Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

Xiaoxing Lv; Meiru Zhao; Yuting Yi; Lucheng Zhang; Yanfang Guan; Tao Liu; Ling Yang; Rongrong Chen; Jianhui Ma; Xin Yi

doi:10.3791/56342

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Methodenartikel

Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

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DOI:

10.3791/56342

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24. August 2017

Xiaoxing Lv¹ , Meiru Zhao¹ , Yuting Yi¹ , Lucheng Zhang¹ , Yanfang Guan¹ , Tao Liu¹ , Ling Yang¹ , Rongrong Chen¹ , Jianhui Ma¹ , Xin Yi¹

¹Geneplus-Beijing Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen von niedriger Frequenz in CtDNA, ER-seq. Diese Methode unterscheidet sich durch seine einzigartige Verwendung von zwei Richtungen Fehlerkorrektur, einen speziellen Hintergrund Filter und effiziente molekulare Aneignung.

Zusammenfassung

Die Analyse der zirkulierenden Tumor-DNA (CtDNA) mit Next Generation Sequencing (NGS) ist ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung der klinischen Onkologie geworden. Die Anwendung dieser Methode ist jedoch schwierig wegen seiner niedrigen Empfindlichkeit bei der Analyse der Spur Menge an CtDNA im Blut. Darüber hinaus kann die Methode falsch-positive und negative Ergebnisse aus dieser Sequenzierung und die anschließende Analyse generieren. Um die Machbarkeit und Zuverlässigkeit der CtDNA-Erkennung in der Klinik zu verbessern, stellen wir hier eine Technik, die seltene Mutationen für die Sequenzierung, bereichern seltene Mutation Sequenzierung (ER-Seq) bereichert. ER-Seq unterscheiden eine einzige Mutation aus 1 x 10⁷ Wildtyp Nukleotide, wodurch es ein viel versprechendes Instrument, extrem niedrigen Frequenzen genetische Veränderungen zu erkennen und somit an einem Studium von Krankheit Heterogenicity sehr nützlich sein wird. Aufgrund der einzigartigen Sequenzierung Adapter Ligation ermöglicht diese Methode eine effiziente Rückgewinnung von CtDNA Molekülen, während zur gleichen Zeit Korrektur für Fehler bidirektional (Sense und Antisense). Unsere Auswahl an 1021 kb Sonden bereichert die Messung der Zielregionen, die decken mehr als 95 % der Tumor-bezogene Fahrer Mutationen in 12 Tumoren. Diese kostengünstige und universelle Methode ermöglicht eine einzigartig erfolgreiche Anhäufung von genetischen Daten. Nach effizient Herausfiltern von Hintergrund-Fehler, kann ER-Seq seltene Mutationen genau erkennen. Mit einer Fallstudie, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zeigen Sonde Design, Bibliotheksbau und Ziel DNA-Aufnahme Methoden, während auch einschließlich des Daten-Analyse-Workflows. Zur Durchführung dieser Methode in der Regel dauert 1-2 Tage.

Einleitung

Next Generation Sequencing (NGS), ein leistungsfähiges Werkzeug zu untersuchen, die Geheimnisse des Genoms, bieten eine große Menge an Informationen, die genetische Veränderungen offenbaren kann. Die Anwendung der NGS-Analyse in der Klinik ist immer häufiger, vor allem für die personalisierte Medizin geworden. Eines der größten Einschränkungen der NGS, ist jedoch eine hohe Fehlerquote. Obwohl es für Studium vererbte Mutationen geeignet erachtet wird, ist die Analyse von seltenen Mutationen stark eingeschränkt¹^,², vor allem bei der Analyse von DNA aus einer "Flüssigbiopsie" gewonnen.