität emittiert bei einer Bevölkerung von pHluorin Moleküle in der Zelle mit zunehmender pHi8. Fluoreszenz ist linear innerhalb der normalen cytosolischen Wertebereich pHi. Im Gegensatz dazu die Fluoreszenz des mCherry (pKa ~ 4.5) ist unempfindlich gegen pH-Veränderungen innerhalb der cytosolischen. Diese zwei Reporter sind kovalent miteinander als ein chimäres Protein, durch einen einzigen offenen Leserahmen codiert, so dass sie immer in gleichen Mengen vorhanden sind. Daher stellt das Verhältnis von pHluorin zu mCherry Fluoreszenzintensität eine Messung des pHi, die auf die Sonde Konzentration in jeder Zelle normalisiert ist. Die Verhältnisse können dann Schätzungen von pHi-Werten mit einer Standardkurve, die generiert wird, durch den Erwerb der pHluorin mCherry-Verhältnisse von Geweben, die auf bekannten pH-Werte equilibriert wurde umgewandelt werden.

Hier beschreiben wir die Methoden für die Verwendung von mCherry::pHluorin, um die pHi der epithelialen FSC-Linie im Drosophila Eierstock zu messen. Dieses gut charakterisierten Gewebe wurde verwendet, um viele verschiedene Aspekte der epithelialen Biologie, wie z. B. Stammzell-Selbsterneuerung und Differenzierung9,10,11, kollektive Zellmigration12 Modell , Entwicklung und Wartung von Zelle Polarität13,14. Die Follikel Epithel wird durch zwei FSCs produziert, die am vorderen Rand des Gewebes in einer Struktur namens Germarium15,16befinden. Diese Zellen teilen sich regelmäßig im Erwachsenenalter selbst zu erneuern und produzieren nachkommen, genannt prefollicle Zellen (PFC), die entweder geben Sie die Nische und ein FSC werden oder in eine der drei verschiedenen Follikel Zelltypen differenzieren: polare Zellen, Stiel Zellen oder Hauptkörper Follikelzellen. Wir zeigten, dass zuvor in Wildtyp-Gewebe, die pHi steigt stetig in den frühen Phasen der Differenzierung von pHi von ca. 6,8 in FSCs 7.0 im PFC, auf 7,3 im Follikel Zellen2. Blockieren diese Erhöhung durch RNAi Knockdown von ein ubiquitär ausgedrückt Natrium/Proton-Wärmetauscher, DNhe2, stark beeinträchtigt pFC Differenzierung, während pHi steigt durch Überexpression des DNhe2 bewirkt eine milde überschüssige Differenzierung Phänotyp. Diese Ergebnisse belegen, dass pHi bleibt stabil in der frühen FSC-Linie, dass es experimentell kann erhöht oder verringert in Vivo. Die hier beschriebenen Methoden können verwendet werden, um pHi in Wildtyp-Gewebe oder verschiedene Formen der mutierte Gewebe, einschließlich der RNAi-Zuschlag oder Überexpression mit einer Gal4 von Interesse und mitotischen Klone zu messen.

Protocol

Hinweis: um pHi in der FSC-Linie messen, wir berechnen Sie das Verhältnis der Fluoreszenz-Intensität von pHluorin auf mCherry in FSCs, PFC und Follikelzellen unter physiologischen Bedingungen, und konvertieren Sie die Verhältnisse in pHi-Werte mit Standard Kalibrierkurven für jede Zelle Typ 7. Zur Messung der Fluoreszenz-Intensität von pHluorin und mCherry in Germaria in einem Puffer mit Nahco3 3, die physiologischen Bedingungen 1 , imitiert ze…

Representative Results

Hier haben wir den Prozess der Messung pHi in die Follikel Epithel, beinhaltet mehrere Schritte beschrieben. Erstens werden die Eierstöcke von fliegen von der entsprechenden Genotyp mit Tools zum sezieren und Montage (Abbildung 1) indiziert. Die Ovariolen sind dann abgebildet mit quantitativen Fluoreszenzmikroskopie und die Bilder werden analysiert, um Messungen der pHi zu erhalten. Für jedes Bild werden die Zelltypen von Interesse identifiziert, wie beschr…

Discussion

Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung der pHi der Zellen in der FSC-Linie in Wildtyp-Gewebe. Dieses Protokoll wurde entwickelt und verfeinert in den vergangenen fünf Jahren seit Beginn der pHi in Drosophila Eierstockgewebe zu studieren. Während dieser Zeit wird das Protokoll durch mehrere Untersucher in unserem Labor und auf mindestens vier verschiedenen Spinning Disc und Laser-scanning-Mikroskope erfolgreich eingesetzt. Die Reproduzierbarkeit unserer ursprünglichen Beobachtung, dass pHi erhöht wie Z…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Bryne Ulmschneider für Beiträge zum Protokoll und Diane Barber für Anregungen zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch eine National Institute of Health Grant GM116384 T.G. Nystul und d.l. Barber finanziert.

Materials

Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO Bloomington Stock Center 7023
Act-Gal4 flipout stock Bloomington Stock Center 4409
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl Sigma Aldrich S5886
KCl Sigma Aldrich P-3911
glucose Mallinckrodt 4912
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310
MgSO4 Thermo Fisher Scientific M63
CaCl2 Sigma Aldrich C-5080
HCO3 Sigma Aldrich S-5761
MgCl2 Sigma Aldrich M-9272
NMDG+ Sigma Aldrich M-2004
K2HPO4 Mallinckrodt 7088 Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4 Thermo Fisher Scientific BP362 Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate Thermo Fisher Scientific C21421 0.25 mg/ml dilution
Nigericin Thermo Fisher Scientific N1495
Name Company Catalog Number Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5) Thermo Fisher Scientific NC9473431
2 23-gauge syringe needles Sigma Aldrich Z192457
9-well glass dissecting dish Thermo Fisher Scientific 13-748B
Vacuum Grease Dow Corning 1018817
22 X 40 mM glass coverslips Thermo Fisher Scientific 12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness Ted Pella, Inc. 26023
3-D mounting chamber custom manufactured .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name Company Catalog Number Comments
Other equipment
pH meter Thermo Fisher Scientific 13-620-183A Model: Accumet AB15
Dissection microscope Olympus Corporation 0H11436 Model: SZ2-ST
Confocal Microscope Leica Biosystems SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3

References

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Cite This Article
Tatapudy, S., Benitez, M., Nystul, T. Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue. J. Vis. Exp. (127), e56316, doi:10.3791/56316 (2017).

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