Forskning på ioniserende stråling (IR)-indusert clonogenic celledød er viktig for å forstå effekten av IR på ondsinnethet svulst og normalt vev. Her beskriver vi en ettrinns analysen for å vurdere de store modusene av IR-indusert clonogenic celledød basert på morfologi av 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)-farget kjerner visualisert ved fluorescens mikroskopi.
Forskning på ioniserende stråling (IR)-indusert clonogenic celledød er viktig for å forstå effekten av IR på ondsinnethet svulst og normalt vev. Her beskriver vi en rask og kostnadseffektiv ettrinns analysen for å vurdere samtidig store moduser av clonogenic celledød indusert av IR, dvs, apoptose, mitotisk katastrofe og mobilnettet senescence. Denne metoden er celler dyrket på en cover slip bestrålt røntgenstråler og farget med 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Bruker fluorescens mikroskopi, apoptose, mitotisk katastrofe og mobilnettet senescence, identifiseres basert på de karakteristiske morphologies av DAPI-farget kjerner. Apoptose bestemmes av tilstedeværelsen av apoptotisk organer (dvs., knepet og fragmentert kjerner). Mitotisk katastrofe bestemmes av tilstedeværelse av kjerner som viser to eller flere forskjellige fliker og mikronuklei. Mobilnettet senescence bestemmes av tilstedeværelsen av senescence-assosiert heterochromatic foci (dvs., kjernefysiske DNA som inneholder 30-50 lyse, tett fokus). Denne tilnærmingen kan eksperimentator til lett skjermen for clonogenic celle død modus bruker ulike linjer, innstillingene eller tidspunkt, med mål om Klargjørende mekanismer for celledød i målcellene og forholdene rundt.
Ioniserende stråling (IR) induserer flere driftsmoduser clonogenic celledød. Forskning på IR-indusert clonogenic celledød er viktig for å forstå toksisitet av IR på normalt vev og utvikle metoder for å øke behandling effekten av kreft strålebehandling. Apoptose, mitotisk katastrofe og mobilnettet senescence er store moduser av clonogenic celledød indusert av IR1. Apoptose er en regulert celledød som startes av DNA skade1. Mitotisk katastrofe er celledød som oppstår grunnet avvikende mitose skyldes ikke er reparert DNA dobbel-strand bryter1. Mobilnettet senescence er definert som en tilstand av irreversible celle vekst arrestasjon2; Merk at mobilnettet senescence er ikke celledød per se, men det er en måte å clonogenic celledød fordi det opphever clonogenic overlevelsen av den senescent cellen.
Ulike cellebasert analyser er utviklet for å vurdere individuelt apoptose, mitotisk katastrofe og mobilnettet senescence. Apoptose kan vurderes av terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end merking (tunnel) flekker, annexin V flekker, DNA fragmentering analyser og sub-G1 cellen syklus fase fastsettelse av flyt cytometri1. Mitotisk katastrofe kan vurderes av immunofluorescence flekker for mitotisk markører, inkludert MPM2, tunnel flekker og elektronmikroskop1. Mobilnettet senescence kan vurderes av senescence-assosiert β-galactosidase (SA-β-Gal) flekker, vekst-arrestasjon analyser og elektronmikroskop1. Viktigere, varierer den dominerende modusen av clonogenic celledød blant linjer og behandling for3,4. Derfor for å belyse generelle profilen til clonogenic celledød gitt eksperimentelle omgivelser, må flere analyser dekker alle disse modiene av død utføres sammen, som er arbeids – og kostnadskrevende.
I denne artikkelen beskriver vi en rask og kostnadseffektiv ettrinns analysen for samtidig vurdere apoptose, mitotisk katastrofe og mobilnettet senescence indusert av IR3,4. Denne metoden er celler dyrket på en cover slip bestrålt røntgenstråler og farget med 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Bruker fluorescens mikroskopi, identifiseres apoptose, mitotisk katastrofe og mobilnettet senescence hver basert på de respektive karakteristiske morphologies av DAPI-farget kjerner. Denne tilnærmingen vil være nyttig for programmer inkludert screening for clonogenic celle død profiler i ulike linjer, behandlingstilbud og tidspunkt, med mål om å undersøke mekanismer for celledød i målcellene og ansettelsesbetingelser interesse.
De avgjørende skritt i protokollen er som følger: Først bør celler dyrkes på kultur parabolen som en monolayer fordi gjennomfører en morfologiske vurdering av DAPI-farget kjerner er vanskelig for flerlags celler. For dette formål, i trinn 2.9, anbefales forsiktig overføring av kultur retten til en inkubator; risting av kultur retten genererer en virvel av suspendert celler som fører til konsentrasjonen av celler i sentrum av kultur parabolen. I tillegg bør overconfluence fører til flerlags celler unngås. For dette formål, i trinn 2.7, kan antall celler seeded på kultur parabol endres basert på befolkningen dobling tid og intervallet mellom bestråling og fiksering. En samløpet av omtrent 80 ved fiksering anbefales. Andre er hastigheten viktig fiksering og DAPI flekker (dvs., trinn 4 og 5). Inter eksempel inkonsekvens i forhold til tiden fremgangsmåten kan føre til heterogenitet DAPI signal intensitet i kjerner, som ville skjule morfologiske vurdering.
I trinn 2.2, kan du øke antall cover slips i en enkelt kultur parabol; maksimalt fire cover slips kan plasseres i en 35 mm rett, og kan være ytterligere økt med større retter. Plassere flere cover slips i hver kultur parabol kan for tiden kurs vurdering for en gitt behandling (dvs., forsiden slips kan hentes fra en kultur parabol enkeltvis på flere tiden punkter av interesse).
I trinnet 3.2 kan bestråling dosen endres i henhold til forskernes interesse. Anvendelsen av en konsekvent dose til flere linjer gjør sammenligning av følsomhet for hver modus av clonogenic celledød blant linjene. På den annen side, gjør bruk av iso-clonogenic overlevelse doser for hver celle linje sammenligning av clonogenic celle død profiler blant linjene. Iso-clonogenic overlevelse dosen kan bestemmes av den clonogenic overlevelse analyse12. D10 verdien dosen som gir 10% clonogenic overlevelse, er et felles endepunkt for iso-clonogenic overlevelse dosen.
I trinnet 3.3 kan tiden fra bestråling til fiksering endres i henhold til forskernes interesse; Dette er viktig fordi årstiden for IR-indusert apoptose, mitotisk katastrofe og mobilnettet senescence varierer med cellen linje og behandling. I denne artikkelen vi brukte 72 h etter bestråling som tidspunktet som ville være mest nyttig for første screening av clonogenic celle død profiler, basert på flere studier av vår gruppe og andre beskrives som følger1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-ray-indusert apoptose i celler som er opprettet fra solide svulster hovedsakelig skjer noen dager etter bestråling. (ii) X-ray-indusert mitotisk katastrofe i kreftcellene skjer mest fremtredende i andre eller tredje mitose etter løslatelse fra midlertidig celle syklus arrestasjon indusert av bestråling. Utgivelsen oppstår vanligvis ca 24 timer etter bestråling, etterfulgt av gjentatte mitoses i intervaller på ca 24 h. (iii) X-ray-indusert mobilnettet senescence blir tydelig etter en avhengig av den aktuelle celle linjen: 2 dager etter bestråling i noen tidlige saker og 7 dager etter bestråling for de fleste linjer. Etter innhente et generelt bilde av clonogenic cellen død profiler fra første screening, tid kurs eksperimenter vil gi en mer detaljert forklaring av årstiden for hver modus av clonogenic celledød i bestemt celle linje og/eller tilstand rundt4.
Det bør bemerkes at DAPI flekker analysen og clonogenic overlevelse analysen, en gull-standard metode for stråling følsomhet vurdering, ikke er utskiftbare. Apoptose og mitotisk katastrofe bare siste timer. Dermed oppdager DAPI flekker analysen for et gitt tidspunkt apoptose og mitotisk katastrofe som inntreffer på tidspunktet for vurdering. På den annen side, analysen resultatene av clonogenic overlevelse på et gitt tidspunkt punktet omfatter den totale mengden apoptose og mitotisk katastrofe som skjedde under inkubasjonstiden for vanligvis 10-14 dager etter bestråling. Forskjellig fra apoptose og mitotisk katastrofe, senescent celler forblir på kultur parabol; de samler seg gradvis over tid etter bestråling. Derfor resultatene for begge DAPI flekker analysen og clonogenic overlevelse analysen gjenspeiler den totale mengden senescence som oppstod under inkubasjonstiden. Viktigere, andelen av apoptose, mitotisk katastrofe og senescence av bestråling varierer i henhold til celle linje og bestråling dose. Samlet teoretisk sett resultatene av en analysen kan ikke oversettes direkte inn i de andre analysen.
DAPI flekker analysen har noen begrensninger. Først er det fortsatt kontroversielt om mitotisk katastrofe er en distinkt celledød. I feltet for stråling biologi som mitotisk katastrofe en stor modus av IR-indusert celledød som er forskjellig fra andre mekanismer clonogenic celle død1. Derimot, hevder andre at mitotisk katastrofe ikke er en distinkt modus celledød men heller en prosess foran celledød inkludert apoptose og nekrose13,14. Dermed overlappe apoptose og mitotisk katastrofe til en viss grad. Andre, tidligere studier tyder på at mobilnettet senescence kan skje i fravær av SAHF i noen linjer og behandling for2. I dag, andre analyser spesielt utformet for hver clonogenic celle bør død modus brukes å øke robustheten av konklusjonene i en bestemt eksperiment. Tredje vurdere DAPI flekker analysen ikke driftsmoduser clonogenic celledød enn apoptose, mitotisk katastrofe og mobilnettet senescence (f.eks, nekrose og autophagy). Fjerde har nytten av DAPI flekker analysen som en prediktor på tumor respons på strålebehandling ikke blitt belyst i klinikken. Fra dette synspunkt er clonogenic overlevelse analysen, som vurderer den totale mengden clonogenic celledød, overordnet DAPI flekker analysen fordi en sammenheng har blitt etablert mellom SF2, bevarte delen av celler bestrålt med 2 Gy Røntgen, og svulst svaret strålebehandling15. Likevel, det er bemerkelsesverdig at clonogenic overlevelse analysen ikke brukes mye i klinikken, hovedsakelig på behovet for høy grad av kompetanse og en lang periode (dvs.14 dager) for datainnsamling. Sammenligning prosedyren for DAPI flekker analysen enklere og tar betydelig kortere tid, ca 3-4 dager, for å generere resultater. Nytten av den DAPI flekkeranalysen som en prediktor på tumor respons på strålebehandling vil bli testet i klinikken i nær fremtid.
I sammendraget er DAPI flekker analysen en kostnadseffektiv ettrinns analysen å samtidig vurdere store moduser av IR-indusert clonogenic celledød. Denne tilnærmingen gjør det mulig å enkelt skjerm for moduser av clonogenic celledød for ulike linjer, behandlingstilbud og tidspunkt, med mål om Klargjørende mekanismer for celledød i målcellene og forholdene rundt.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker fru Akiko Shibata for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan for programmer for ledende utdannet skoler, dyrke globale ledere i tunge Ion Therapeutics og Engineering.
cover slip | Matsunami | C013001 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
trypsin | Wako | 201-16945 | |
inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
square culture dish | Corning | 431110 | |
slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
oil | Olympus | N5218600 | |
CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
chloroform | Wako | 035-02616 |