Dit protocol bestudeert efficiënt zoogdieren celdeling in 3D collageen matrices door de integratie van de synchronisatie van de celdeling, toezicht op divisie gebeurtenissen in 3D-matrices met behulp van live-cel beeldvormende techniek, time-resolved confocal reflectie microscopie en kwantitatieve analyse van beeldvorming.
De studie van hoe zoogdieren celdeling wordt geregeld in een 3D omgeving blijft grotendeels onontgonnen ondanks de fysiologische relevantie en therapeutische betekenis. Mogelijke redenen voor het ontbreken van exploratie zijn de experimentele beperkingen en technische uitdagingen die de studie van celdeling in 3D cultuur inefficiënt. Hier beschrijven we een imaging gebaseerde methode om te studeren efficiënt zoogdieren celdeling en cel-matrix interacties in 3D collageen matrices. Cellen die zijn gelabeld met de fluorescerende H2B worden gesynchroniseerd met behulp van de combinatie van thymidine blokkeren en nocodazole behandeling, gevolgd door een mechanische schok-off techniek. Gesynchroniseerde cellen worden vervolgens ingebed in een 3D collageen-matrix. Celdeling wordt gecontroleerd met behulp van live-cel microscopie. De vervorming van de collageenvezels tijdens en na de celdeling, die een indicator van cel-matrix interactie is, kan worden gecontroleerd en gekwantificeerd aan de hand van kwantitatieve confocal reflectie microscopie. De methode biedt een efficiënte en algemene aanpak om te bestuderen van zoogdieren celdeling en cel-matrix interacties in een fysiologisch relevante 3D-omgeving. Deze aanpak biedt nieuwe inzichten in de moleculaire basis van de ontwikkeling van normale weefsel en ziekten, maar voorziet ook in het ontwerp van nieuwe diagnostische en therapeutische benaderingen.
Cel mitose is een kritieke gebeurtenis in het cellulaire leven, de verordening die cruciale rol bij weefsel- en orgaanbanken ontwikkeling speelt. Abnormale mitose is betrokken bij de natuurlijke genetische variaties, menselijke veroudering processen en de progressie van kanker1,2,3,4,5. Het toegenomen tempo van de verspreiding van tumorcellen in vergelijking met normale cellen is één van de kenmerken van de kanker, ondanks het feit dat cel gedragingen vrij heterogene tussen verschillende soorten tumoren en zelfs patiënten zijn. Ondanks veelbelovende preklinische resultaten, hebben sommige nieuw ontwikkelde antimitotische geneesmiddelen niet aangetoond effectief te zijn in klinische proeven6,7,8,9,10 ,11. De relevantie van experimentele en preklinische modellen moet worden beschouwd. Vele soorten normale zoogdier- en kanker cellen verdelen in driedimensionale (3D) matrices, zoals fibroblasten en cellen van de fibrosarcoma in de collageen-rijke bindweefsels 3D metastatische kankercellen in de 3D stromale extracellulaire matrix (ECM). Echter, de overgrote meerderheid van zoogdieren celdeling experimenten en testen zijn uitgevoerd op cellen gekweekt op tweedimensionale (2D) substraten. Een gemanipuleerde 3D matrix kan beter recapituleren de microstructuur, mechanische eigenschappen en biochemische signalen voor de 3D ECM van beide normale en pathologische weefsels12,13,14, 15,16,17.
De studie van hoe zoogdieren celdeling wordt geregeld in 3D omgevingen blijft grotendeels onontgonnen ondanks de zowel de fysiologische relevantie en het belang van de therapeutische18,19. Mogelijke redenen zijn de technische problemen en experimentele uitdagingen in verband met het bestuderen van de celdeling in 3D-matrices. Cel mitose vormt een kleine tijdelijke breuk in de celcyclus20. Eerdere werkzaamheden is gebleken dat het tempo van de proliferatie van veel cellen van zoogdieren, zoals menselijke borst adenocarcinoom MCF-7, menselijke Osteosarcoom U2OS en menselijke lever HepG2, is veel lager in 3D-matrices in vergelijking met hun tegenhangers op 2D substraten21, 22. Bovendien verplaatsen cellen ingebed in 3D-matrices in en uit focus tijdens live-cel imaging. Al deze factoren bijdragen tot de extreem lage efficiëntie van het vastleggen van de celdeling gebeurtenissen in 3D cultuur met behulp van beeldvormende technieken.
Interacties tussen de ECM en cellen spelen een belangrijke rol bij het reguleren van celdelingen. Hier beschrijven we een aanpak efficiënt studeren zoogdieren celdeling in 3D collageen matrices. De methode omvat de opname van de mitotische markeringen aan de cellen, synchronisatie van celdeling, evenals de controle van de divisie gebeurtenissen in 3D-matrices met behulp van de live-cel beeldvormende techniek, time-resolved confocal reflectie microscopie, en kwantitatieve analyse van beeldvorming. Fluorescentie-geëtiketteerden Histon eiwit H2B is het eerst geïntroduceerd in de cellen als een marker te differentiëren mitotische interfase cellen. De cellen worden vervolgens gesynchroniseerd met de combinatie van thymidine blokkeren en nocodazole behandeling, gevolgd door een mechanische schok-off techniek. Gesynchroniseerde cellen worden vervolgens rechtstreeks ingekapseld in 3D collageen matrices. Celdeling gebeurtenissen van meerdere cellen worden gecontroleerd efficiënt met lage-vergroting time-lapse live-cel imaging. De vervorming van collageenvezels, die een indicator van cel-matrix interactie is, wordt gecontroleerd met behulp van de reflectie van de confocal microscopie bij high-vergroting.
We hebben eerder deze techniek gebruikt om te controleren en te kwantificeren van cel-matrix interactie vóór, tijdens en na de mitose van twee metastatische kanker cellijnen, menselijke invasief ductaal carcinoma MDA-MB-231 en menselijke fibrosarcoma HT1080 cellen, in 3D collageen matrices19. De hier gepresenteerde methoden bieden een efficiënte en algemene aanpak om te studeren zowel zoogdieren celdeling in een 3D omgeving en cel-matrix interacties. De MDA-MB-231 cellenvariëteit wordt gebruikt als een voorbeeld in het papier. Dit protocol biedt nieuwe inzichten in de moleculaire basis van de ontwikkeling van normale weefsel en ziekten, en kan ook leiden tot het ontwerp van nieuwe diagnostische en therapeutische benaderingen.
De eerdere studie van celdeling in 3D was niet efficiënt als gevolg van experimentele beperkingen en technische uitdagingen18,19. De kritische stappen voor efficiënte studie van zoogdieren celdeling in 3D collageen matrices zijn: (1) de opneming van fluorescentie-geëtiketteerden mitotische markeringen aan de cellen; (2) de synchronisatie van de afdeling van de cel; en (3) de bewaking van de divisie gebeurtenissen in 3D-matrices met behulp van live-cel beeldvor…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de NIH grants R01CA174388 en U54CA143868. De auteurs wil erkennen de PURA award van de Johns Hopkins University voor ondersteuning van Wei-tong Chen. Dit materiaal is gebaseerd op werk gesteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder Grant nr. 1232825.
Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
DMEM | Corning | 10-013-CV | |
DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Fugene HD | Promega | E2311 | |
Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
Collagen | Corning | 354236 | |
NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |