Summary
우리는 살아있는 초파리 난소 조직에는 상피 줄기 세포 계보의 세포내 pH를 이미징에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 유전자 변형 파리 양적 형광 이미징 사용 하 여 바이오 센서는 pH 바이오 센서, mCherry::pHluorin, 이미지를 표현 생성 하 고 표준 곡선, 생성 한 형광 강도 값을 pH 값으로 변환 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
세포내 pH (피)에 변화 많은 세포 기능, 대사, 확산, 차별화 등의 규칙에 중요 한 역할을 재생 합니다. 일반적으로, 피 역학 순종 측정 하 고 실험적으로 피를 조작 하는 경작된 한 세포에 결정 됩니다. 그러나, 새로운 도구와 방법론의 최근 개발 그대로, 살아있는 조직 내에서 피 역학 공부를 가능 하 게 했다. 초파리 연구를 위한 하나의 중요 한 발전은 들고 피 바이오 센서는 유전자 변형 라인의 세대 mCherry::pHluorin. 여기, 우리는 우리가 일상적으로 사용 하 여 이미징 라이브 초파리 ovarioles에 대 한 mCherry::pHluorin 유전자 변형 야생 타입 라인;의 상피 뿌리 줄기 세포 (FSC) 혈통에 피를 측정 하는 프로토콜 설명 그러나, 여기에 설명 된 방법을 날개 디스크와 눈 상피를 포함 하 여 다른 조직에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리는 라이브 이미징, 및 취득 및 피 값을 가져올 이미지를 분석 하는 동안 난소 조직을 유지 하 FSC 혈통에 mCherry::pHluorin를 표현 하기 위한 기법을 설명 합니다.
Introduction
최근 연구 결과 세포 감 별 법 그리고 발육 이상 vivo에서1,중2피에 변화에 대 한 역할을 밝혔다. 이러한 연구 발견 그 피는 차별화의 동일한 단계에서 동일한 유형의 세포에서 현저 하 게 일관 하지만 과도 한 단계에서 다른 셀으로 변경. 경우에 따라 차별화, 피에 변화 세포 운명에 변화의 결과 그냥 아니다 하지만 대신 세포 운명, pH에 민감한 규제에 영향을 통해 변화를 촉진 하는 데 도움이 방해 피에서 변화를 부분적으로 차단 단백질 또는 차별화에 필요한 화학 반응입니다. 미래 연구 피 역학에서 vivo에서의 여러 가지 역할에 더 많은 통찰력을 가능성이 있다. 그러나, 피의 정확한 측정을 얻는 이다 vivo에서 분화 하는 동안 피를 공부 하는 과제 중 하나. 분화, 세포 형태학 및 유전자 발현에 변화 등의 다른 기능과 달리 피는 고정 되어 있고 표준 방법으로 permeabilized 셀에 유지 되지 않고 셀의 정한 화학 재산입니다. 또한, 강조 하는 셀에 안정 또는 실험적인 조작으로 인해 죽어가는 피 않을 수 있습니다. 따라서, 피를 측정할 때 살아 있고 가능한 건강 한 세포를 유지 하는 것이 중요 하다. 몇 가지 중요 한 염료는 vivo에서 깊이 또는 균등 하 게 조직 침투 하지 않습니다 그들은 때문에 공부에 대 한 그들이 경우 셀 문화3, 그러나 많은 피 측정을 위해 잘 작동 적합 하지 않습니다 사용할 수 있는 정확한 측정을 제공 하기 위해 .
우회 가난한 염료 침투의 문제, 우리와 다른 사용 유전자 인코딩된 프로브, mCherry::pHluorin4,5,,67, 특히 셀에에서 표현할 수 있는 관심과 살아있는 조직에 몇 군데의 종류입니다. pHluorin는 높은 pKa와 GFP의 변종 (~ 대 7.0 ~ 4.0)을 더 쉽게 더 높은 pH;에 주름 그래서 셀에 pHluorin 분자의 인구에서 방출 된 총 형광 강도 피8증가 함께 증가 합니다. 중요 한 것은, 형광은 정상 범위 내에 cytosolic 피 값의 선형. 반면, mCherry의 형광 (pKa ~ 4.5) cytosolic 범위 내에서 pH 변화에 민감 하지 않습니다. 이 두 기자 covalently 함께 그래서 그들은 항상 동일한 금액에 존재 한 열려있는 독서 프레임으로 인코딩된 단일 공상 단백질으로 연결 됩니다. 따라서, mCherry 형광 강도 pHluorin의 비율 피 각 셀에 프로브 농도를 정상화 하는 측정을 제공 합니다. 비율 다음 알려진된 pH 값에 equilibrated 조직에서 mCherry 비율에는 pHluorin를 취득 하 여 생성 되는 표준 곡선을 사용 하 여 피 값의 견적을 변환할 수 있습니다.
여기, 우리 mCherry::pHluorin를 사용 하 여 초파리 난소의 상피 FSC 혈통의 피를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 특징이 잘 조직 상피 생물학, 줄기 세포 자체 갱신 및 차별화9,10,11, 집단 셀 마이그레이션12 등의 다양 한 측면을 모델링 하는 데 사용 되었습니다. , 개발 및 세포 극성13,14의 유지 보수. 여 포 상피 조직의 앞쪽 가장자리에 germarium15,16라고 하는 구조에 있는 2 개의 FSCs에 의해 생산 됩니다. Prefollicle 셀 (pFCs), 다시 틈새를 입력 하 고는 FSC 될 하거나 세 다른 여 포 세포 유형 중 하나에 차별화 라는 자손을 생산 하 고 자기 갱신 성인 기 동안 정기적으로 이러한 세포 분열: 극 지 세포, 줄기 세포, 또는 본체 여 포 세포입니다. 우리 보여주었다 이전 wildtype 조직에는 피 차별화, pFCs에서 7.0 FSCs에 약 6.8의 피에서 여 포 세포27.3에의 초기 단계 동안 꾸준히 증가. 심각 하 게 손상 pFC 차별화 편 표현된 나트륨/양성자 교환기, DNhe2의 RNAi 최저에 의해이 증가 차단, DNhe2 의 overexpression에 의해 피를 증가 하는 반면 약한 과도 차별화 하면 표현 형입니다. 이러한 결과 피 초기 FSC 혈통에 안정적으로 유지 되 고 실험적으로 될 수 있는 증가 또는 vivo에서감소를 보여 줍니다. 여기에 설명 된 방법은 wildtype 조직 또는 돌연변이 조직, RNAi 최저 또는 overexpression Gal4 관심과 mitotic 클론을 사용 하 여를 포함 하 여 다양 한 형태의 피 측정을 사용할 수 있습니다.
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Protocol
참고: FSC 혈통에 피 측정, 하 우리는 FSCs, pFCs, 및 생리 적 조건에 여 포 세포에서 mCherry에 pHluorin의 형광 강렬의 비율을 계산 하 고 표준 피 값으로 비율을 변환 각 셀에 대 한 교정 곡선 7을 입력합니다. 첫째, 라이브 이미징 실험 pHluorin 및 germaria NaHCO 3, 생리 적 조건 1 , 모방을 포함 하는 버퍼에 해 부에 mCherry의 형광 강도 측정 하기 위해 수행 됩니다. 7. 다음, 표준 곡선에서 Na + pHluorin 및 mCherry 형광 강도 측정 하 여 생성 됩니다-무료, ionophore nigericin를 포함 하는 K + 버퍼 조정 두 가지 다른 pH 값, 6.5와 7.5. Nigericin, 면 전에 서 피는 extracellular pH에 맞게 피를 일으키는 플라즈마 막에 걸쳐 버퍼의 ph equilibrates. 마지막으로, 표준 곡선 pHluorin mCherry 비율 추정된 피 값을 변환 하는 데 사용 됩니다.
1. 사전 평가: 준비 하기 전에 측정 피에 비보
참고: vivo에서 피 측정, mCherry::pHluorin transgene 셀 종류 관심의 표현 해야 합니다. 아래에 유전자 변형 pHluorin를 생성 하는 몇 가지 일반적인 방법을 날아 FSC 혈통에 있다. MCherry::pHluorin 클론을 생성 하는 것은 특히 FSCs는 FSC 클론의 앞쪽 가장자리에 있는 식별 하는 데 유용 합니다. 조직 특정 mCherry::pHluorin는 전체 조직에 걸쳐 피를 측정 하는 데 유용 표현과 RNAi 또는 transgene의 식과 결합 시킬 때 더 편리한 이기도.
- 유전자 변형 pHluorin의 파리
- mCherry::pHluorin 표시 된 FSC
- 클론
- mCherry::pHluorin FSC 클론을 만들기 위해 주식 또는 기타 행위 Gal4 flipout UAS-mCherry::pHluorin 1 크로스 Flp/FRT 유도할 수 있는 Gal4와 재고.
- 유도할 수 있는 클론, heatshock을 heatshock 2 일 성인 F1s 게시물 일수로 37 ° C 물 목욕, 4 번 12 헤에 약 1 시간에 대 한 빈 병에
- 신선한 젖은 누 룩을 제공 하 여 파리가이 기간 동안 정상적인 성장과 oogenesis의 최대 속도 보장 하기 위해 유지 (대략 동등한 부품 건조 베이커 ' s 효 모 및 물) 복제 유도 후 적어도 6 일 동안 매일.
- 조직 특정 mCherry::pHluorin 식
- UAS-mCherry::pHluorin 1를 교차 하는 여 포 세포 특정 드라이버, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (블루밍턴 ID: 7023).
- 3 일 파리 eclosing, 시작 후 수집 하 고 젖은 효 모, 해 부 하기 전에 적어도 24 h에 대 한 포함 된 튜브에 넣어.
- 솔루션 만들기
참고: 버퍼에서 pH와 용액 농도 시간이 지남에 따라 변경 될 수 있으므로 실험 당일 다음 버퍼를 준비 하는 것이 중요 하다. - 준비 중 탄산염, nigericin, 및 해 부 버퍼
- . 침전 (표 1, 표 2 및 표 3 참조)의 형성을 방지 하려면 나열 된 순서 대로 구성 요소 추가.
2. 시험: FSC 혈통에 피를 측정 하는
참고: 해 부, 장착, 그리고 라이브 이미징 단계 중 탄산염 버퍼와 두 개의 nigericin 버퍼 조건에 대 한 두 번 수행 해야 할 수도 있습니다: 현미경 결정을 한 때 설정 및 실험 데이터를 수집 두 번째 시간입니다. 2.2 아래의 자세한 내용은 섹션을 참조 하십시오.
- 절 개 및 장착
참고:이 단계를 수행 하는 데 필요한 자료 그림 1과 테이블의 자료를 참조 하십시오. 3D 인쇄 장착 챔버, 3D 프린터 파일 추가 파일 1과 파일 2 보충으로 제공 됩니다.- 해 부:
- 3D의 편평한 측을 진공 그리스의 얇은 코팅을 적용 하 여 준비 장착 챔버 장착 챔버 인쇄. 22 x 40mm coverslip 장착 챔버에 coverslip 인감에 그 측을 두십시오.
- 500 µ L 해 부 버퍼 (중 탄산염 또는 nigericin 버퍼, 표 3)에서 여성 성인 파리에서 난소 부
- CO 2 가스를 사용 하 여 3-4 파리 Anesthetize를 전송 ㈜ 끼얹는다 플라이 패드에 2 가스.
- 집게와 해 부 미디어로 장소는 마 취 비행 데리.
- 의 난소 노출 되는 때까지 그것의 복 부의 끝에 잡아 당 겼는 동안 하나의 forcep으로 파리의 흉부를 꼬집어.
- 다른 장기에서 난소를 분리 후 애타게 떨어져 22 1/2 주사기 바늘을 사용 하 여 ovarioles. 신중 하 게 별도 근육에서 난소와 ovarioles의 클러스터에서 별도 개별 ovarioles 칼 집. Ovarioles 클러스터의 앞쪽 끝에 장소에서 그리고 단일 ovarioles의 길이 따라 아래쪽으로 치기 한 주사기 바늘을 사용 하는 근육 덮개를 분리 하는 효과적인 기술.
- 완전히 nigericin 해 부 미디어의 ph equilibrate 셀의 피에 대 한 충분 한 시간이 되도록 설치 단계를 진행 하기 전에 정확히 10 분에 대 한 해 부 미디어에서 해 부 난소를 품 어.
주: 근육 덮개는 ovarioles에서 제거 됩니다 확인 하십시오. 근육 칼 집 하기가 어렵습니다 사용 하 여 개별 셀을 식별 하는 형광 신호를 약하게 수 있습니다 Concanavilin-A, ovarioles 라이브 이미징 동안 자발적으로 이동 될 수 있습니다.
- 장착
- 챔버 내부에 장착 해 부 미디어 유리 coverslip에의 작은 방울을 배치.
- 전송 분리 집게를 사용 하 여 ovarioles.
- 이전 단계 계란 챔버와 연결 된 germaria에서 나중 단계 계란 챔버를 분리 하 고 해 부 germaria 해 부 미디어 드롭의 중심에 배치 됩니다 시도.
- 라운드 12 mm coverslip의 반대편에 매니큐어의 두 개의 작은 방울을 추가 하 고 그것은 약 10 건조 한 공기 보자 s. 에 포함 된 해 부 미디어 드롭
- 장소 라운드 coverslip germaria 분리 같은 매니큐어와 측면 직면 하 고 해 부 미디어 연락처. 평평 하 고 안전한 위치에 germaria를 매니큐어와 가장자리의 부분에 아래로 누릅니다. 그것은 얼룩는 coverslip의 표면으로 그것은 장소에 확보 되 고 더 적은 때문에 오래 된 매니큐어를 사용 하는 것이 좋습니다.
- 추가 해 부 미디어 장착 챔버를 입력합니다. 챔버를 채우기 위해 Concanavalin A 염료를 포함 하지 않는 조건 특정 버퍼를 사용할 수 있습니다.
참고: 총 시간 동안 해 부 고 장착 15 분을 초과 하지 않아야 합니다. 이것은 조직 손상의 영향을 최소화 하는 것이 중요 세포 죽음.
- 해 부:
- 라이브 이미징:
참고:이 단계에서 먼저 중 탄산염 조건과 적절 한 현미경 설정을 결정 하기 위해 두 개의 nigericin 조건에서 이미지를 수집, 현미경 설정을 필요에 따라 조정 그리고 실험 데이터에 대 한 이미지를 수집 합니다. 3 채널에서 confocal 현미경 이미징의 능력을 사용 하 여: GFP (475 여기/509 방출), mCherry (575 여기/610 방출), 및 빨강 (633 여기/647 방출).
참고: 설정된 현미경 설정: 수집 하는 이미지의 픽셀 농도 각 이미지 세트에서 신호 강도 값이 너무 낮은 것도 포화 중요 하다 그래서 피의 견적을 확인 하 정해질 것입니다. 이미지에서 캡처할 수 수 농도의 범위는 이미지 비트 깊이 의해 정의 됩니다. 대부분의 경우, 8 비트 이미지는 기본적으로 생성 된 하지만 더 넓은 동적 범위는 16-비트 이미지 데이터를 취득 하는 것이 좋습니다. 그것은 형광 채널간 크로스 토크를 최소화, 설정을 방출 스펙트럼 수집에서 조정 한다 그래서 각 fluorophore 겹치지 않도록 보장 해야 합니다. 이러한 설정을 테스트 하려면 GFP에 대 한 여기 스펙트럼을 사용 하 여 샘플 이미지와 mCherry와 반대로 방출 스펙트럼에서 수집 합니다. 경우에 설정을 제대로 조정 되었습니다, 어느 경우에 신호 있어야 합니다 합니다. 이미지 파일의 동적 범위 내에 있는 모든 3 개의 이미지 세트에 신호의 픽셀 농도 현미경 설정 (즉, confocal 레이저 스캐닝 전압 설정, 레이저 파워 및 작은 구멍 크기)를 설정 합니다. 우리의 모든 실험 40 x 목적으로 confocal 현미경 검사는 백색 빛 레이저 필요에 따라 우리는 모든 실험에 대 한 전압 이득을 최적화 하는 동안 1024 × 1024 형식, 16-비트 이미지를 얻으려고 사용 했습니다. 예를 들어 한 실험에서 우리는 GFP, mCherry, 전압 이득 설정 및 빨강 37.8%, 72.9%, 및 260%, 각각.- Nigericin 해 부 버퍼 pH 6.5에서에서 ovarioles 이미지 하 고는 pHluorin와 mCherry 이미지의 픽셀 농도 낮은, 하지만 카메라의 검출 한계 아래의 설정을 조정.
- PH 7.5에 nigericin 해 부 버퍼에서 ovarioles의 다른 세트를 이미지 하 고 pHluorin 및 mCherry 이미지의 픽셀 농도 높은, 하지만 하지 포화 되도록 설정을 조정.
- 이미지 난소 중 탄산염 해 부를 버퍼링 하 고 pHluorin 및 mCherry 이미지의 픽셀 농도 선택한 설정으로 포화 되지 확인 하십시오. 픽셀이 포화 되는 경우 필요에 따라 설정을 조정.
참고: 현미경 설정 매개 변수는 다를 수 있습니다 사용 되 고, 정확한 현미경 설치에 따라 그리고 각 실험에 대 한 최적화 해야 합니다. 현미경 후 설정 설정, 실험의 나머지를 위해 그들을 변경 하지 마십시오. 설정 제어 및 실험 조건에서 일관 되어야 합니다. 우리의 초기 피 실험에서 2, 3 포인트 nigericin 교정 곡선을 생성 하 고 메서드 중 하나를 사용 하 여 계산 된 피 사이의 큰 차이 발견. 그러나, 일반적으로, 보정 곡선에 더 많은 포인트의 추가 정확도 향상 시킬 예정 이라고. 따라서, 얼마나 많은 실험 조건의 주어진된 세트에 필요한 결정 하는 포인트의 서로 다른 숫자와 커브를 생성 좋습니다.
- 데이터 수집:
- 해 부, 장착, 그리고 중 탄산염 및 nigericin 버퍼 조건에서 샘플의 이미지를 수행. 해 부 및 장착, 최대 시간 보낸 후 샘플 한 세트를 이미징 초과할 수 없는 형광 강도 측정, 건강 한 조직에서 만들어진다 되도록 45 분.
- 각 조건에 대해 적어도 5 germaria에 대 한 이미지를 수집.
3. -재판: 이미지 분석
- FSCs, pFCs, 및 여 포 세포에서 형광 강도 측정
- 배경 빼기:
- 오픈 처리 되지 않은 각 채널을 별도 창 (피지에서 이미지 그림 4C).
- 관심 (ROI) 영역을 그리려면 사각형 도구를 사용 하 여 신호 없이 이미지의 부분에서 pHluorin 채널 창에서.
- 옵션 단계: 배경 아래 강도 값과 함께 픽셀은 제외 하 고 최대 임계값의 상한값을 설정 임계값의 하한값을 설정. 임계값 설정 하면이 방식으로, 신호 없이 이미지의 분야는 주로 파란색 이며 신호가 명확 하 게 보이는 ( 그림 4A).
- 투자 수익의 말은 형광 강도 측정합니다. 3 단계에서 임계값을 설정 하는 경우를 체크 해야는 " 임계값 제한 " 측정 설정 대화 상자에서 상자.
- 각 채널 및 빼기 기능, 과정에서 발견을 사용 하 여 이미지의 조각에서 측정 된 배경 강도 빼기 → 수학 메뉴.
- 반복 단계 3.1.1.2-6 단계 3.1.1.2에서,를 제외 하 고 mCherry 채널 창에 대 한 사각형 도구로 새로운 사각형 그리기 대신 복원 선택 함수 사용 하 여, 편집에 →와 같은 사각형을 추가 하려면 선택 메뉴 크기와 이미지에 위치.
- 식별 FSCs, pFCs, 및 여 포 세포:
- FSCs, pFCs, 여 포 세포 형태학 및 위치 Concanavalin A 얼룩 사용 하 여 셀 경계 ( 그림 2)를 찾을 수 파악.
- FSCs 얇은 삼각형 셀 영역 2a/2b 국경에 germarium의 가장자리에 위치 하 고 있습니다. MCherry::pHluorin는 FSC에서에서 표현 하는 경우 금감위는 클론의 앞쪽 대부분 셀으로 식별할 수도 있습니다.
- pFCs는 불규칙 한 모양의 셀 영역 2b, 즉시 인접 하 고 다운스트림 FSCs.
- 여 포 세포는 지역 3에서 생식 세포 낭종을 둘러싸고 있는 사각형 또는 열 셀.
- 취득 형광 강렬 비율
- 관심의 셀 mCherry 채널에서 가장 높은 형광 강도가지고 있는 하나 이상의 분할 영역을 선택 하 고 있는지 확인에서 Concanavalin A 얼룩, 빨강 채널에서 본 foc에 선택한 슬라이스 내 우리.
- 각 FSC와 pHluorin와 mCherry 모두의 평균 형광 강도 측정을 위해 선택한 조각 측정 ROI 그릴.
- MCherry 형광에 pHluorin의 비율을 계산 하기 위해 mCherry 채널의 평균 형광 강도 의해 pHluorin 채널의 평균 형광 강도 나눕니다.
- 배경 빼기:
- 파생 피 값 하 고 pseudocolored 이미지를 생성
- 파생 피 값
- 모든 경우에 선형 회귀 곡선 생성 같은 유전자 형의 파리에서 난소를 사용 하 여 두 실험 조건 제어. 두 개의 nigericin 버퍼 조건 ( 그림 3)에서 데이터를 사용 하 여 각 셀 형식에 대 한 선형 회귀 곡선을 생성 합니다. Excel에서이 그래프에 데이터를 플롯과 선형 추세선을 추가 하 여 수행할 수 있습니다. 또는 참조:
- 기울기와 y 절편 선형 회귀 곡선의 nigericin 조건 및 라인의 방정식에서 계산 하는 사용 (y = mx + b)는 pHluorin mCherry 비율 값으로 변환 하는 중 탄산염의 샘플에서 계산 조건 pH 값입니다. 이 방정식에서 b에 대 한 사면 양식 (y-절편)을 대체, x에 비율 값을 입력 하 고 영에 대 한 해결
- 피지에 비율 값을 반영 하는 pseudocolored 이미지 생성.
- 배경 빼기 (단계 3에 대 한 위의 절차에 따라.1.1 및 그림 4).
- 는 프로세스 메뉴에 이미지 계산기 기능을 사용 하 여 mCherry 채널에서 pHluorin로 나눕니다. 반드시는 " 만들기 새 창 " 및 " 32 비트 (부동 소수점) 결과 " 체크 박스 모두 선택. 룩 업 테이블 (LUT)을 변경, 열 또는 선택의 LUT 이미지 메뉴에서 발견. 다른 적합 한 옵션에 대 한 그림 4를 참조 하십시오.
- 조정 밝기 및 대비 대화 상자에서 (이미지 → 조정 → 밝기/대비), 클릭에 " 설정 " 버튼. 세트는 최소 0 값을 표시 하 고 최대 표시 값 캡처 최고의 비율을 데이터, 일반적으로 1.0-2.0 ( 그림 5).
- 파생 피 값
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Representative Results
여기 우리는 몇 가지 단계를 포함 하 여 포 상피에 피를 측정 하는 과정을 설명 했습니다. 먼저, 난소는 해 부 및 설치 도구를 사용 하 여 적절 한 유전자 (그림 1)의 파리에서 해 부. ovarioles는 다음 양적 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데 하 고 이미지를 피 측정 분석. 각 이미지에 대 한 관심의 세포 유형 섹션 3.1 (그림 2)에 설명 된 대로 식별 됩니다. GFP와 mCherry 채널에서 형광 강렬 비율 섹션 3.2에 설명 된 대로 표준 곡선 (그림 3A)를 사용 하 여 피 값으로 변환 됩니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 그 피 초기 FSC 혈통, FSCs에 6.8에서 7.0 prefollicle 세포, 모 근 세포 (그림 3B)에 7.3에에서 차별화와 증가 발견. 각 셀 형식의 피 값 그림 3B에서 그래픽으로 나타낼 수 있습니다 또는 pHluorin에서 mCherry 비율의 차이 표시 하는 pseudocolored 현미경 사진으로 (그림 4 및 그림 5). 이러한 이미지에는 pHluorin에서 mCherry 비율의 차이 LUT에 의해 정의 된 색상에서 차이으로 표시 됩니다. 그것은 데이터의 대부분 대표 이미지를 생산 하는 LUT 및 색상의 범위에 대 한 최대 및 최소 값을 선택 해야 합니다. 하지만, 일반적으로, LUT 및 범위 설정의 이미지에 존재 하지 않는 차이의 모양을 주지 것입니다, Lut의 덜 적합 한 선택 피 차이 현미경 사진 (그림 5)에 모호한 수 있습니다.
그림 1: 재료 해 부 및 장착 초파리 ovarioles. (A) 이미지 표시: (1) 매니큐어; (2) 진공 그리스와 비 커와 피펫으로 팁 적용 윤활제;에 사용 (3) 23 게이지 주사기 바늘; (4) Dumont Inox 집게, 크기 5; (5) 3D 인쇄 장착 챔버; (40 m m 유리 coverslips; X 22 6) (7) 라운드 유리 Coverslips, 직경 12 m m, 0.13-0.16 m m 두께; 그리고 (8) 9-잘 유리 접시를 해 부. (B) 3 차원 인쇄 장착 챔버의 클로즈업 이미지. (C) wildtype 난소의 해 부 쌍을 보여주는 이미지. (D) 이미지 보여주는 잘 분리 된 ovarioles (E) A 사진의 해 부 난소와 3D 챔버 라운드 유리 coverslip 아래 탑재. 검은 점들은 방울 매니큐어 라운드 coverslip 장소에서 개최 하는 데 사용입니다. (F) 라운드 아래 해 부 ovarioles의 이미지 유리 coverslip 장착 후. 블랙 박스는 단일 해 부 ovariole로 이미지의 영역을 나타냅니다. 스케일 바 대표 약 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: FSCs, pFCs, 여 포 세포를 식별. 10930 Gal4 UAS-mCherry::pHluorin와 germaria의 두 가지 예 물 Concanavilin-. ROI는 FSC, pFC, 그리고 여 포 셀 개요는 각 이미지에 표시 됩니다. PHluorin 및 mCherry 채널에서 평균 형광 강도 pHluorin mCherry 비율을 계산 하는 데 사용 됩니다. 스케일 바 나타냅니다 약 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 피 FSC 혈통에 분화 하는 동안 증가. Ulmschneider 그 외 여러분 에서 가져온 대표적인 결과 2 표시: (A) 전형적인 선형 회귀 곡선 mCherry 비율; pHluorin에서 pH 값을 계산 하는 데 사용 그리고 (B) 계산 된 피 값 FSCs, pFCs, 및 여 포 세포에 대 한 95% 신뢰 간격. 이 수치는 Ulmschneider 그 외 여러분 에서 허가 후 적응 되었습니다. 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: pseudocolored 비율 이미지를 생성 하기 위해 피지를 사용 하 여. (A) 이미지 배경 빼기 과정에서 각 단계의 결과 표시 합니다. 처리 되지 않은 이미지 (왼쪽된 패널)에서 시작 해 서, 첫 번째 단계 픽셀 배경 아래 강도 값은 제외 임계값 제한을 설정 하려면입니다. 임계값의 상한값을 최대 설정 됩니다. 피지는 색상 제외 픽셀 블루, 파란색 배경 및 명확 하 게 보이는 germarium (중간 패널) 이미지 결과. 참고가이 단계는 선택 사항입니다. 두 번째 단계는 ROI는 투자 수익의 신호 (중간 패널에 빨간색 사각형), 측정 의미 형광 강도 하지 않고 이미지의 부분에 빼기는 백그라운드에서 발생 하는 전체 이미지에서 그 금액을 뺀 이미지 (오른쪽 패널). 세 번째 단계 mCherry 채널에서 이미지에 의해 pHluorin 채널에서 이미지를 분할 이미지 계산 기능을 사용 하는. 결과 회색 체계표와 함께 표시 되는 이미지를 있을 것입니다 하 고 이미지 표시 값 전체 동적 범위 이미지의 비트 심도에서 제공 되도록 설정 합니다. 마지막 단계는 더 적절 한 범위를 이미지 디스플레이 설정을 조정 하 고 코드 체계표를 선택 합니다. (B)는 최소 이미지 계산의 결과 보여주는 샘플 이미지 표시 값 0과 2.5 4 개의 다른 조회 테이블을 사용 하 여 설정 된 최대 디스플레이 값으로 설정. 각 이미지 옆 사각형 각 조회 테이블에 대 한 동적 범위에 걸쳐 사용 되는 색을 보여 줍니다. 힐로, 16 색, 고 열, 색은 사용 강도 값이 0 또는 최대값 (예를 들어, 파란색, 빨간색, HiLo에 각각,) 픽셀에 대 한 통지. 이 뷰어는 신호는 동적 범위를 수 동적 범위의 한계의 쉬운 시각적 참조를 제공 합니다. (C) 스크린 샷 ImageJ로 파일을 가져올 때 선택한 옵션을 보여주는 바이오 형식 가져오기 플러그인을 사용 하 여. 스케일 바 대표 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 설정 이미지 pseudocolored 비율 이미지의 표시 값. 있도록 동적 범위 이미지 중 탄산염 상태 뿐만 아니라 두 nigericin 조건에에서 신호는 최소 및 최대 이미지 표시 값을 설정 해야 합니다. 이 요점을 설명 하려면 두 이미지의 세 가지 조건 각각에서 4 개의 다른 이미지 디스플레이 설정 (0-0.5, 0-1, 0-2.5, 및 0-5) 함께 표시 됩니다 열 조회 테이블을 사용 하 여. 모든 3 개의 실험 조건에 대 한 이미지를 0.5로 표시 되는 최대 값 설정 표시, 신호는 최대 색도계 규모에 육박 하거나 갱신 하 고 5.0로 설정 하면 많은 신호 나 색상에 최소 근처에 imetric 규모입니다. 이러한 경우 모두에서 조직에 걸쳐 mCherry 비율에는 pHluorin에 차이 없습니다 쉽게 감상할 수 있으므로 이러한 설정이 적합 하지 않습니다. 반면, 1.0 또는 2.5의 최대 디스플레이 값은 훨씬 더 적합 합니다. 이러한 설정을 사용 하 여 조직에 걸쳐 비율에 차이 쉽게 평가 될 수 있다, 하 고 모든 3 개의 실험 조건에서 이미지에 신호 색도계 규모의 동적 범위는 색상에 표시 됩니다. 스케일 바 나타냅니다 약 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리가 wildtype 조직 내의 FSC 혈통에 셀의 피를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 개발 되어 있으며 우리가 처음 초파리 난소 조직에 피를 공부 하기 시작 했다 이후 지난 5 년간 정제 된. 그 시간 동안, 프로토콜 성공적으로 여러 조사 연구소에서 하 고 적어도 4 개의 다른 회전 디스크와 레이저 스캔 현미경에 의해 사용 되었습니다. 우리의 원래 관찰, 그 피 증가 FSC 계보에서 셀 여 포 세포 주를 pFC에 줄기 세포에서 분화로 여러 실험을 통해 보여 모두의 재현성이 생물 학적 현상은 강력 하 고 방법론은 안정적입니다. 그러나, 우리의 경험에서는, 이것은 마스터에 도전 절차입니다. 그것은 모든 단계에서 세부 사항 및 해 부, 설치, 및 이미징 단계의 급속 한, 매우 능숙 하 게 실행에 세심 한 관심을 요구 한다. 해 부 및 장착 절차 포함 10 분 부 화 하지만 총 15 분을 넘지 말아야 한다 프로토콜에서 설명 했 듯이, 그리고 45 분에 이미징 절차를 완료 해야 합니다. 이상적인 조건 하에서 초파리 ovarioles 14 h17, 최대에 대 한 문화에서 유지 될 수 있지만 우리는 조직 표준 곡선을 생성 하는 데 사용 하는 nigericin 버퍼에 훨씬 더 급속 하 게 죽을 시작 발견. 우리의 지침 확인 조직은 여전히 건강 하 고 정상적인 형태학 상으로 나타나는 시간 창 내에서 모든 데이터가 수집 됩니다. 이 떠나지 않습니다 많은 시간을 각 단계에 대 한 하지만, 그래서 그 모든 것이 한 단계에서 다음 진행 준비가 되도록 미리 계획 하는 것이 중요 하다. 사실, 두 사람이 함께 해 부, 장착, 작업과 다음 단계에 대 한 준비 절차, 다른 사람이 동안 단계를 실행 하는 한 사람으로 이미징 하는 경우 훨씬 더 효율적입니다.
피는 조직 비보 전, 온도 및 버퍼 구성 등 이미지 하는 데 필요한 실험 조작에 민감한 있을 수 있습니다이 방법이 피에 상대적인 변화를 식별 하 좋습니다. 프로브 두 가지 형광 단백질로 구성 되어, 그들의 형광 속성 같은 양자 수율, 생활 시간, 그리고 접는 속성 수 있습니다 영향을 다르게 다른 세포 유형. 따라서, nigericin 버퍼 조건 처리 하는 샘플을 포함 하 고 모든 재판에서 각 셀 형식에 대 한 새로운 보정 곡선을 생성 하기 위해 사용이 필수적입니다. 변화에 대 한 추가 소스를 최소화 하기 위해 이미징 과정 동안 모든 조건 일관성 유지는 강조 했다. Nigericin 버퍼 조건에서 샘플 준비 하 고 같은 날에 몇 군데 중 탄산염 버퍼 상태와 모든 샘플의 준비 및 이미지 수집 가능한 일관성 유지 해야 한다. 피 측정 이미지 세트, 그래서 실험 차이 mCherry의 검출에 영향을 주는 사이 비교에 근거 하 고 하나 이상의 이미지 세트 pHluorin 피 예측의 정확도 저하 될 수 있습니다 때문에 중요 하다. 광 전 증폭 관 관 (해당 되는 경우 검사 confocal 레이저를 사용 하 여) 또는 노출 시간 (confocal 회전 디스크를 사용 하 여) 하는 경우, 카메라에 도달 하는 빛의 양을 감소 시키는 더러운 렌즈의 전압 설정에 변경 요인 명확 하 게 결과 영향을 미칠 것 이다 . 하지만 일상에서 다를 수 있습니다 결과도 영향을 미칠 수 있는 다른 더 미묘한 요인의 무수 한 경우 등 파리는 잘 먹이, 파리, 그리고 얼마나 오래 레이저에 이미징 이전의 나이. 준비 하 고 같은 날에 모든 3 개의 조건 이미징 이러한 차이 최소화 하 고 따라서 가장 일관 된 결과 생성 합니다. 특히, 때마다 우리는 새로운 현미경으로 전환 또는 현미경의 구성 요소를 업그레이드 했다, reoptimize 새로운 장비 설정을 해야 했습니다. 이 종종 개별 측정의 평균값에서 변화를 가져왔지만, 장비 변화 피 견적에 최소한의 영향을 미쳤다로 새로운 보정 곡선 각 재판으로 생성 된. 또한, 관련 비교는 종종 같은 조직 (예를 들어, FSCs, pFCs 및 여 포 세포) 내 고 따라서 내부적으로 다른 세포 유형 사이 제어 실험 유사.
이 프로토콜은 wildtype 조직의 피 측정에 초점을 맞추고, 있지만 방법론 유전자 발현, RNAi 또는 UAS/Gal4 모자이크 분석을 사용 하 여 transgene의 표현 등을 조작 하기 위한 표준 초파리 방법와 호환 됩니다. MCherry::pHluorin는 UAS 발기인에 의해 구동 됩니다, 이후 그것은 항상 공동 RNAi 또는 transgene, 표현 됩니다 그리고 MARCM18 homozygous 돌연변이 클론 클론 표식으로 mCherry::pHluorin 생성 하는 데 사용할 수 있습니다. 위에서 설명한 이유로, wildtype 조직 모든 재판 돌연변이 유전자와 함께 제어로 분석 되어야 합니다. 마지막으로, 여기에 설명 된 일반 원칙 뿐만 아니라 다른 조직에서 피를 측정 하는 mCherry::pHluorin의 사용에 적용할 수 있습니다. 실제로,이 프로토콜은7 초파리 눈 피를 측정 하기 위해 mCherry::pHluorin를 사용 하기 위한 프로토콜에서 적응 했다 고 우리 애벌레 두뇌에 mCherry::pHluorin 이미지를 비슷한 방법론을 이용 했다. 전반적으로, 도구 및 여기에 설명 된 방법을 피에서 vivo에서 생활, 그대로 조직 내에서 많은 다양 한 기능을 조사 하기 위해 새로운 기회를 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
원고에 대 한 제안에 대 한 프로토콜 및 다이앤이 발사에 기여에 감사 Bryne Ulmschneider 하 고. 이 작품은 건강 그랜트 GM116384 T.G. Nystul 및 듀얼이 발사의 국가 학회에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
| y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Buffer preparation | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
| Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and mounting tools | |||
| 2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
| 2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
| 9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
| 22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| 3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other equipment | |||
| pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
| Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
| Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |
References
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