Summary
Investigación sobre radiación ionizante (IR)-muerte de las células clonogenic inducido es importante para comprender los efectos de IR en tumores malignos y los tejidos normales. Aquí, describimos un análisis de un solo paso para la evaluación de los modos principales de la muerte celular inducida por IR clonogenic basado en morfología de 4', diclorhidrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-tinción de núcleos visualizados por microscopía de fluorescencia.
Abstract
Investigación sobre radiación ionizante (IR)-muerte de las células clonogenic inducido es importante para comprender el efecto de IR en tumores malignos y los tejidos normales. Aquí, describimos un análisis de un solo paso rápida y rentable para evaluar simultáneamente los modos principales de clonogenic la muerte celular inducida por IR, es decir, apoptosis, catástrofe mitótica y senescencia celular. En este método, las células cultivadas en un cubreobjetos son irradiadas con rayos x y teñidas con 4', diclorhidrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Usando microscopía de fluorescencia, catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular se identifican basados en la morfología característica de los núcleos teñidos de DAPI. Apoptosis es determinada por la presencia de cuerpos apoptóticos (es decir, núcleos de condensación y fragmentación). Catástrofe mitótica es determinada por la presencia de núcleos que presentan dos o más lóbulos distintos y micronúcleos. Senescencia celular está determinada por la presencia de senescencia asociada heterochromatic focos (es decir, ADN nuclear que contiene focos brillantes, densos de 30-50). Este enfoque permite al experimentador para fácilmente detectar modos de muerte de células clonogenic utilizando diferentes líneas celulares, opciones de tratamiento o puntos del tiempo, con el objetivo de dilucidar los mecanismos de muerte celular en las células diana y las condiciones de interés.
Introduction
Radiación ionizante (IR) induce múltiples modos de muerte de las células clonogenic. Investigación sobre la muerte celular inducida por IR clonogenic es importante para la comprensión de la toxicidad de IR a los tejidos normales, así como para el desarrollo de métodos para aumentar la eficacia del tratamiento de la radioterapia del cáncer. Catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular son los modos principales de clonogenic la muerte celular inducida por IR1. La apoptosis es un modo de regulación de muerte celular que se inicia por ADN daños1. Catástrofe mitótica es la muerte celular que se produce por mitosis aberrante resultando de rupturas de roturas de doble cadena de ADN1. Senescencia celular se define como un estado celular irreversible crecimiento detención2; Tenga en cuenta que la senescencia celular no es la muerte celular per se, pero es un modo de muerte de las células clonogenic porque suprime la supervivencia clonogenic de la célula senescente.
Varios ensayos de células se han desarrollado para evaluar individualmente la catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular. Apoptosis puede evaluarse por terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end etiquetado (TUNEL) de tinción, tinción de anexina V, análisis de fragmentación de ADN y sub-G1 ciclo celular fase determinación por citometría de flujo1. Catástrofe mitótica puede evaluarse por la inmunofluorescencia que manchaba para marcadores mitotic, incluyendo MPM2, tinción TUNEL y la microscopia electrónica1. Senescencia celular puede ser evaluada por coloración asociada a la senescencia de β-galactosidasa (SA-β-Gal), pruebas de detención de crecimiento y microscopia electrónica1. Lo importante es el modo predominante de muerte de las células clonogenic diferencia entre líneas celulares y tratamiento ajustes3,4. Por lo tanto, para dilucidar el perfil global de muerte de las células clonogenic para un determinado ajuste experimental, múltiples ensayos cubriendo todos estos modos de muerte se realizarán juntos, que es trabajo y costosa.
En este artículo se describe un ensayo de un solo paso rápida y rentable para evaluar simultáneamente la catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular inducida por IR3,4. En este método, las células cultivadas en un cubreobjetos son irradiadas con rayos x y teñidas con 4', diclorhidrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Usando microscopía de fluorescencia, catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular son cada uno identificados basados en las morfologías características respectivas de los núcleos teñidos de DAPI. Este enfoque será útil para aplicaciones tales como detección de perfiles de la muerte de células clonogenic en varias líneas celulares, ajustes de tratamiento y puntos del tiempo, con el objetivo de investigar los mecanismos de muerte celular en las células diana y las condiciones de interés.
Protocol
1. preparación de materiales
- Autoclave cubreobjetos.
- Coloque el cubreobjetos en un vaso de cristal.
- Cubrir el vaso de vidrio con papel de aluminio.
- Autoclave a 121 ° C a 15 psi por 20 min.
- Seco en 50 ° C. tienda a temperatura ambiente en una campana de cultura.
- Preparar solución de fijación: paraformaldehído al 3% + 2% de sacarosa en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- a una botella de cristal de 1.000 mL, agregar 700 mL de PBS y paraformaldehido 30 g.
PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es corrosivo, use guantes apropiados. - Disolver paraformaldehido totalmente por calentamiento a 80 ° C utilizando microondas.
PRECAUCIÓN: Los vapores de paraformaldehido son tóxicos, usar una máscara de. - Dejar a temperatura ambiente durante la noche.
- Añadir sacarosa 20 g.
- Añadir PBS para el volumen total de 1 L.
- Tubos alícuota de 50 mL. Solución de fijación puede almacenarse por 3 años a-20 ° C o 3 meses a 4 ° C.
- a una botella de cristal de 1.000 mL, agregar 700 mL de PBS y paraformaldehido 30 g.
2. Preparación del cultivo celular
Nota: estos procedimientos deben realizarse en una campana de cultura.
Las células de osteosarcoma humano U2OS- cultura y paso a mantener crecimiento logarítmico 5.
Nota: Otros tipos de células pueden utilizarse después de determinar la dosis óptima. - Limpiar un bisturí con toallas de papel humedecidos con etanol al 70%. Con el bisturí, coloque un cubreobjetos sobre una placa de cultivo celular de 35 mm (en adelante simplemente conocido como " el plato ").
Nota: El número de cubreobjetos en un plato puede incrementarse según el experimental de diseño (ver discusión). - Agregue 1 mL medio de cultivo: DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%.
Nota: Se pueden utilizar otros medios según el tipo celular elegido.
Pinzas de - limpiar con toallas de papel humedecen con etanol al 70%. Usando las pinzas, sostenga suavemente el centro de la hoja de cubierta. Aspirar el medio de cultivo del plato completamente, manteniendo un control sobre el cubreobjetos.
Nota: este paso promueve la inmovilización de la tapa al plato. - Quitar adherentes células cultivadas usando tripsina 5.
- Aspirar el medio de cultivo del plato.
- Añadir 1 mL de PBS y agitar suavemente el plato de.
- PBS aspirar de la fuente.
- Añadir tripsina 1 mL [0.25w/v% tripsina-1mmol/L de EDTA] al plato.
- Incubar 5 min a 37 ° C en atmósfera con 5% CO 2.
- Añadir 9 mL medio de cultivo para el plato de.
- Utilizando una micropipeta de 1000 μL, preparar una suspensión unicelular.
- Conde el de células 5.
- En un tubo de 1,5 mL, añadir suspensión celular de 0,9 mL y 0,1 mL 0.4% solución de azul de tripano.
- Se aplican 10 μL en un hemocitómetro.
- Examinar el número de mancha (es decir, vivo) las células bajo un microscopio de fase invertida.
- En un tubo de 15 mL, preparar 3 mL suspensión de células en medios de cultivo a una densidad de 0,5 x 10 5 células/mL.
Nota: Densidad puede ser modificada según experimental la célula necesita (ver discusión). - Suavemente, añadir 2 mL de la suspensión de células al plato.
- Incubar durante la noche a 37 ° C en atmósfera con 5% CO 2.
3. Irradiación
PRECAUCIÓN: manejar el irradiador de rayos x con cuidado según el fabricante ' instrucciones s.
- Examinar las células bajo un microscopio de fase invertida. Confirmar que las células se unen a los cubreobjetos y vivo.
- Irradiar el plato con 6 Gy de rayos x (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
- Incubar por 72 h a 37 ° C en atmósfera con 5% CO 2.
Nota: Tiempo de incubación puede ser modificado según el experimental de diseño (ver discusión).
4. Fijación
- aspirar el medio de cultivo del plato.
- Usando las tijeras, cortar la punta de una micropipeta de 1.000 μL Punta 5 mm desde el final.
Nota: La punta del corte ayuda para aplicar suavemente la solución de fijación. - Con la punta cortada, añadir 1 mL de solución de fijación (preparada en el paso 1.2) al plato de la pared lateral del plato.
Nota: Este paso es sensible al tiempo y por lo tanto se debe realizar sin cambiar puntas de micropipeta al manipular las muestras múltiples. Aplicación de solución de fijación directamente a la parte inferior del plato puede dañar las células. - Colocar el plato en una fuente de la Plaza de la cultura. Agite el plato cuadrado cultura suavemente para distribuir uniformemente la solución de fijación sobre el cubreobjetos.
- Incubar 10 min a temperatura ambiente.
- Aspirar solución de fijación del plato.
- Añadir 2 mL de PBS para el plato de la pared lateral del plato.
Nota: La aplicación de la PBS directamente a la parte inferior del plato puede dañar las células. - PBS aspirar de la fuente.
- Repita los pasos 4.7 y 4.8 dos veces.
Nota: El plato puede almacenarse durante 1 semana a 4 ° C con el cubreobjetos bañados en 2 mL de PBS.
5. Tinción DAPI
- a un vaso de diapositivas, aplicar 5 tinción DAPI μL 1 μg/mL Reactivo de.
Nota: El reactivo de coloración de DAPI es estable durante 6 meses si se almacena protegida de la luz en o por debajo de -20 ° C. - Con un bisturí, quitar el cubreobjetos de la fuente.
- Dibujar el exceso PBS sobre el cubreobjetos tocando el borde de la hoja de cubierta con una toalla de papel.
- Montar el resbalón de la cubierta boca abajo sobre la gota de tinción reactivo sobre el vidrio del portaobjetos para que las células se exponen a DAPI reactivo de tinción DAPI.
Nota: Este paso es sensible al tiempo. Secado de la DAPI tinción reactivo puede conducir a tinción subóptima. - Las muestras pueden conservarse durante 1 año a -20 ° C.
6. Adquisición de imágenes
- examinar la muestra en un microscopio de fluorescencia. Los núcleos son visualizados usando el filtro DAPI.
Nota: Ya sea un 20 X o un lente de aceite X 60 se puede utilizar, según el investigador ' interés s. Cuando utilice un objetivo de aceite X 60, añadir una gota de aceite sobre el cubreobjetos. Tenga cuidado de que las muestras no toquen la lente; de lo contrario, puede dañarse el objetivo. - Adquisición de imágenes de núcleos usando una cámara CCD y software de adquisición de imagen digital con las siguientes configuraciones y parámetros: filtro DAPI, imágenes de monocapa, ganancia de 1 X y exposición automática.
- Final de adquisición de la imagen: Limpie la lente 20 X con toallas de papel humedecidos con lentes limpiador. Limpie el 60 X lente de aceite con toallas de papel humedecidos con cloroformo.
7. Evaluación del modo de muerte de células Clonogenic
- de imágenes seleccionadas al azar, contar el número de núcleos que cumplen los criterios para la catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular hasta que el número total de núcleos contados alcanza las 300. Realizar este paso por triplicado para cada ajuste experimental.
- Criterios de apoptosis: presencia de apoptóticos cuerpos (es decir, núcleos de condensación y fragmentados) 6 , 7.
- Criterios de catástrofe mitótica: presencia de núcleos con dos o más lóbulos distintos o micronuclIE 8 , 9 , 10.
- Criterios de senescencia celular: presencia de focos heterochromatic asociada a la senescencia (SAHF) (es decir, ADN nuclear que contiene focos brillantes, densos de 30-50) 2 , 11.
Representative Results
Por ejemplo, células de osteosarcoma humano U2OS fueron tratadas con 6 Gy de rayos x, se incubaron durante 72 h y sometidas a la DAPI ensayo según el protocolo de tinción. La figura 1 muestra imágenes ampliadas para la morfología nuclear típica asociada con apoptosis, catástrofe mitótica y senescencia celular obtenida usando un lente de aceite 60 ×. Se refieren a pasos 7.1.1-7.1.3 de la morfología característica para cada modo de muerte de las células clonogenic. Figura 2 muestra imágenes Resumen de núcleos obtenidos utilizando una lente de X 20. Irradiación con 6 Gy de rayos x inducida por catástrofe mitótica con frecuencia, con menos frecuencia de apoptosis y senescencia celular rara vez. De esta manera, el examen en un campo de bajo aumento permite aprehender a simple vista el panorama general del perfil de muerte de células clonogenic en un entorno experimental dado. La figura 3 muestra una representación gráfica de los datos cuantificados.
Figura 1: zoom de imágenes de núcleos teñidos de DAPI que muestran morfologías típicas de catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular. U2OS células fueron irradiadas con 6 Gy de rayos x. Después de 72 h, las células fueron fijadas y teñidas con DAPI. Imágenes nucleares fueron adquiridos con un 60 X lente de aceite. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imágenes Resumen de tinción DAPI núcleos de las células trataron con rayos x. U2OS células fueron irradiadas con rayos x de Gy 6 o mock-irradiado. Después de 72 h, las células fueron fijadas y teñidas con DAPI. Imágenes de núcleos fueron adquiridos mediante una lente de X 20. Círculos, apoptosis; flechas, catástrofe mitótica. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: datos cuantificados para catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular inducen en células tratadas con rayos x. U2OS células fueron irradiadas con rayos x de Gy 6 o mock-irradiado. Después de 72 h, las células fueron fijadas y teñidas con DAPI. Imágenes de núcleos fueron adquiridos mediante una lente de X 20. De campos al azar, se evaluaron un total de 300 núcleos de senescencia celular (Sns), la catástrofe mitótica (MC) y la apoptosis (Ap). Las evaluaciones se realizaron por triplicado. Se muestran los valores promedio, y barras de error indican la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los pasos críticos en el protocolo son los siguientes. En primer lugar, las células deben cultivarse en la placa de cultivo como una monocapa evaluación morfológica de los núcleos teñidos de DAPI es difícil para las células de varias capas. Para ello, en el paso 2.9, se recomienda cuidado de transferencia de la placa de cultivo a una incubadora; agitación de la placa de cultivo genera un remolino de células suspendidas que conduce a la concentración de células en el centro de la placa de cultivo. Además, debe evitarse la overconfluence llevando a las células de varias capas. Para ello, en el paso 2.7, puede modificarse el número de células sembradas en la placa de cultivo basado en la población, duplicando el tiempo y el intervalo entre la irradiación y la fijación. Se recomienda una confluencia de aproximadamente 80 en el momento de la fijación. En segundo lugar, la velocidad es importante en la fijación y coloración de DAPI (es decir, los pasos 4 y 5). La muestra inconsistencia en relación con el tiempo estos pasos puede conducir a heterogeneidad en la intensidad de la señal DAPI en los núcleos, que oscurecería la evaluación morfológica.
En el paso 2.2, se puede aumentar el número de cubreobjetos en un plato de cultura única; un máximo de cuatro cubreobjetos puede colocarse en un plato de 35 mm, y el número puede aumentarse aún más con platos más grandes. Colocar cubreobjetos múltiples en cada placa de cultivo permite la operación eficiente de evaluación de cursos de tiempo para un tratamiento (es decir, la tapa se desliza se puede recoger de un plato de cultura uno por uno en múltiples momentos de interés).
En el paso 3.2, la dosis puede modificarse según los intereses de los investigadores. La aplicación de una dosis constante en múltiples líneas celulares permite la comparación de la sensibilidad a cada modo de la muerte de las células clonogenic entre las líneas celulares. Por otro lado, el uso de iso-clonogenic supervivencia dosis para cada línea celular permite la comparación de perfiles de la muerte de células clonogenic entre las líneas celulares. La dosis de supervivencia clonogenic iso puede determinarse por el análisis de supervivencia clonogenic12. El valor de10 D, la dosis que ofrece 10% de clonogenic de supervivencia, es un punto final común para la dosis de supervivencia iso clonogenic.
En el paso 3.3, el momento de la irradiación de fijación puede ser modificado según el interés de los investigadores; Esto es importante porque el tiempo de pico de apoptosis inducida por IR, catástrofe mitótica y senescencia celular varía según tratamiento y línea celular. En este artículo, utilizamos 72 h después de la irradiación como el punto de tiempo que sería más útil para el cribado inicial de perfiles de muerte de células clonogenic, basado en múltiples estudios de nuestro grupo y otros se describen como sigue1,2, 3 , 4 , 8 , 9: () inducida por rayos X de apoptosis en células establecidas en su mayoría de tumores sólidos se produce unos días después de la irradiación. (ii) X-ray inducida por catástrofe mitótica en las células cancerosas se produce principalmente en la segunda o tercera mitosis después del lanzamiento de la detención del ciclo celular temporal inducida por la irradiación. La liberación ocurre generalmente aproximadamente 24 h después de la irradiación, seguida por mitosis repetidas a intervalos de aproximadamente 24 h. (iii) senescencia celular inducida por rayos X se hace evidente después de un intervalo depende de la línea celular en cuestión: 2 días después de irradiación para algunos casos tempranos y 7 días después de la irradiación para la mayoría de las líneas de la célula. Después de obtener una visión global de la célula de clonogenic perfiles de muerte de la proyección inicial, tiempo experimentos curso proporcionará una aclaración más detallada de la hora pico para cada modo de clonogenic muerte celular en la línea celular específica o condición de interés4.
Cabe señalar que el DAPI coloración ensayo y el ensayo de supervivencia de clonogenic, un método estándar de oro para la evaluación de la sensibilidad de la radiación, no son intercambiables. Apoptosis y catástrofe mitótica sólo durar por horas. Así, el DAPI tinción ensayo para un determinado momento detecta apoptosis y catástrofe mitótica que se produce en el momento de la evaluación. Por otro lado, los resultados de la supervivencia de clonogenic de ensayo en un momento dado punto de incluir la cantidad total de catástrofe mitótica que había ocurrido durante el período de incubación de típicamente 10 a 14 días después de la irradiación y la apoptosis. A diferencia de la apoptosis y catástrofe mitótica, las células senescentes permanecen en el plato de la cultura; se acumulan gradualmente con el tiempo después de la irradiación. Por lo tanto, los resultados de ambos el DAPI coloración ensayo y el ensayo de supervivencia de clonogenic reflejan la cantidad total de senescencia que ocurrieron durante el período de incubación. Lo importante es la proporción de catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia inducida por la irradiación varía ampliamente según la célula dosis de irradiación y línea. Tomados en conjunto, en teoría, los resultados de un ensayo no puede traducirse directamente en ésos del otro ensayo.
El DAPI ensayo de tinción tiene algunas limitaciones. En primer lugar, sigue siendo polémico si la catástrofe mitótica es un modo distinto de la muerte celular. En el campo de la biología de la radiación, catástrofe mitótica se considera un importante modo de muerte celular inducida por IR que es distinta de otros mecanismos de muerte de células clonogenic1. Por otra parte, otros sostienen que esa catástrofe mitótica no es un modo distinto de muerte celular, sino más bien un proceso que precede la muerte de las células incluyendo la apoptosis y la necrosis13,14. Así, la apoptosis y catástrofe mitótica pueden superponerse hasta cierto punto. En segundo lugar, anteriores estudios sugieren que la senescencia celular puede ocurrir en ausencia de SAHF en algunas líneas celulares y la configuración de tratamiento2. En el presente, otros ensayos diseñados específicamente para cada celda de clonogenic muerte puede usarse para aumentar la robustez de las conclusiones de un experimento dado. En tercer lugar, el DAPI ensayo de tinción puede evaluar modos de muerte de las células clonogenic excepto catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular (p. ej., necrosis y autofagia). En cuarto lugar, la utilidad de la DAPI ensayo de tinción como predictor de respuesta tumoral a la radioterapia no ha sido dilucidada en la clínica. Desde este punto de vista, el análisis clonogenic de supervivencia, que evalúa la cantidad total de muerte de las células clonogenic, es superior a la DAPI tinción ensayo porque se ha establecido una correlación entre SF2, la fracción sobreviviente de células irradiadas con 2 Gy Rayos x y la respuesta del tumor a la radioterapia15. Sin embargo, cabe destacar que el análisis de supervivencia de clonogenic no se utiliza ampliamente en la clínica, principalmente debido a la exigencia de un alto grado de especialización y un largo período de tiempo (es decir, 14 días) para adquisición de datos. En comparación, el procedimiento para la DAPI tinción de ensayo es más simple y toma mucho menos tiempo, aproximadamente 3-4 días, para generar resultados. La utilidad de la tinción DAPIensayo como predictor de respuesta tumoral a la radioterapia se probará en la clínica en un futuro cercano.
En Resumen, el DAPI tinción ensayo es un ensayo de paso rentable evaluar simultáneamente los tres modos principales de la muerte celular inducida por IR clonogenic. Este enfoque permite fácilmente la pantalla para los modos de la muerte de las células clonogenic de diversas líneas celulares, ajustes de tratamiento y puntos del tiempo, con el objetivo de dilucidar los mecanismos de muerte celular en las células diana y las condiciones de interés.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos a la Sra. Akiko Shibata para asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón para programas de posgrado líder, cultivo de líderes mundiales en ingeniería y terapéutica de iones pesados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
References
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