Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen von niedriger Frequenz in CtDNA, ER-seq. Diese Methode unterscheidet sich durch seine einzigartige Verwendung von zwei Richtungen Fehlerkorrektur, einen speziellen Hintergrund Filter und effiziente molekulare Aneignung.
Abstract
Die Analyse der zirkulierenden Tumor-DNA (CtDNA) mit Next Generation Sequencing (NGS) ist ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung der klinischen Onkologie geworden. Die Anwendung dieser Methode ist jedoch schwierig wegen seiner niedrigen Empfindlichkeit bei der Analyse der Spur Menge an CtDNA im Blut. Darüber hinaus kann die Methode falsch-positive und negative Ergebnisse aus dieser Sequenzierung und die anschließende Analyse generieren. Um die Machbarkeit und Zuverlässigkeit der CtDNA-Erkennung in der Klinik zu verbessern, stellen wir hier eine Technik, die seltene Mutationen für die Sequenzierung, bereichern seltene Mutation Sequenzierung (ER-Seq) bereichert. ER-Seq unterscheiden eine einzige Mutation aus 1 x 107 Wildtyp Nukleotide, wodurch es ein viel versprechendes Instrument, extrem niedrigen Frequenzen genetische Veränderungen zu erkennen und somit an einem Studium von Krankheit Heterogenicity sehr nützlich sein wird. Aufgrund der einzigartigen Sequenzierung Adapter Ligation ermöglicht diese Methode eine effiziente Rückgewinnung von CtDNA Molekülen, während zur gleichen Zeit Korrektur für Fehler bidirektional (Sense und Antisense). Unsere Auswahl an 1021 kb Sonden bereichert die Messung der Zielregionen, die decken mehr als 95 % der Tumor-bezogene Fahrer Mutationen in 12 Tumoren. Diese kostengünstige und universelle Methode ermöglicht eine einzigartig erfolgreiche Anhäufung von genetischen Daten. Nach effizient Herausfiltern von Hintergrund-Fehler, kann ER-Seq seltene Mutationen genau erkennen. Mit einer Fallstudie, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zeigen Sonde Design, Bibliotheksbau und Ziel DNA-Aufnahme Methoden, während auch einschließlich des Daten-Analyse-Workflows. Zur Durchführung dieser Methode in der Regel dauert 1-2 Tage.
Introduction
Next Generation Sequencing (NGS), ein leistungsfähiges Werkzeug zu untersuchen, die Geheimnisse des Genoms, bieten eine große Menge an Informationen, die genetische Veränderungen offenbaren kann. Die Anwendung der NGS-Analyse in der Klinik ist immer häufiger, vor allem für die personalisierte Medizin geworden. Eines der größten Einschränkungen der NGS, ist jedoch eine hohe Fehlerquote. Obwohl es für Studium vererbte Mutationen geeignet erachtet wird, ist die Analyse von seltenen Mutationen stark eingeschränkt1,2, vor allem bei der Analyse von DNA aus einer "Flüssigbiopsie" gewonnen.
Tumor im Umlauf ist DNA (CtDNA) zellfreie DNA (Blut) in das Blut, das von Tumorzellen vergossen wird. In den meisten Fällen ist die Menge der CtDNA äußerst gering, die die Erkennung und Analyse sehr anspruchsvoll. CtDNA hat jedoch viele attraktive Features: seine Isolation ist minimal invasiv, kann in den frühen Stadien des Tumorwachstums erkannt werden, die CtDNA Ebene reflektiert therapeutische Effizienz und CtDNA enthält DNA-Mutationen in primären und metastatischen Läsionen gefunden 3 , 4 , 5. daher angesichts die rasante Entwicklung der NGS-Technik und Analyse, die Anwendung der CtDNA-Erkennung ist attraktiver geworden.
Haben verschiedene massiv parallelen Sequenzierung Ansätze zur CtDNA Erkennung verwendet worden, aber keiner dieser Ansätze für den routinemäßigen Einsatz in Kliniken aufgrund ihrer Einschränkungen angenommen worden: niedrige Empfindlichkeit, Mangel an Vielseitigkeit und einen relativ hohen Preis6 ,7,8. Zum Beispiel korrigiert duplex Sequenzierung, basierend auf einem eindeutigen Bezeichner-Tag (UID), immer wieder Fehler in der Konsens bidirektional, die meisten Sequenzierung Fehler beheben. Die Machbarkeit dieser Methode ist jedoch aufgrund der hohen Kosten und geringe Auslastung9,10verloren. Ebenso haben CAPP-Seq und seine verbesserte Iteration, CAPP-IDES11,12, größeren Praktikabilität im Blut erkennen, obwohl die Genauigkeit und die Universalität dieser Methoden verbessert werden.
Um den aktuellen Bedarf für genaue CtDNA Detektion und Analyse, entwickelten wir eine neue Strategie, bereichern seltene Mutation Sequenzierung (ER-Seq). Dieser Ansatz verbindet die folgenden: einzigartige Sequenzierung Adapter effizient wiederherstellen CtDNA Moleküle mit bidirektionalen Fehlerkorrektur und die Fähigkeit, eine einzige Mutation von unterscheiden > 1 × 107 Wildtyp Nukleotide; 1021 kb-Sonden, die Messung der Zielregionen zu bereichern, die decken mehr als 95 % der Tumor im Zusammenhang mit Mutationen von 12 Tumoren, einschließlich Lungenkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Brustkrebs, Nierenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs, Schilddrüsen-Krebs, Gebärmutterhalskrebs, Speiseröhrenkrebs und Endometrium-Karzinom (Tabelle 1); und Grunddatenbank screening machen, effizient und einfach zu seltene Mutationen im CtDNA genau zu erkennen.
Um eine Baseline-Datenbank zu erstellen, finden Sie alle Gen-Mutationen durch ER-Seq aus einer Reihe von der gleichen Art von Proben (~ 1000 am Anfang). Diese echte Mutationen ist durch mehrere andere zuverlässige Nachweismethoden und Analyse nachzuweisen. Als nächstes zusammenfassen, das Muster der falschen Mutationen und cluster-die falsche Mutationen um die erste Grundlinie-Datenbank zu erstellen. Weitere falsche Mutationen gefunden von nachfolgenden Sequenzierung Experimente zu dieser Datenbank hinzufügen. Daher wird diese Grunddatenbank dynamische erweiterte Datenbank, die Sequenzierung Genauigkeit deutlich verbessert.
Um Fortschritte bei der Tumor-Diagnose und Überwachung zu fördern, präsentieren wir ER-Seq, eine kostengünstige und praktikable Methode für den Erwerb von allgemeinen Daten. Wir präsentieren eine Fallstudie, die ER-Seq Analyse unterzog sich demonstriert seine Genauigkeit zum Nachweis von seltenen Mutationen und Machbarkeit für den Einsatz in der Klinik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumor Proben und Blutproben wurden nach einem Protokoll genehmigt durch das Ethik Komitee der Peking Universität Menschen erhalten ' s Krankenhaus. Schriftliche Einwilligungserklärung wurden die Patienten mit ihren Proben entnommen. Die Teilnehmer wurden nach folgenden Kriterien überprüft: Weiblich, erweiterte Non-Small Cell Lung Cancer, EGFR p.L858R Mutation durch vorherige Sanger-Sequenzierung, Fortschreiten der Erkrankung nach zwei Sitzung des EGFR zielgerichtete Therapie mit Erlotinib, und ER-Seq, die angewendet wurde, um CtDNA die Ursache des Widerstands zu analysieren und finden neue Ziel Medikamente.
1. DNA-Extraktion aus dem peripheren Blut für Blut und genomischer DNA (gDNA)
- sammeln 10 mL des peripheren Blutes in einem Sammelrohr, invertieren sanft auf und ab 6 - 8 Mal zu mischen. Vermeiden Sie Zelle zu scheren. Blutproben können bis zu 72 Stunden in dem Sammelrohr bei 6-37 ° C gelagert werden.
- Zentrifugieren dem Sammelrohr bei Raumtemperatur für 10 min bei 1600 (±150) x g.
- Übertragung den überstand (Plasma) aus dem Sammelrohr bis vier saubere 2 mL entsprechend gekennzeichnet Zentrifuge Röhrchen mit einem Einweg-Pipettieren ohne zu stören die Pellet-Schicht (weiße Blutkörperchen).
- Transfer1 mL der Zellen mit einer sauberen Einweg Pipettieren bis 2 mL entsprechend gekennzeichnet Zentrifugenröhrchen. Die Zellen können gespeicherte bei-20 ° C oder kälter vor Schritt 1,8 werden.
- Zentrifugieren des Plasmas (aus Schritt 1.3) für 10 min bei 4 ° C und 16000 (±150) x g.
- Übertragen das Plasma zur Reinigung der Zentrifuge Rohre richtig gekennzeichnet als " Plasma ", ~0.1 mL Restvolumen an der Unterseite zur Vermeidung von Kontaminationen zu verlassen. Speichern Sie das Plasma bei-80 ° C bis Schritt 1.7.
- 3 mL Plasma aus Schritt 1.6 verwenden, um Blut zu isolieren (enthält CtDNA) mit einem kommerziell erhältlichen Kit, Anschluss an die Hersteller ' s Anweisungen.
- Einsatz 200 µL der weißen Blutkörperchen aus Schritt 1.3 gDNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit, Anschluss an die Hersteller zu isolieren ' Anweisungen s.
Hinweis: Beide Blut und gDNA können bei-20 ° C vor dem Gebrauch gespeichert werden. - Gelten verschiedene Qualitätskontrollen für Blut und gDNA (Tabelle 2). Führen Sie Qualitätskontrolle durch ein standardisiertes Verfahren zur Bioanalyzer Probe Abbau und/oder gDNA Kontamination zu bestimmen. Peak-Analyse der Qualität der Blut-Extraktion sollte angezeigt werden, ähnlich wie Abbildung 1.
Hinweis: Die Maximalgröße von Blut ist etwa 170 BP. beachten Sie, dass die Erhöhung der Menge an DNA in einer höheren Qualität-Bibliothek für die effektive Erkennung von seltenen Mutationen im Blut führt. Wir empfehlen die Verwendung von mindestens 30 ng Blut (30.000 Exemplare).
2. Vorbereitung der Bibliothek
Hinweis: betreffend Basisbibliothek Konstruktion auf fragmentierte DNA, Blut existiert in Fragmente mit einer Spitze Größe ~ 170 bp und müssen somit nicht fragmentiert werden.
- Fragment des Steuerelements Probe (gDNA) durch Ultraschallbehandlung, 200-250 bp Fragmente zu erhalten.
- Bereiten 1 µg gDNA Samples in 100 µL Tris-EDTA Puffer in einem Rohr sauber Sonorisierung.
- Stellen die Beschallung-Programm als 30 s ein und 30 s aus 12 Zyklen für eine Gesamtmenge von 12 min.
- Nach Beschallung, bestätigen das Produkt (5 µL) enthält 200-250 bp Fragmente durch eine Laufanalyse mit 2 % Agarosegel.
- Alle Fragmentierung Produkte auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen und inkubieren Sie mit 150 µL des magnetischen Beads für 5 min die richtige Fragmente auswählen.
- Den Überstand zu entfernen, indem Sie das Rohr auf einem magnetischen Rack für 30 s.
- Waschen die Perlen mit 200 µL von 80 % Ethanol (frisch zubereitet) mit dem Rohr auf das magnetische Gitter bleiben. Inkubieren Sie für 30 s vor dem Entfernen des Überstands. Einmal zu wiederholen.
- Luft trocknen die Perlen mit dem Rohr Deckel geöffnet während Ihres Aufenthalts auf der magnetischen Zahnstange. Vermeiden Sie pulverisieren Perlen um sicherzustellen, dass die DNA Ziel gut erholt. DNA-Fragmente aus den Perlen indem 32 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8) zu den Perlen, die DNA-Fragmente gefolgt durch Quantifizierung von UV/Vis Spektroskopie zu lösen eluieren.
Hinweis: mindestens 200 ng ist für die folgenden Experimente erforderlich.
- Ende Prep Reaktion
Hinweis: Folgen Sie Hersteller ' s Anleitung und nach Bedarf ändern. Einsatz 30 ng von Blut; und 1 µg gDNA als Kontrolle.- Hinzufügen 7 µL Reaktion Puffer, 3 µL Enzym-Mix, 30 ng von Blut in ein steriles Röhrchen Nuklease-frei, und Gesamtvolumen von 60 µL DdH 2 O hinzufügen. In einem separaten Rohr, die oben genannten Komponenten hinzuzufügen, aber mit 1 µg gDNA statt Blut.
- Mix und inkubieren Sie die Mischung bei 20 ° C für 30 min, gefolgt von 65 ° C für 30 min in einem Thermocycler ohne Deckel erhitzt. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Adapter Ligation
- hinzufügen 30 µL der Ligatur-master-Mix, 1 µL der Ligatur-Enhancer und 4 µL der einzigartigen Sequenzierung Adapter auf die Mischung aus Schritt 2.2.
- Inkubation bei 20 ° C für 15 min in einem Thermocycler ohne Deckel erhitzt.
- Vortex Aufschwemmen der magnetischen Beads und lassen die Perlen bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten vor dem nächsten Schritt fort.
- 87 µL der resuspendierte magnetische Beads zu der zuvor erwähnten Mischung; mischen gut durch Pipettieren rauf und runter und dann bei Raumtemperatur 5 min inkubieren
- Waschen und lufttrocknen die Perlen wie unter Schritt 2.1.
- Das Ziel der DNA aus den Perlen durch Zugabe von 20 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8) eluieren.
- Anreicherung von DNA-Fragmenten mit Adapter ligiert
- fügen Sie 20 µL Adapter ligiert DNA-Fragmente, 5 µL der Index Primer/i7 (2,5 µL Primer-P7 (22:00) und 2,5 µL Primer-P5 (22:00), Sequenzierung Zwecken), 25µL von Bibliothek-Verstärkung-master-Mix und DdH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 50 µL.
- PCR verstärken die Adapter ligiert DNA und thermischen Zyklus wie folgt: erste Denaturierung bei 98 ° C für 45 s, gefolgt von 8 Zyklen (Blut) oder 4 Zyklen (gDNA) des Glühens ° C für 15 s, 65 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s) , und eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 60 s, dann hält die Temperatur um 4 ° c
- Hinzufügen 45 µL des schwebenden magnetischen Beads an die PCR-angereicherten DNA erworbenen Fragmente erhalten.
- Eluieren DNA-Fragmente mit Adaptern in 30 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Bibliothek Qualitätskontrolle
- folgen den Hersteller ' s-Protokoll für das kommerzielle Kit Adapter messen ligiert DNA-Konzentration. Verwenden Sie die Bioanalyzer zur Bestimmung der DNA-Qualität.
3. Gezielte DNA-Erfassung
Hinweis: Target Anreicherung erfolgte mittels eine benutzerdefinierte Sequenz Capture-Sonde, die speziell für eine 1021 kb Bereicherung Zielregion für bekannte Tumor-assoziierten Treiber Mutationen von 12 verschiedene Arten von Tumoren. Änderungen an den Hersteller ' s-Protokoll werden in den folgenden Schritten beschrieben.
- Add 1,5 µg Blockierung des Poolings Bibliotheken (maximale Anzahl von Bibliotheken zum Pool für Blut ist 6, gDNA ist 20) aus Schritt 2, 8 µL P5 Block(100P), 8 µL P7 Block(100P) und 5 µL Kinderbett-1 DNA (1 µg/µL) in ein steriles Röhrchen. Trocknen Sie den Inhalt des Rohres mit einem Vakuum Konzentrator auf 60 festgelegt ° C.
- Hybridize, die die DNA-Erfassung-mit der Bibliothek Sonden.
- Fügen Sie die folgenden Komponenten, um den Schlauch vom Schritt 3.1: 8.5 µL 2 X Hybridisierung Puffer, 2,7 µL Hybridisierung Enhancer und 1,8 µL Nuklease-freie DdH 2 O.
- Mix von oben und unten pipettieren und brüten in einem Thermomixer bei 95 ° C für 10 min.
- Nach Inkubation, sofort hinzufügen 4 µL des Custom-Probe. Inkubieren Sie Proben in einem Thermocycler bei 65 & #176; C mit Deckel erhitzt auf 75 ° C für 4 Std.
- DNA Fragmente Aufnahme
- inkubieren das hybridisierte Ziel DNA mit Streptavidin-Perlen, gefolgt vom Waschen der Perlen um ungebundene DNA zu entfernen. Verwenden Sie das kommerzielle Kit laut Hersteller ' s Anweisungen, um eine endgültige 20 µL resuspendierte Perlen mit aufgenommenen DNA Fragmente.
- Verstärkung der erfassten DNA Fragmente
- führen Sie PCR unter Verwendung der kommerziellen kit mit 2 µM Rückgrat Oligonukleotide, laut Hersteller ' s Anweisungen.
- Wenn der PCR-Reaktion abgeschlossen, 45 µL des suspendierten Perlen das PCR-Produkt direkt hinzufügen und bereichern die verstärkte Ziel DNA-Fragmente durch Elution mit 30 µL 10 mm Tris-HCl (pH 8) an die Perlen gebunden.
- Quantifizieren die DNA-Fragmente mit der Bibliothek Quantifizierung Kit und bestimmen Sie die durchschnittliche Fragmentlänge von Bioanalyzer ( Abbildung 2).
4. Sequenzierung
- Sequenz gemultiplext Bibliotheken mit 75 bp gepaart-End läuft auf einem Benchtop-Sequenzer für 18 h. Gesamtdaten produziert bis zu 60 Gigabyte, 15 G wird für Patientenprobe Blut und 1G für Kontrolle Probe gDNA.
5. Daten-Analyse-Workflows
Hinweis: Abbildung 3 zeigt die allgemeine Arbeit Informationsfluss und Analyseprozess. Daten-Analyse-Parameter und Befehle sind unten aufgeführt.
- Filter minderwertige liest und korrigiert Fehler und Maskierung der UID mit NCfilter.
NCfilter(own)
NCfilter filter - Q 0,5 -l 5 - 0,1 n -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2
realSeq(own)
Python bin/RealRealSeq fq1 MaskUID-1-2 fq2 -o Ausgang Dir -p Präfix -u 4 -s 7 - m 3 -i UidFile-f. - Genom hg19 Referencing (menschliche Genom 19), suchen Sie die Sequenzierung Ergebnisse über die BWA (Version 0.7.12-r1039) Mem und ausrichten mit Genome Analysis Toolkit (GATK) (Version 3.4-46-gbc02625).
BWA Mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
Djava.io.tmpdir=/tmp/-Jar
GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L TargetRegion-Dbsnp bekannt —
AllowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - Ich CancerBam-ich NormalBam
Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
Djava.io.tmpdir=/tmp/-Jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-bekannt Dbsnp
- AllowPotentiallyMisencodedQuals — TargetIntervals Abständen-ich CancerBam-ich NormalBam - Cluster die Duplikate nach der UID und Position der Vorlage-Fragmente, die den Fehler zu korrigieren, Grundlagen von PCR/Sequenzierung eingeführt und ändern die Basis Qualität.
realSeq(own)
Python RealSeq/bin/RealSeq CLUSTER -b unmarkdup_sort_merge.bam - R ChipRegion -o Output_dir -p
Präfix -m 6 - neu ausrichten die gruppierten Duplikate von BWA-mem.
BWA Mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 - führen Sie eine lokale Neuausrichtung gefolgt von eine Rekalibrierung der Basis Qualitätsfaktor mithilfe GATK (Version 3.4-46-gbc02625).
Gesundheitsamt Neuausrichtung: Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g--Djava.io.tmpdir=/tmp/-Jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L TargetRegion-bekannt Dbsnp - AllowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -Ich CancerBam-ich NormalBam
Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g--Djava.io.tmpdir=/tmp/-Jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-bekannt Dbsnp - AllowPotentiallyMisencodedQuals - TargetIntervals Intervalle-ich CancerBam-ich NormalBam
Basis-Qualitätsfaktor Rekalibrierung: Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - Jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L TargetRegion - KnownSites Dbsnp - KnownSites kosmische - AllowPotentiallyMisencodedQuals - Nct 10 - Ich Bam -o GFK Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g--Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-ich Bam - BQSR GFK -o Outbam -R hg19 - Nct 8 - AllowPotentiallyMisencodedQuals - zum SNV (Einzel-Nukleotid-Variante) und INDEL (kleine Einfügungen oder Löschungen) telefonieren, die Genauigkeit der Niederfrequenz-Mutationen wird bestätigt durch die GSR (gute Unterstützung liest) mit beiden vorwärts und rückwärts Strang lesen Paare und Filtration durch Kontrollgruppe (Keimbahn-Mutationen) und Grunddatenbank.
realDcaller(own)
Python RealDcaller -f hg19 - R ChipRegion - C BaselineDB - O -L 2 CancerBam NormalBam -p 30 - Grundlinie Proben als ein Steuerelement für CNV (Kopie Nummer Variation) Berufung verwenden.
NCcnv(own)
Python NCcnv -o Cnvdir -t Tmpdir - R ChipRegion Cnv--Normgt NormalBam--Tumgt CancerBam--Repdb RepeatMarsk - Realigned unzugeordnet, Clips und diskordanten paar liest SV (strukturellen Variationen) anrufen.
NCsv(own)
NCsv -t Tmpdir - R hg19 -o Outputdir Python - X Transkript -w Bwapath -n 4 NormalBam CancerBam
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die 1021 kb-Sonden angereicherten Zielregionen in ER-Seq verwendet Tabelle 1 siehe werden, umfasst mehr als 95 % von Genmutationen in 12 gemeinsamen Tumoren. Die große Auswahl an diese Sonden macht diesen Prozess für eine Mehrheit der Krebspatienten. Darüber hinaus ermöglichen unsere einzigartige Sequenzierung Adapter und Grundlinie Datenbank Screening, seltene Mutationen genau zu erkennen.
Aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften von gDNA und Blut extrahiert aus dem peripheren Blut gibt es eine Reihe von Datenqualität, bestimmt durch die verschiedenen Instrumente und Qualitätskontrollen, die in Tabelle 2dargestellt. Erfolgreich extrahierte Blut sollte eine Maximalgröße von ~ 170 bp, als durch die Bioanalyzer QC analysiert und dargestellt in Abbildung 1angezeigt werden. Große Fragmente zeigen Belastung aus genomischer DNA, die nicht in das Endprodukt erscheinen sollte. Aus diesem Patientenprobe extrahierte DNA war von ausreichender Qualität und Menge für ER-Seq (Blut - 42,6 ng; gDNA - 3.426 µg).
Ziel DNA-Erfassung mit einem benutzerdefinierten Test wurde dann mittels PCR verstärkt. Die durchschnittliche Fragmentgröße wurde durch die Bioanalyzer und Vertreter Daten eines Patienten Blut in Abbildung 2A zeigte einen Höhepunkt rund ~ 320 bewertet bp und eine einzigartige Band auf Agarosegel. gDNA sollte als ein Abstrich auf einem Agarosegel, erscheinen, wie in Abbildung 2 bdargestellt. Die Qualitäten beider Bibliotheken waren akzeptabel für die anschließende Sequenzierung.
Nach der Sequenzierung wurde die Daten in Reihenfolge nach den Arbeitsablauf in Abbildung 3 banalysiert. Um die Vorteile unserer ER-Seq im Vergleich zu der traditionellen Methode zu veranschaulichen, haben wir beide mit der gleichen Probe Analysen durchgeführt. Ergebnisse aus beiden Analysen sind in Tabelle 3 und Tabelle 4dargestellt. Wir haben gezeigt, dass ER-Seq Abdeckung Tiefe um 23 verbessert % im Vergleich zur traditionellen Methode (Tabelle 3, 3214,3 liest in ER-Seq Vs 2475 mal gelesen in traditionellen Analyse), die durch seine effiziente Rückgewinnung der Blut-Moleküle, so stark war Verbesserung der Analysis von seltenen Mutationen. Es ist auch klar, dass die einzigartige Sequenzierung Adapter verwendet in ER-Seq einfache Differenzierung der Natur- und PCR-induzierte Duplikationen ermöglichen (Tabelle 3, 0 PCR induzierte dupliziert in ER-Seq lesen). Darüber hinaus fanden wir in den aufrufenden Ergebnissen, dass Analyse basierend auf ER-Seq 100 % im Einklang für EGFR-p.L858R-Erkennung war und die Häufigkeit der Erkennung als ein bisschen höher (2,7 % vs. 1,2 %) war im Vergleich zu herkömmlichen Analyse (Tabelle 4). Wichtig ist, aktiviert ER-Seq-Analyse die Erkennung von anderen relativ niederfrequenten Mutationen, einschließlich EGFR p.T790M (Variation Frequenz 0,53 %) (Tabelle 4), und dies wurde von traditionellen Analyse aufgrund hoher Hintergrundgeräusche nicht erkannt.
Abbildung 1. Repräsentative QC Ergebnis der erfolgreich isoliert Blut
Für den linken Graphen die x-Achse zeigt Fragmentgröße (bp) und die y-Achse zeigt relative Fluoreszenz Einheiten (FU). Die primäre Größe von Blut ist ~ 170 bp und es gibt keine große Fragmente von Kontamination. Eine simulierte Elektrophorese-Gel wird auf der rechten Seite angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Beispiel für Bibliotheken QC analysiert.
Die x-Achse zeigt die Fragmentgröße (bp) und die y-Achse zeigt die relative Fluoreszenz-Einheiten (FU). Eine simulierte Elektrophorese Gel wurde auf der rechten Seite von jedem Diagramm gezeigt. (A) Patienten Blut Probe zeigte eine scharfe Spitze, nachdem es mit Adaptern verstärkt wurde. (B) gDNA Kontrollprobe zeigten gleichmäßig verteilte Fragmente mit keine scharfen Spitze und keine Voreingenommenheit gegenüber einer Seite. Beide Proben waren akzeptabel für die anschließende Sequenzierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. ER-Seq Arbeitsablauf.
(A) allgemeine Arbeitsablauf. (B) Daten-Analyse-Arbeitsablauf. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| 2735 Exons aus der Exon-Region 70 Gene | |||||||||
| ABL1 | ABL2 | AKT1 | AKT2 | AKT3 | ALK | APC | AR | ARAF | ATM |
| ATR | AURKA | AURKB | AXL | BAP1 | BCL2 | BRAF | BRCA1 | BRCA2 | BRD2 |
| BRD3 | BRD4 | BTK | C11orf30 | C1QA | C1S | CBL | CCND1 | CCND2 | CCND3 |
| CCNE1 | CD274 | CDH1 | CDK13 | CDK4 | CDK6 | CDK8 | CDKN1A | CDKN1B | CDKN2A |
| CDKN2B | CHEK1 | CHEK2 | CRKL | CSF1R | CTNNB1 | DDR1 | DDR2 | DNMT3A | EGFR |
| EPHA2 | EPHA3 | EPHA5 | ERBB2 | ERBB3 | ERBB4 | ERCC1 | ERG | ESR1 | EZH2 |
| FAT1 | FBXW7 | FCGR2A | FCGR2B | FCGR3A | FGFR1 | FGFR2 | FGFR3 | FGFR4 | FLCN |
| FLT1 | FLT3 | FLT4 | FOXA1 | FOXL2 | GAB2 | GATA3 | GNA11 | GNAQ | GNAS |
| HDAC1 | HDAC4 | HGF | HRAS | IDH1 | IDH2 | IGF1R | IL7R | ||
Tabelle 1. 1021 kb Sonden angereicherten Zielregionen.
Diese Regionen enthalten: 2735 Exons von 170 Gene; Introns, Promotor und Haltepunkt Regionen von 24 Gene; 1122 Exons von 847 Verwandten Genen. Diese decken über 95 % des Tumors Fahrer Mutationen und Ziel Mutationsstellen beziehen die 12 häufigsten Tumore (Lungenkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Brustkrebs, Nierenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs, Schilddrüsenkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Speiseröhrenkrebs und Endometrium-Karzinom).
| DNA | Ergebnis | Hinweis | Ideal-Sortiment |
| Blut | Fragmentgröße | Kennung des DNA-Fragments Verteilung | 168bp±20(a) |
| Konzentration | Eine genauere Quantifizierung der DNA | Insgesamt Blut ≥30ng(b) | |
| gDNA | A260/A230 | Identifizierung von chemischen Verunreinigungen (z. B. Ethanol) | 1,50-2.2 |
| A260/A280 | Identifikation von Protein Verunreinigungen | 1,60 – 2,2 | |
| Konzentration | DNA-Quantifizierung | Insgesamt gDNA > 3ug |
Tabelle 2. Analyse von Blut und gDNA extrahiert aus dem peripheren Blut.
Die Maximalgröße von Blut ist um 170Bp. Qualitätskontrolle durchgeführt werden, durch ein standardisiertes Verfahren zur 2100 Bioanalyzer Abbau und/oder gDNA Kontamination der Probe zu bestimmen. Peak-Analyse der Qualität der Blut-Extraktion sollte ähnlich wie Abbildung 1angezeigt werden. Hinweis, die DNA-Menge erhöht führt eine Bibliothek mit einer höheren Qualität für den effektiven Nachweis von seltenen Mutationen im Blut. Wir empfehlen die Verwendung von mindestens 30 ng Blut (30.000 Exemplare).
Tabelle 3. Die QC ER-Seq Informationsanalyse und traditionellen Informationsanalyse.
Das dunkle Grau Highlight zeigt eine Erhöhung der Reichweite Tiefe in ER-Seq im Vergleich zu traditionellen Methoden aufgetreten ist; ein leichtes grau Highlight zeigt keine PCR induzierte duplizierten lesen in ER-f Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| Gen | Chr | Start | Ende | cHGVS | pHGVS | Funktion | caseAltIsHot | ER-Seq var_freq | Traditionelle var_freq |
| TP53 | 17 | 7577534 | 7577535 | c.746G > T | p.R249M | Missense | HighFreq | 0.0400 | 0.0378 |
| EGFR | 7 | 55259514 | 55259515 | c.2573T > G | p.L858R | Missense | Umsetzbare | 0.0270 | 0.0120 |
| ATM | 11 | 108203618 | 108203619 | c.7919delC | p.T2640Ifs*6 | frameshift | ND | 0.0169 | 0.0180 |
| PTCH1 | 9 | 98221917 | 98221918 | c.2851G > T | p.D951Y | Missense | ND | 0.0154 | 0.0260 |
| EGFR | 7 | 55249070 | 55249071 | c.2369C > T | p.T790M | Missense | Umsetzbare | 0.0053 | ——(0.0013) |
| RB1 | 13 | 49039151 | 49039152 | c.2230A > T | p.I744F | Missense | ND | 0. 0036 | ——(0.0014) |
Tabelle 4. Berufung aus ER-Seq Informationen Analysist und traditionelle Informationsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Existenz zirkulierender Tumor-DNA (CtDNA) wurde vor mehr als 30 Jahren entdeckt, aber die Anwendung von CtDNA Analysen noch nicht routinemäßig in der klinischen Praxis ist. Interesse an der praktischen Anwendung von CtDNA Methoden hat mit der Entwicklung von Technologien zur CtDNA Erkennung und Analyse erhöht. Tumor-Überwachung mit CtDNA bietet einen minimal-invasive Ansatz für die Bewertung der mikroskopischen Resterkrankung, Reaktion auf Therapie und molekulare Tumor-Profile unter dem Hintergrund der Tumor Evolution und intratumorale Heterogenität13, 14. Verbesserungen in der Sensitivität und Spezifität der Analyse werden alle diese Anwendungen15,16erleichtern.
In diesem Manuskript führten wir ER-Seq, eine viel versprechende Methode zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit CtDNA, mit einem NSCLC-Fall als Beispiel. Verglichen mit herkömmlichen Analyse, verbessert die Anwendung unserer einzigartigen Sequenzierung Adapter in ER-Seq deutlich, seine Sensitivität und Spezifität, angezeigt durch eine Erhöhung der Abdeckung Tiefe und eine Fähigkeit zur Erkennung von Niederfrequenz-Mutationen (z. B. EGFR p. T790M (0,53 %)). Die Existenz eines T790M in diesem Patientenprobe möglicherweise ein beitragender Faktor zum Erlotinib Widerstand und gaben Einblick, wie dieser Patient, schlägt die Verwendung von ein Dritterzeugung EGFR-Inhibitor spezifische für T790M, z. B. AZD929117-20 besser zu behandeln. Ein weiterer kritischer Punkt im ER-Seq, die zu ihrer Sensitivität und Spezifität beiträgt ist die Grundlinie Datenbank-Screening, das die präzise Erkennung von Niederfrequenz-Mutationen in CtDNA erleichtert durch Hintergrundgeräusche herausfiltern.
Obwohl ER-Seq viele Vorteile, die es besser als traditionelle Methoden machen hat, gibt es noch einige Herausforderungen, die überwunden werden müssen. Eine der großen Herausforderungen für ER-Seq ist das extrem niedrige Niveau der CtDNA im Blut. Für diese Niederfrequenz-Mutationen ist der Erwerb von ausreichend Vorlage CtDNA kritisch. Unsere einzigartige Adapter erhöhen deutlich die Rückführungsrate des CtDNA, obwohl sie noch verbessert werden müssen. Eine weitere Herausforderung für ER-Seq und für alle anderen Sequenzierung Techniken, ist die Einschränkung der Berichterstattung der Zielregionen. Unsere ausgewählten 1021 kb-Sonde bereichert Regionen, die etwa 95 % der Tumor im Zusammenhang mit Mutationen zu decken, sind umfassender, im Vergleich zu anderen Methoden von klein-Flugzeug21,22,23. Jedoch als Tumor Heterogenität gut anerkannt hat und immer mehr Tumor Biomarker entdeckt worden, bereichert die relative Ergiebigkeit unserer Sonden Regionen sinkt. Um besser als Instrument zur Früherkennung und Überwachung von Krankheiten von Tumorpatienten zu dienen, sind umfangreichere Sequenzierung und Analyse Techniken erforderlich. Derzeit setzt ER-Seq noch auf ein hohes Volumen an Daten zur Erkennung von Niederfrequenz-Mutationen. Weitere Verbesserung der Datennutzung wäre günstig für die Anwendung des ER-seq.
Wie oben besprochen, gibt es viele Einschränkungen verbunden mit ER-Seq. Unsere einzigartigen Analysetechnik hat jedoch noch viele Vorteile im Vergleich zu anderen Top-Ranking-Methoden in diesem Bereich. Die vor- und Nachteile dieser Technik verdienen weitere Forschung. Das Potenzial des ER-Seq für die routinemäßige klinische Anwendung wird für klinische Ärzte, bietet ihnen ein leistungsfähiges Werkzeug zur diagnose von Tumoren und Monitor Tumor Dynamik und ansprechen auf die Therapie von großer Bedeutung sein. Neuartige Mutationen im Zusammenhang mit Widerstand gegen die konventionelle und gezielte Therapie gefunden durch unsere Analyse könnten neue Wege für die Behandlung von Krebspatienten mit fortgeschrittener Erkrankung bieten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von Geneplus – Beijing Institute unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H.
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
