Summary
Этот протокол эффективно исследования млекопитающих деление клеток в 3D Коллагеновые матрицы путем включения синхронизации деления клеток, мониторинг событий отдел в 3D матрицы, методом клеток изображений, время решена конфокальный отражение микроскопии и количественный анализ изображений.
Abstract
Изучение как млекопитающих клеточного деления регулируется в 3D окружающей среды остается в значительной степени неизученными, несмотря на его физиологическое значение и терапевтическое значение. Возможные причины отсутствия разведки являются экспериментальные ограничения и технические проблемы, которые делают исследования клеточного деления в 3D культуре неэффективно. Здесь мы описываем метод на основе изображений для эффективного изучения млекопитающих деление клеток и клеток матрица взаимодействий в 3D Коллагеновые матрицы. Клетки, помечены флуоресцентные H2B синхронизируются с помощью комбинации тимидина блокировки и Нокодазол лечения, следуют механическая техника трясти off. Синхронизированные клетки затем внедряются в 3D коллагеновой матрицы. Деление клеток контролируется с помощью микроскопии клеток. Деформации волокон коллагена во время и после деления клеток, которая является показателем взаимодействия клеток матрица, может контролироваться и количественно с помощью количественного отражения конфокальная микроскопия. Этот метод предоставляет эффективный и общий подход для изучения млекопитающих деление клеток и клеток матрица взаимодействия в физиологически соответствующих 3D-среде. Этот подход не только обеспечивает Роман понимание молекулярные основы развития нормальной ткани и болезней, но также позволяет для разработки новых диагностических и терапевтических подходов.
Introduction
Митоз клеток является критически важных событий в клеточных жизни, регулирование которых играет решающую роль в развитии тканей и органов. Аномальные митоз причастны естественных генетических вариаций, процессы старения человека и прогрессирование рака1,2,3,4,5. Возросшими масштабами распространения клеток опухоли, по сравнению с нормальной клетки является одним из отличительных признаков рака, несмотря на тот факт, что поведение клеток весьма неоднородны, среди различных типов опухолей и даже среди пациентов. Несмотря на многообещающие результаты доклинических некоторых недавно разработанных antimitotic препаратов не показали, чтобы быть эффективным в клинических испытаниях6,,78,9,10 ,11. Значимость экспериментальные и доклинических моделей должна рассматриваться. Многие типы нормальных клеток млекопитающих и рак разделить в трехмерной (3D) матрицы, например фибробластов и фибросаркома клетки в коллагена-богатые 3D соединительной ткани и метастатическим раком клетки в 3D стромальные внеклеточного матрикса (ECM). Однако подавляющее большинство млекопитающих деление клеток экспериментов и анализы были проведены на клетки культивировали на двухмерный (2D) подложках. Инженерии 3D матрицы может лучше пилки микроструктуры, механические свойства и биохимические сигналов 3D ECM как нормальной и патологической ткани12,13,14, 15,16,17.
Изучение как млекопитающих клеточного деления регулируется в 3D средах остается в значительной степени неизученными несмотря на физиологические актуальность и терапевтическое значение18,19. Возможные причины включают в себя технические трудности и экспериментальной проблемы, связанные с изучением деление клеток в 3D матрицы. Митоз клеток является небольшая временная в весь цикла клетки20. Предыдущие работы показал, что темпы распространения многих клеток млекопитающих, например аденокарциномы молочной железы человека MCF-7, человека остеосаркома U2OS и человеческой печени в 3D матрицы, по сравнению с их коллегами на 2D субстратов21, HepG2, гораздо меньше 22. Кроме того клетки, встроенных в 3D матрицы въезжать фокус во время клеток. Все эти факторы способствуют чрезвычайно низкая эффективность захвата события деление клеток в культуре 3D, используя методы визуализации.
Взаимодействие между ECM и клетки играют решающую роль в регулировании клеточных делений. Здесь мы опишем подход для эффективного изучения млекопитающих деление клеток в 3D Коллагеновые матрицы. Метод включает включение митотическая маркеров для клетки, синхронизации деления клеток, а также мониторинг событий отдел в 3D матрицы с использованием клеток Тепловизионная техника, время решена конфокальный отражение микроскопии, и количественный анализ изображений. Флуоресцировани обозначенного гистоновых белков H2B впервые введен в клетки как маркер дифференцировать митотическая и межфазное клетки. Затем ячейки синхронизируются с помощью комбинации тимидина блокировки и Нокодазол лечения, следуют механическая техника трясти off. Синхронизированные клетки непосредственно инкапсулированы в 3D Коллагеновые матрицы. Деление клеток события нескольких ячеек контролируются, эффективно используя низким увеличение покадровой клеток изображений. Деформации волокон коллагена, который является показателем взаимодействия клеток матрица, контролируется с помощью микроскопии конфокальный отражения в высокого увеличения.
Ранее мы использовали этот метод для мониторинга и количественной оценки взаимодействия клеток матрицы до, во время и после митоза двумя метастатического рака клеточных линий, человека инвазивной протоковой карциномы MDA-MB-231 и человека фибросаркома HT1080 клеток, в 3D коллагена матрицы19. Представленные здесь методы обеспечивают эффективный и общий подход к изучить оба млекопитающих деление клеток в 3D окружающей среды и клеток матрица взаимодействия. MDA-MB-231 клеточная линия используется в качестве примера во всем документе. Этот протокол обеспечивает Роман понимание молекулярные основы развития нормальной ткани и болезней, а также может позволить для разработки новых диагностических и терапевтических подходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол следует указаниям из Хоумвуд институционального обзора Совет (HIRB).
1. стабильная выражение H2B-mCherry как маркер для клетки митоз
-
Поколение лентивирусные частиц из человеческих эмбриональных почек 293T (ГЭС 293T) клетки
- Пластина ГЭС 293T клеток на 10 см блюдо культуры клеток при плотности 5 х 106 клеток/блюдо в среде культуры клеток (Дульбекко орла изменения среднего (DMEM) содержащий высокий глюкозы (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 1% пенициллин стрептомицином (Pen/Strep)). Инкубируйте в течение 24 ч при 37 ° C и 5% двуокиси углерода (CO2). Желаемый confluency клеток в день трансфекции-около 70-80%.
Примечание: ГЭС 293T клетки используются здесь для создания вирусных частиц, которые будут использоваться позже передавать MDA-MB-231 клетки для создания линии клетки, стабильно выражая H2B-mCherry. Убедитесь, что ячейки равномерно распределены по всей пластине. Добавление ячеек падение мудрый к пластине, и осторожно двигаться пластину и обратно может помочь в равномерное распределение. Клетки также может быть заполнена в пластин или фляги других размеров, которые приведут к коллекции различных объемов вирусных частиц. - Transfect ГЭС 293T клетки, с помощью трансфекции реагента с тремя плазмид (лентивирусные вектор, ЦМВ ΔR 8,91 и pMDG-VSVG). Плазмиды, кодирование H2B-mCherry клонирован в лентивирусные вектор с phosphoglycerate киназы промоутер (ПГК). ЦМВ ΔR 8,91 содержит три необходимых ВИЧ гены, кляп, Поли rev. pMDG VSVG содержит ген конверт VSV-G.
Примечание: Существует несколько трансфекции агентов, чтобы выбрать из.- Разрешить флакона трансфекции реагента до комнатной температуры (RT) перед использованием. Инвертирование или вихревого флакона кратко.
- Смесь 16 мкг ДНК, которая состоит из 6 мкг H2B-mCherry плазмиды, 8 мкг ЦМВ ΔR 8,91 и 2 мкг pMDG-VSVG, в 1 мл сокращение сыворотке СМИ. Инкубируйте на RT на 5 мин.
Примечание: Количество и соотношение трех векторов разнообразны и оптимизированы для передачи различных лентивирусные векторы. - 48 мкл (соотношение 1:3 ДНК: трансфекции реагент) трансфекции реагента в выше решение ДНК и затем Инкубируйте на RT для по крайней мере 15 минут.
Примечание: Соотношение ДНК против трансфекции реагент разнообразны и оптимизированы для передачи различных лентивирусные векторы. Убедитесь, что трансфекции реагент не связаться стороне пластиковых пробирок 1.5 мл. - Добавьте ДНК липидов комплексное решение, сделанные в шаге 1.1.2.3 каплям в клетки. Аккуратно водоворот пластина обеспечить равномерное распределение комплекса в пластине.
- Примерно в 6 ч после трансфекции, аспирационная среднего и добавить свежие клетки культуры среднего (DMEM с высоким глюкозы (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% FBS и 1% перо/Strep).
- Урожай супернатанта 24, 48 и 72 ч после transfection. Заменить средство после каждого урожая (DMEM, 4,5 г/Л глюкозы, пируват натрия, с 10% FBS и 1% перо/Strep).
- Фильтр частицы лентивирусные через 0.45 мкм фильтр для удаления сотовой мусора. Кроме того уменьшается супернатант выделить ячейки мусор. Супернатант может использоваться для трансдукции сразу, или может храниться при температуре-80 ° C.
- Пластина ГЭС 293T клеток на 10 см блюдо культуры клеток при плотности 5 х 106 клеток/блюдо в среде культуры клеток (Дульбекко орла изменения среднего (DMEM) содержащий высокий глюкозы (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 1% пенициллин стрептомицином (Pen/Strep)). Инкубируйте в течение 24 ч при 37 ° C и 5% двуокиси углерода (CO2). Желаемый confluency клеток в день трансфекции-около 70-80%.
-
Поколения клетки линии стабильно выражая H2B-mCherry
Примечание: Этот Протокол описан в деталях для клеток MDA-MB-231. Перед использованием в эксперименте, карцинома молочной железы человека клетки MDA-MB-231 (физических наук онкологический центр, низ) культивируемых в среде DMEM, содержащие высокие глюкоза (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% FBS и 1% перо/воспаление.- Пластина MDA-MB-231 клетки на плотность 1 х 105 клеток в культуре блюдо 35 мм.
Примечание: Плотность покрытия для различных клеточных линий должны быть оптимизированы и поэтому могут отличаться от оптимальной плотности для клеток MDA-MB-231. - 24 ч после покрытия клетки, добавьте 1 mL вируса и 1 мл свежей среды (DMEM, высокая глюкозы (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% FBS и 1% перо/Strep).
- Инкубируйте клетки для периода времени 6 ч для ночевки.
Примечание: Количество вируса и время инкубации должны быть оптимизированы для различных клеточных линий. Например, если ячейки не выглядеть здоровым через несколько часов после добавления вируса, используйте 1 мл вируса и 2 мл свежей среды (DMEM, высокая глюкозы (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% FBS и 1% перо/Strep) для шага 1.2.2. Можно также уменьшить время инкубации в шаге 1.2.3. - Аспирационная среднего и добавляют 10 мл свежей среды (DMEM, высокие глюкоза (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% FBS и 1% перо/Strep). Инкубируйте между 24-72 ч при 37 ° C и 5% CO2.
- Проверьте в выражении H2B-mCherry в клетках с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
Примечание: Если трансдукции эффективность низка в клетках, может увеличить объем вирус на шаге 2.2 и время инкубации на шаге 2.3.
- Пластина MDA-MB-231 клетки на плотность 1 х 105 клеток в культуре блюдо 35 мм.
2. Синхронизация клеток, стабильно выражая H2B-mCherry
- Плита клетки на 50-60% confluency, то есть плита 2 x 104 MDA-MB-231 клеток в каждой скважине 24-ну плиты.
- Инкубируйте культуры при 37 ° C и 5% CO2 на 24 часа.
- Заменить среднего роста с 0,5 мл среды (DMEM, высокая глюкозы (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% FBS и 1% перо/Strep) содержащий тимидина 2 мм и оставляют в инкубаторе для 24 h.
Примечание: Клетки подвергаются тимидина задерживаются на этапе роста клеток (G1) / ДНК синтеза (S) перехода и в S-фазе за счет ингибирования синтеза ДНК. Время инкубации следует разнообразны и оптимизирована для различных клеточных линий. - Релиз клетки от воздействия тимидина промывкой их-фосфатный буфер (PBS) три раза. Затем, инкубации клеток в нормальной клеточной культуры среднего (DMEM, высокие глюкоза (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% FBS и 1% перо/Strep) за 5 ч.
Примечание: Выпуск клетки от воздействия тимидина позволяет клетки, чтобы прогрессировать к росту клеток (G2) / митотическая фазы (M) для ячеек ранее арестован в фазе G1/S и к фазе G1 для клеток, ранее арестован в S фазе. Время выпуска следует разнообразны и оптимизирована для различных клеточных линий. - Заблокируйте ячейки с 250 нг/мл Нокодазол для 12 h.
Примечание: Все клетки подвергаются Нокодазол арестовывают на этапе G2/М. Нокодазол цитотоксических. Длительное воздействие Нокодазол может вызвать apoptosis. Отрегулируйте период или концентрация воздействия для различных клеточных линий, если наблюдаются смерти клетки. Клетки, которые синхронизируются успешно представят сферической морфологии. - Встряхнуть клетки для 45 s в 1 мин, с использованием орбитальный шейкер на 150 до 200 об/мин.
Примечание: Митотическая клетки, которые имеют мало присоединение к подложке, будет стряхнуть во время процесса. - Удалите средство извлечь клетки, закупорить среды в пластиковых пробирок и затем добавить 0,5 мл свежей среды (DMEM, высокая глюкозы (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% FBS и 1% перо/Strep) по каждой скважине пластины.
- Повторите шаги 2,6 и 2,7 в три раза.
- Центрифуга собранных носитель, содержащий митотическая клетки на 800 x g на 3 мин.
Примечание: Этот шаг используется для удаления Нокодазол из средних клеток.
3. Включение синхронизированных клеток в коллагена матрицы
Примечание: Тип I Коллаген является наиболее распространенным белков в организме человека и в ECM соединительной ткани и таким образом широко используется для изучения как эукариотической клетки функции модулируются 3D окружающей среды17,23,24 . Коллаген является растворим в уксусной кислоте. После нейтрализации и потепление коллагена раствор для 20-37 ° C, коллаген мономера полимеризоваться в сеть фибрилл коллагена.
- Подготовьте 10 x DMEM решение путем растворения пакет DMEM порошок, 3,7 г бикарбоната натрия (NaHCO3) и 1 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES) в 50 мл дистиллированной воды. Фильтр решение, а затем подготовить 1 М гидроокиси натрия (NaOH) растворяют в 2 г гранул NaOH в 50 мл дистиллированной воды. Фильтр и Алиготе решение в 1,5 мл пробирок.
Примечание: Нормальный DMEM решение не должен использоваться в этом шаге. Добавление значительного объема раствора коллагена будет разбавлять средство. Поэтому концентрированный раствор DMEM готов обеспечить, что конечная концентрация DMEM в коллагеновой матрицы будет таким же, как нормальный DMEM. - Продолжать работу с клетками, собранные из шага 2.9. Аспирационная среднего и вновь приостановить клетки в около 0,25 - 0,5 мл свежего клеток питательной среды (DMEM, высокая глюкозы (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% FBS и 1% перо/Strep).
Примечание: Для достижения определенных ячеек плотность в коллагеновой матрицы, начальная плотность клеток в суспензии не может быть слишком низкой. Таким образом объем средство, используемое для вновь приостановить клетки будет зависеть от общего числа доступных ячеек. - Место 10 мкл раствора вновь приостановлено клеток из шага 3.2 на Горяева и count плотность клеток в решении.
-
Определите объемы, необходимые для всех компонентов сделать 3D коллагеновой матрицы. 2 мкг/мкл коллаген гель 500 мкл используется здесь в качестве примера.
- Рассчитайте объем ячейки решения, необходимые для получения 40 000 клеток/мл (или 20 000 ячеек для 500 мкл гель коллагена). Это число в мкл-X. 50 мкл 10 x, необходимые среде DMEM. Будет необходимо 50 мкл FBS.
- Рассчитайте объем коллагена, который я складе необходимо. Концентрация коллагена я составляет около 4 мкг/мкл. Количество коллагена в мкл-Y.
- Рассчитать объем гидроксида натрия необходимо нейтрализовать уксусной кислоты в растворе коллагена: коллаген мкл Y * 0,023 * 1000 = Z мкл рабочего раствора NaOH необходимо.
- Определить объем раствора наполнитель: (500 мкл всего гель - X µL клетки - 50 мкл 10 X DMEM - 50 мкл FBS - Y мкл коллаген - Z мкл NaOH) = R мкл
Примечание: Наполнитель решение дистиллированной воды. Если расчетный объем раствора наполнитель является отрицательным числом, оригинальные плотность клеток в суспензии клеток является слишком низкой. Клетки должны быть вращаться вниз снова и снова приостановлено в меньший объем среднего (DMEM, высокая глюкозы (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% FBS и 1% перо/Strep).
- Добавьте компоненты в следующем порядке в чистой 1,5 мл пластиковых пробирок: клетки в среде, 10 x DMEM, ФБС, деионизированная вода (DI), коллаген, NaOH. Поместите все компоненты на льду замедлить гелеобразования раствора коллагена. Используйте правильные методы дозирования для предотвращения образования пузырьков.
- После добавления NaOH, тщательно перемешать раствор с 1 мл пипетки.
Примечание: Гелеобразования коллагена начнется право сразу же после добавления NaOH. Смешивание должно быть сделано быстро и тщательно. - После того, как решение хорошо перемешиваются, добавьте 500 мкл раствора в каждую лунку 24-ну пластины. Место пластину 24-Ну в инкубаторе 37 ° C. Место свежие клетки питательной среды в ванне воды 37 ° C.
Примечание: Пластиковые поддоны используются для низких увеличение клеток микрофильм, в котором рабочее расстояние объектива превышает 1 мм. стекло нижней плиты используются для микроскопии высокого увеличения клеток из-за короткого рабочее расстояние высокого увеличением объектива. - 500 мкл подогретым среднего (DMEM, высокие глюкоза (4,5 г/Л), пируват натрия, 10% FBS и 1% перо/Strep) в верхней части гель 30 мин после завершения шага 3.7.
4. живой клетки изображений клеток, разделив в 3D Коллагеновые матрицы (малое увеличение)
Примечание: Изображения клеток собираются каждые 2 мин, с помощью заряда спаренных устройств (CCD) камеры, установленной на этап контраста Микроскоп, который оснащен 10 X цели и контролируемых изображений.
- Включите блок живой клетки, установлен на вершине объектива. Подождите, пока температура стабилизируется при 37 ° C, концентрация CO2 на 5% и влажность на 75%.
- Вставьте пластину 24-ну гелей в живой клетки блок на микроскопе. Найти в нижней части пластины, а затем переместите объектива до Микроскоп фокусируется на около 500 мкм в нижней части пластины.
Примечание: Клетки в коллагеновой матрицы, которые слишком близко к нижней части пластины не встраиваются полностью в 3D матрицы. Imaging клетки, которые имеют 500 мкм от нижней части пластины обеспечит что клетки не подвержены краевых эффектов16,17,25. - Переместить стадии вокруг, чтобы найти ячейки и выбрать несколько позиций для воображения.
- Настройте промежуток времени эксперимент промежутки 2-мин.
Примечание: Максимальное количество позиций, которые могут быть приняты в течение 2 мин интервал ограничивается скорость движения моторизованного столика и длина время экспозиции для захвата изображений.
5. коллагена сети деформации во время деления клеток (высокое увеличение микроскопии)
- Включите блок живой клетки, установлен на вершине объектива. Подождите, пока температура стабилизируется при 37 ° C, концентрация CO2 на 5% и влажность на 75%.
- Чтобы визуализировать коллагеновых волокон в неокрашенных 3D Коллагеновые матрицы, настройте Конфокальный микроскоп, чтобы захватить только отражённый свет (488-нм) от 488 нм лазер, используемый для освещения образца. Лазер используется 60 X цель погружения в воду, NA = 1.2, WD = 200 мкм и управляется визуализации программного обеспечения.
- Вставьте образец (клетки в Коллагеновые матрицы) в блок живой клетки. Найти в нижней части пластины, а затем переместите объектива до Микроскоп фокусируется на примерно 100 мкм в нижней части пластины. Визуализации ячейки 100 мкм от нижней части пластины обеспечит что клетки не подвержены краевых эффектов.
Примечание: Здесь цель погружения в воду используется вместо нефти погружение объектив потому что рабочее расстояние объектива нефти погружения только около 100 мкм. Использование нефти погружение объектив создает проблему, поскольку толщина стекла в нижней части пластины составляет обычно около 100 мкм. - Переместить стадии вокруг, чтобы найти ячейки и выбрать несколько позиций для воображения.
Примечание: Confocal микроскопии оптически разделов образца и только захватывает сигналы от фокальной плоскости. Живые клетки может быть движущихся и уменьшать фокус во время промежуток времени эксперимента. Чтобы включить захват изображения клетки более длительных периодов времени, Z-стека используется для сбора изображений из последовательных фрагментов интервалом 5 мкм. Отражаются в общей сложности 5 ломтиков, охватывающих 25 мкм. - Настройте промежуток времени эксперимент каждые 5 мин.
Примечание: 5 минут используется здесь как интервал вместо 2 мин, используемых в разделе 4, потому что несколько сканирования режимы, включая флуоресценции, сканирование для H2B-mCherry, отражение сканирования для коллагена и Z-стек сканирования, применяются к каждой позиции. Использование нескольких режимов сканирования уменьшает скорость сканирования позицию по сравнению с низкой масштаб изображения. - Количественно деформации коллагеновой матрицы вблизи клетки из-за силы, оказываемое этой ячейки с помощью частицы изображений Велосиметрия (PIV) с субпиксельной резолюции20. Этот анализ на 2D изображения позволяет для четкой визуализации сигналов H2B-mCherry и коллагеновых волокон. Примените анизотропной низких частот фильтрации для повышения сигнал коллагена сети20.
- Для того чтобы измерить местные перемещения вложенные изображения региона интерес, расположенный в (x,y) от k Рама Рама k+ 1, извлечь окно регионального 15 × 15 пикселей по центру на (x,y) в кадр k. Затем определить лучший соответствия расположения (x,y) * через места, которые имеют максимальный коэффициент нормализованных кросс корреляции в изображение, полученное в кадр k+ 1. Вектор деформации рассчитывается как (x,y) *-(x,y).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цель этой статьи заключается в представлении на основе изображений метод для изучения млекопитающих деление клеток процессы в 3D матрицы и дать количественную оценку взаимодействий между ячейкой и 3D внеклеточного матрикса, во время и после деления клеток. Для облегчения визуализации митозе клеток, мы включили H2B-mCherry в клетки MDA-MB-231, используя лентивирусные трансдукции. H2B, конъюгированных с флуоресцентных белков используется как маркер митотическая различать митотическая клетки от межфазных клеток, а также определить различные этапы во время клетки митоз19,20,26. С помощью этого метода, мы были в состоянии контролировать процесс весь отдел клеток MDA-MB-231, стабильно выражая H2B-mCherry в 3D Коллагеновые матрицы (рис. 1A). Митотическая фазы начал с растворением ядерной мембраны (профаза кадр 1, рис. 1A); реорганизация хромосом (Прометафаза: кадр 2); Выравнивание хромосом в середине тела клетки (метафаза кадр 3); разделение хромосом (анафазе фрейм 4); реорганизация хромосом и ядерной мембраны и разделение тела 2 клетки дочи (Телофаза/цитокинез, Рама 5).
Скорость распространения клеток в матрице 3D обычно намного ниже, чем их коллеги на подложке 2D, который предоставляет мониторинг клеточного деления в 3D менее эффективным19. Для повышения эффективности изучения 3D деление клеток, мы использовали метод, объединяющий тимидина, Нокодазол и трясти офф технику для синхронизации и выберите MDA-MB-231 клетки, которые находятся на стадии митотического. Синхронизированные клетки были затем встроен в Коллагеновые матрицы. Процесс разделения нескольких ячеек контролируется в режиме реального времени с использованием клеток изображений при 10-кратном. Около 70% клеток разделены в течение первых 2 ч после формирования коллагеновой матрицы (рис. 2), что позволяет осуществлять эффективный мониторинг митоз в 3D (рис. 2).
Для контроля взаимодействия между клетками и их окружающие Коллагеновые матрицы, мы объединили конфокальный отражение микроскопии для изображения коллагеновые волокна и микроскопии флуоресцирования образ клетки. 60 X объектив позволяет захвата изображения высокого качества волокон коллагена. Изображений, используя объектив высокого увеличения, которая захватывает меньше клеток в каждом поле зрения, гораздо ниже-пропускную способность по сравнению с использования низкого увеличение 10 X или 20 X. Успешной синхронизации клеток значительно повышает эффективность и производительность такой эксперимент, поскольку большинство синхронизированных клеток разделить в течение первых 2 ч после формирования коллагеновой матрицы. Матрица деформации во время и после деления клеток является визуализация (представитель снимки приведены на рисунке 1B) и количественно с помощью пользовательского программного обеспечения PIV. Мы количественно и сравнил матрица деформации во время межфазной и митотического фазы для ячеек, синхронизированы в фазу митотического. Мы наблюдали, что очень мало изменился матрица деформации во время митотическая этап (Рисунок 3А), и меньше деформации наблюдается в постсоветском митотическая этапа (рис. 3B). Этот результат показывает, что клетки млекопитающих минимальные вложения и взаимодействия с окружающим матрицы в то время как они находятся в стадии митотического.
Рисунок 1: представитель микроскопии, полученные из клеток визуализации видео высокого увеличения ячейки MDA-MB-231, встроенные в коллагеновой матрицы, которая стабильно выражает H2B-mCherry. (A) различные этапы прогрессирования митотическая MDA-MB-231 ячейки определяются H2B-mCherry как помечены красным цветом. (B) волокон коллагена (белый) во время процесса митотическая визуализируются на время зависимых конфокальный отражение микроскопии. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Отдел синхронизированных клеток в 3D Коллагеновые матрицы. Клетки были синхронизированы фазы G2/M и внедренные в матрицу, коллагена. Около 70% синхронизированных клеток разделить в течение первых 2 ч, в то время как контроль клетки без синхронизации разрыва случайным образом. Ошибка бар = SEM (Среднеквадратичная ошибка среднего значения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: количественная оценка матрица деформации для MDA-MB-231 клеток в интерфазе и митоз. (A) изменение величины деформации матрицу для матрицы встроенный MDA-MB-231 клеток. Зеленая стрелка указывает профаза и красная стрелка указывает Телофаза. (B) количественная оценка матрица деформации для MDA-MB-231 клетки митотическая этапе, и межфазных указывает минимальный матрица деформации во время деления клеток. Ошибка бар = SEM (Среднеквадратичная ошибка среднего значения). * p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предыдущие исследования клеточного деления в 3D не был эффективно из-за экспериментальной ограничения и технические проблемы18,19. Важнейшие шаги для эффективного изучения млекопитающих деления клеток в 3D Коллагеновые матрицы являются: (1) включение флуоресцировани обозначенного митотическая маркеров в клетки; (2 синхронизации деления клеток; и (3) мониторинг мероприятий Отдела в 3D матрицы с использованием клеток Тепловизионная техника, время решена конфокальный отражение микроскопии и количественного анализа изображений.
Митотическая клетки на 2D субстраты можно отличить от межфазных ячеек, основанных на их морфологии, т.е. митотический клетки круглой и едва прикрепить к подложке, тогда как клетки межфазной разложить и прочно прикрепить к подложке. В 3D матрицы однако, морфологию клеток не надежный маркер для митотическая клетки с некоторые клетки, едва разложить и остаются в матрице27,28. Таким образом важно представить клетки для изучения клеточного деления в 3D матрицы митотическая маркер. Мы стабильно выразил H2B-mCherry в клетках MDA-MB-231, которые служили надежным маркер для различных митотическая этапов, включая профаза, Прометафаза, метафаза, анафазе и Телофаза/цитокинез. Ранее мы использовали этот подход для различения митотическая клетки от межфазных клеток в 3D матрицы. С помощью этого маркера мы также смогли измерить длину митотическая фазы для другой линии клетки, клетки HT1080, разделив на подложках 2D и 3D матрицы19.
Существует несколько способов синхронизации клеток, включая сыворотки голода29,31митотическая трясти от30,, двойной тимидина блокирование32и Нокодазол32. Мы объединили тимидина лечение и лечение Нокодазол эффективно синхронизировать MDA-MB-231 клетки к этапу G2/М. Клетки подвергаются тимидина подвергаются аресту на переходе G1/S и S-фаза за счет ингибирования синтеза ДНК тимидина. Релиз клетки от воздействия тимидина пусть клетки прогресс фазы G2/М для ячеек, арестован в фазе G1/S и G1 для клеток в S фазе арестованы. Все клетки, подвергается Нокодазол арестовывают на этапе G2/М. Округленные клетки, фазу митотического были затем потряс офф от плиты и непосредственно инкапсулируются в Коллагеновые матрицы. Мы показали, что около 70% клеток разделить в течение 2 ч после того, как они включены в Коллагеновые матрицы (рис. 2). Кроме того, клетки могут быть встроены в Коллагеновые матрицы до синхронизации, однако, сшитого сети коллагеновой матрицы представляет физический барьер и снижает скорость диффузии и конвекции биомолекулярных в33, 34. действительно, мы попытались синхронизации клеток в Коллагеновые матрицы с помощью тимидин и Нокодазол, но не удалось получить эффективной синхронизации. Этот результат может быть из-за неэффективного диффузии и конвекция наркотиков через коллагеновой матрицы.
Отражение является Встроенные оптические свойства многих биополимеров, включая коллагена. Конфокальный отражение технику микроскопии визуализирует и quantitates микротопографии пористых биоматериалов, приготовленный из синтетических полимеров и 3D Коллагеновые матрицы23,24,35,36 ,37. В нашей лаборатории мы создали методы для отслеживания изменений в полярности волокна коллагена, как концентрация коллагена зависит от38. Здесь мы описываем метод для мониторинга деформации волокон коллагена основе отснятого видео Светоотражающий конфокальный изображений для обозначения ячейки матрицы взаимодействия. Представленные здесь представитель результаты показывают, что матрица деформации для митотическая MDA-MB-231 клетки значительно меньше, чем те клетки в интерфазе, который свидетельствует о том, что клетки млекопитающих имеют минимальные вложения и взаимодействия с окружающие матрица, когда они войти митотическая этап19.
Ранее мы использовали конфокальный отражение микроскопии для мониторинга и количественной оценки взаимодействия клеток матрицы до, во время и после митозе клеток HT1080. Мы также мониторинг матрица деформации β1-Интегрин нокдаун HT1080 клеток во время межфазной и митотического фазы. Разрушающих β1-Интегрин значительно уменьшает матрица деформации в клетке в интерфазе. Однако нет никакой разницы в матрица деформации во время этапа митотическая раунда β1-Интегрин нокдаун (KD) клеток и клеток дикого типа HT108019.
Альтернативный подход к визуализации коллагеновых волокон является использовать конъюгированных флуоресценции типа коллагена. Ранее мы использовали этот подход к изображения треков в матрицах коллагена, порожденных клетки19. Этот подход, однако, требует маркировки коллагена с Люминесцентная краска например флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC), которая требует много времени и менее эффективным. С другой стороны микроскопии конфокальный отражение может применяться непосредственно к неизмененным коллагена, чтобы сэкономить время и ресурсы и исключить вопросы, связанные с флуоресцентным Фотообесцвечивание. Кроме того этот метод не требуется отдельных флуоресцентные канал и поэтому совместим со всеми флуоресцентными красителями.
Метод, представленный в настоящем документе потенциально может применяться к любому типу mammalian клеток, которые разделяют в 3D коллагеновой матрицы. Включение H2B-mCherry маркер в другие клетки млекопитающих, лентивирусные трансдукции будут следовать точно те же процедуры как описано в документе, хотя различные типы клеток могут варьировались эффективности для трансдукции человека 39. как плотность клеток после трансдукция и титр вируса могут быть оптимизированы для повышения эффективности. Если трансдукции высокой эффективности не может быть достигнуто, клетки может выбираться помощь клеток флуоресцентным сортируя (FACS). Блокирование тимидин и Нокодазол применяются к успешно синхронизировать несколько других типов клеток млекопитающих, таких как HeLa40. Механические сотрясения офф может применяться для любых типов клеток, которые облавы и едва прикрепить к подложке в фазе митотического30,31. Кроме того изображения с помощью микроскопии конфокальный отражения и количественная оценка матрица деформации волокон коллагена могут применяться непосредственно для всех остальных типов деления клеток млекопитающих.
Представленные здесь метод является эффективным и общий подход для изучения млекопитающих деление клеток и клеток матрица взаимодействий в 3D-среде. Этот подход облегчает нашу зонд в молекулярные основы развития нормальной ткани и болезней и потенцирует дизайн Роман диагностических и терапевтических подходов в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH предоставляет R01CA174388 и U54CA143868. Авторы хотели бы признать PURA награду от университета Джонса Хопкинса для поддержки Чэнь Вэй Тонг. Этот материал основан на работе, поддержке национальной науки фонд исследовательских стипендий под Грант № 1232825.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
References
- Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
- Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11 (1), 18-21 (2001).
- Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D.
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68 (15), 6251-6259 (2008).
- Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25 (5), 471-477 (2007).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18 (1), 51-63 (2012).
- Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28 (18), 3015-3022 (2010).
- Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127 (1), 63-69 (2012).
- Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22 (2), 431-437 (2011).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
- Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27 (10), 4089-4099 (2013).
- Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205 (2), 155-162 (2014).
- He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7 (6), 6994-7011 (2016).
- Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7 (9), 747-754 (2010).
- Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7 (10), e48024 (2012).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
- Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
- Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187 (4), 481-496 (2009).
- Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (5), 1943-1948 (2011).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
- Jackman, J., O'Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
- Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120 (2-3), 151-159 (1983).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
- Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8 (11), e82382 (2013).
- Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
- Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6 (9), e24891 (2011).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).
- Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
- Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).
- Ma, H. T., Poon, R. Y.
