Vi tilbyr en protokoll for imaging intracellulær pH i en epithelial stamcelleforskningen slektslinje i levende Drosophila ovarian vev. Vi beskriver metoder for å generere transgene fluer uttrykke en pH biosensor, mCherry::pHluorin, bilde biosensor med kvantitative fluorescens imaging, standard kurver genererer og konvertere fluorescens intensitetsverdiene til pH-verdier.
Endringer i intracellulær pH (pHi) spille en viktig rolle i regulering av mange cellulære funksjoner, inkludert metabolisme, spredning og differensiering. Vanligvis bestemmes pHi dynamikken i kulturperler celler som er mottagelig for å måle og manipulere eksperimentelt pHi. Men har den siste utviklingen av nye verktøy og metoder gjort det mulig å studere pHi dynamikken i intakt, levende vev. For Drosophila forskning, en viktig utvikling var generasjonen av transgene linjen bærer en pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Her beskriver vi en protokoll som vi rutinemessig bruker for bildebehandling live Drosophila ovarioles å måle pHi i epithelial hårsekken stilk cellen (FSC) avstamning i mCherry::pHluorin transgene vill-type linjer; men kan metodene som er beskrevet her enkelt tilpasses for andre vev, inkludert fløyen plater og øye epitel. Vi beskriver teknikker for å uttrykke mCherry::pHluorin i FSC avstamning, opprettholde ovarian vev under live bildebehandling, og anskaffe og analysere bilder for å få pHi verdier.
Nyere studier viste en rolle for endringer i pHi under cellulære differensiering og dysplasia vivo1,,2. Disse studiene fant at pHi er bemerkelsesverdig konsekvent i celler av samme type på samme scene differensiering, men at den endres mens celler overgangen fra ett stadium til et annet. I noen tilfeller forstyrrer blokkerer endringene i pHi delvis differensiering, antyder at endringen i pHi er ikke bare en konsekvens av endringer i celle skjebne, men i stedet bidrar til å fremme endring i cellen skjebne, kanskje gjennom effekter på pH-sensitive regulatoriske proteiner eller kjemiske reaksjoner kreves for differensiering. Fremtidige studier har potensial til å avsløre mer innsikt i de mange forskjellige rollene av pHi dynamikken i vivo. Imidlertid er en av utfordringene med å studere pHi under differensiering i vivo å få nøyaktige målinger av pHi. I motsetning til andre funksjoner av differensiering, for eksempel endringer i mobilnettet morfologi og genuttrykk, er pHi en labil kjemiske egenskaper av cellen som ikke beholdes i celler som er fast og permeabilized med standard metoder. I tillegg kan pHi ikke være stabil i celler som er stresset eller døende som følge av eksperimentelle manipulasjon. Derfor er det viktig å holde cellene i live og så frisk som mulig når du måler pHi. Flere viktige fargestoffer er tilgjengelig som fungerer bra for måling pHi celler i kultur3, men i mange tilfeller de ikke er egnet for i vivo studier fordi de ikke trenge gjennom vevet dypt eller jevnt nok til å gi presise målinger .
For å omgå problemet med dårlig fargestoff penetrasjon, har vi og andre brukt en genetisk kodet sonde, mCherry::pHluorin4,5,6,7, som kan uttrykkes i cellen typer av interesse og fotografert i levende vev. pHluorin er en variant av GFP med en høyere pKa (~ 7.0 vs. ~ 4.0) som kaster mer lett på høyere pH; så total fluorescens intensiteten slippes ut fra en befolkning på pHluorin molekylene i cellen øker med økende pHi8. Viktigere er fluorescens lineær innenfor normalområdet cytosolic pHi verdier. I kontrast, fluorescens av mCherry (pKa ~ 4.5) er bokstaver pH endringer innen cytosolic. Disse to journalister kobles covalently sammen i en enkelt chimeric protein, kodet av en åpen leseramme, så de er alltid til stede i like mengder. Forholdet mellom pHluorin til mCherry fluorescens intensitet gir derfor en måling av pHi som er normalisert til sonde konsentrasjonen i hver celle. Forholdstallene kan deretter konverteres til anslag over pHi verdier ved hjelp av en standard kurven som genereres ved å få tak i pHluorin til mCherry prosenter fra vev som har vært equilibrated kjent pH-verdier.
Her beskriver vi metodene for å bruke mCherry::pHluorin til å måle pHi av epitelial FSC slektslinje i Drosophila eggstokken. Dette godt karakterisert vevet er brukt til å modellere mange ulike aspekter av epitelial biologi, for eksempel stamcelleforskningen selvtillit fornyelse og differensiering9,10,11, kollektive celle migrasjon12 , samt utvikling og vedlikehold av cellen polaritet13,14. Hårsekken epitel er produsert av to FSCs som befinner seg på fremre kant av vevet i en struktur som kalles germarium15,16. Disse cellene dele regelmessig voksen selvstendig fornye og produsere avkom, kalt prefollicle celler (PFK), som kan skrive inn nisje og bli en FSC eller skille ut en av tre forskjellige hårsekken celletyper: polar celler, stilk celler, eller hoveddelen hårsekken celler. Vi viste tidligere at i wildtype vev, pHi øker jevnt i de tidlige stadiene av differensiering, fra en pHi av ca 6.8 i FSCs 7.0 i pFCs, til 7.3 i hårsekken celler2. Blokkerer denne økningen av RNAi knockdown av en overalt uttrykt natrium/proton exchanger, DNhe2, alvorlig svekker pFC differensiering, mens øke pHi ved overuttrykte DNhe2 forårsaker en mild overflødig differensiering fenotypen. Disse funnene viser at pHi opprettholdes stabilt i tidlig FSC avstamning og at det kan være eksperimentelt økt eller redusert i vivo. Metodene som er beskrevet her kan brukes til å måle pHi i wildtype vev eller ulike former for mutant vev, inkludert RNAi knockdown eller overuttrykte med en Gal4 av interesse, og mitotisk kloner.
Her beskriver vi en metode for å måle pHi celler i FSC avstamning innen wildtype vev. Denne protokollen er utviklet og raffinert de siste fem årene, siden vi først begynte å studere pHi i Drosophila ovarian vev. Under oppstarten har protokollen vært brukt med hell av flere etterforskere i vår lab og på minst fire forskjellige spinning plate og laserskanning mikroskop. Reproduserbarhet vår opprinnelige observasjon, at pHi øker som celler i FSC avstamning skille fra stilk cellen til pFC til hårsekken ce…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Bryne Ulmschneider for bidrag til protokollen og Diane Barber forslag på manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av en National Institute of Health grant GM116384 TG Nystul og DL frisør.
Fly Stocks | |||
UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Buffer preparation | |||
NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection and mounting tools | |||
2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other equipment | |||
pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |