Summary
Dit protocol beschrijft technieken voor de beoordeling van de chemische cross-linking van het konijn sclera met behulp van tweede-harmonische generatie beeldvorming en differentiële scanning calorimetrie.
Abstract
Methoden ter versterking van weefsel door de invoering van chemische bindingen (niet-enzymatische dwarsbinding) tot structurele proteïnen (fibrillar collagens) voor therapie omvatten fotochemische dwarsbinding en weefsel (TXL) methoden dwarsbinding. Dergelijke methoden voor mechanische weefsel eigenschapswijzigingen inducerende gebruikt om het hoornvlies in hoornvlies dunner (mechanisch verzwakt) aandoeningen zoals keratoconus evenals de sclera in progressieve myopie, waar vermagering en verzwakking van de posterior Sclera optreedt en waarschijnlijk draagt bij aan de axiale rek. De eiwitten van de primaire doelgroep voor de versterking van dergelijke weefsel zijn fibrillar collagens, die de grote meerderheid van drooggewicht eiwitten in de cornea en sclera vormen. Toevalligerwijs, zijn fibrillar collagens de belangrijkste bron van tweede-harmonische generatie signalen in de extracellulaire ruimte van weefsel. Daarom, wijzigingen van de collageen-eiwitten, zoals degenen geïnduceerd door dwarsbinding therapieën, konden potentieel worden gedetecteerd en quantitated met behulp van tweede-harmonische generatie microscopie (SHGM). Bewaking SHGM signalen door het gebruik van een laser scanning microscopie systeem in combinatie met een infrarood excitatie licht bron is een spannende moderne beeldvorming methode dat is genieten van wijdverbreide gebruik in de Biomedische Wetenschappen. Dus de huidige studie werd uitgevoerd om te evalueren van het gebruik van SHGM microscopie als een middel voor het meten van geïnduceerde cross-linking effecten in ex vivo konijn sclera, na een injectie van een chemische stof dwarsbinding agent in de sub-Tenon ruimte (sT), een injectie aanpak dat is gebruikelijk voor het veroorzaken van oogbeschadigingen en/of verdoving tijdens oogheelkundig klinische procedures. De chemische stof dwarsbinding agent, is natrium hydroxymethylglycinate (SMG), van een klasse van cosmetische conserveermiddelen formaldehyde vrijgeven van agenten (FARs) genoemd. Scleral wijzigingen na reactie met SMG resulteerde in stijgingen van de SHG signalen en gecorreleerd met verschuivingen in thermische denaturatie temperatuur, een standaardmethode voor het evalueren van geïnduceerde weefsel dwarsbinding effecten.
Introduction
Progressieve myopie is gepostuleerd aan behandelbare door niet-enzymatische scleral dwarsbinding (fotochemische en/of chemische), wat logisch is gezien het feit dat het blokkeren van enzymatische cross-linking van collageen experimentele vorm ontbering (FD verhogen kan)-geïnduceerde bijziendheid1. Sheikh en Phillips2 onlangs gesproken over de haalbaarheid en de mogelijkheden voor het gebruik van standaard UV-A straling (UVA)-riboflavine gemedieerde fotochemische dwarsbinding (ook bekend als de Dresden-protocol), afgekort hier als (riboflavine CXL) voor achterste scleral stabilisatie axiale rek in bijziendheid halt toe te roepen. Deze fotochemische methode is met succes gebruikt voor de behandeling van destabilisatie van het anterieure globe-oppervlak gezien in keratoconus en post-LASIK keratectasia (d.w.z., het uitpuilende hoornvlies). Toepassing van dit protocol CXL voor de sclera wordt echter belemmerd door kwesties met betrekking tot moeilijkheden bij de toegang tot de achterste sclera met een ultraviolette lichtbron (UV), evenals de noodzaak om te wijzigen van een veel grotere weefsel oppervlakte. Dat gezegd zijnde, de CXL-aanpak is gebruikt om te stoppen axiale rek in visueel vorm beroofd konijnen (door tarsorrhaphy), hoewel meerdere regio's van posterieure sclera meerdere afzonderlijke bestraling zones in die studie3 vereist. Daarentegen kan de injectie van een chemische stabilisator en (dat wil zeggen, cross-linking agent) via de sT-ruimte een eenvoudiger manier om te wijzigen de posterieure sclera, het vermijden van de noodzaak voor de invoering van een UV-lichtbron vertegenwoordigen. Deze injectietechniek is bekend als een nuttige manier inducerende oogbeschadigingen en/of verdoving tijdens oogheelkundig procedures zoals cataract chirurgie4,5,6. Wollensak7 eerder heeft beschreven van het gebruik van een injectie van de sT met behulp van glyceraldehyde (een chemische cross-linking agent gelijkaardig in concept aan de formaldehyde die het vrijgeven van agenten (FARs) beschreven in deze studie) aan het verharden van de sclera konijn en de genipin heeft is aangetoond dat het beperken van axiale lengte in FD cavia's8,9. Deze onderzoekers hebben aangetoond dat een duidelijk voordeel van het gebruik van een chemisch agens die oplosbaar over de fotochemische CXL-techniek. Dus scleral dwarsbinding met behulp van een injecteerbare chemisch agens van een soort, met inbegrip van de FARs (d.w.z., TXL)10, kon bieden een haalbaar behandelingsmethode de progressie van scleral rek gezien in bijziendheid halt toe te roepen.
In de protocollen die hier gepresenteerd, gebruiken we een chemische cross-linking oplossing van natrium hydroxymethylglycinate (SMG), geleverd via sT injectie aan de sclera van dode foetussen konijn ogen. Wij hebben uitgevoerd soortgelijke protocollen eerder voor actuele chemische dwarsbinding in het hoornvlies. Met name in die eerder gemeld studies, kan concentratie afhankelijke dwarsbinding effecten worden verkregen met behulp van SMG, met een effect bereik verspreid over ruim boven die haalbaar zijn met fotochemische CXL zoals bepaald door de thermische denaturatie analyse11 .
We beschrijven hier protocollen voor de beoordeling van de cross-linking effect van SMG geleverd via sT injecties aan scleral weefsel, thermische denaturatie met behulp van differentiële Scanning Calorimetrie (DSC) en tweede harmonische generatie microscopie (SHGM).
Met behulp van differentiële scanning calorimetrie (DSC), ook bekend als thermische analyse, wordt een thermische denaturatie overgang gemeten, die voor scleral weefsel wordt hoofdzakelijk laten leiden door de eigenschappen van de fibrillar collagens, want zij de meerderheid van de bulk vormen van eiwit. Deze methode evalueert de stabiliteit van collageen moleculaire structuur en de kruiselings gekoppelde obligaties die de collageen fibrillen, de belangrijkste tertiaire eiwitstructuur stabiliseren. Tijdens de verwarming in de DSC, wordt de temperatuur van een kritische overgang bereikt die tot denaturatie van het molecuul van collageen leidt, wat resulteert in het uncoiling van de triple helix, een proces dat vormt wat is algemeen bekend als gelatine. Deze thermische denaturatie verstoort waterstofbruggen langs de collageen-molecuul en aan hogere temperaturen door geïnduceerde cross-linking methoden12,13kan worden verschoven. Deze methode is gebruikt voor vele decennia, met name in de industrie biomaterialen en processen met leder te maken. Echter, deze methode vereist extractie van de sclera weefsel en dus kan alleen nuttig zijn als een ex vivo -techniek.
Tweede-harmonische generatie microscopie (SHGM) is gebaseerd op de niet-lineaire optische eigenschappen van bepaalde materialen, met niet-centrosymmetric moleculaire omgevingen. In dergelijke materialen, intens licht, bijvoorbeeld licht geproduceerd door lasers, genereert SHG signalen, waarin het invallende licht wordt verdubbeld in frequentie. Biologische stoffen waarvan bekend is dat het maken van de SHG signalen zijn collageen, microtubuli en spier myosin. Collageen enthousiast met een infrarood licht van 860 nm golflengte zal bijvoorbeeld een signaal van de SHG in het zichtbare bereik met 430 nm golflengte uitzenden. Tweede harmonische generatie (SHG) signaal imaging is een veelbelovende methode voor de beoordeling van de therapeutische collageen dwarsbinding. Het is gekend voor meer dan 30 jaar dat collageen fibrillen in weefsels SHG signalen14 uitstoten. Echter kon pas onlangs hoge resolutiebeelden worden verkregen15 in een verscheidenheid van weefsel, met inbegrip van de pees16, kraakbeen17, huid en bloedvaten18, en in collageen gels19.
Deze studie is gebaseerd op deze kennis, en evalueert de SHG signaal veranderingen in de sclera via SMG chemisch geïnduceerde cross-linking van collageen. De resultaten wijzen erop dat SMG wijziging van de sclera de signalen van de SHG geproduceerd uit weefsel collageen vezelbundels (de hogere orde quaternaire structuur bestaat uit collageen fibrillen verhoogt) en ook een structurele morfologische veranderingen in de collageen produceert glasvezelnetwerk, weerspiegeld in de vezel bundel "straighten."
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd met behulp van dode foetussen konijn ogen binnen intact outbred konijn hoofden. Alle institutionele en nationale richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werden gevolgd.
1. bereiding van de oplossingen
- SMG voorbereiding TXL:
- Bereiden 1 mL 0,2 M concentratie van natriumbicarbonaat oplossing (NaHCO3) oplossing met behulp van 0.0165 g NaHCO3 poeder opgelost in 1 mL gedestilleerd water.
- Los 0.1016 mg poeder natrium hydroxymethylglycinate (SMG) in 1 mL gedestilleerd water om een eindconcentratie van 800 mM SMG. Aanpassen van natriumbicarbonaat oplossing voor een uiteindelijke concentratie van 0,1 M NaHCO3 en 400 mM SMG. Concentraties van SMG afhankelijk van de cross-linking effect gewenst. In het protocol beschreven hier gebruikten we 40, 100 en 400 mM SMG.
2. subTenon de injectie voor TXL met behulp van SMG
- Vul twee 1 mL insuline spuiten (25G naalden) met 400 µL controle en SMG oplossing, respectievelijk.
- Plaats de rabbit's hoofd in een vlak profiel met behulp van een kussen. Piepschuim of een stapel papier kan worden gebruikt om op te lossen van het hoofd in een optimale positie.
- Intrekken van de oogleden met een speculum pediatrische oog.
- Meet de initiële intraoculaire druk (IOP) met behulp van een applanation tonometry apparaat.
- De site van beoogde injectie in het bovenste middelste gedeelte van de limbus markeren met een viltstift weefsel.
- Intrekken van het bindvlies rond de plaats van injectie met een conjunctivale pincet (of een pincet met getande ronde tip) en steek de naald door het bindvlies, invoeren van Tenon de capsule net iets buiten de gemarkeerde limbal site (dat wil zeggen, 2-3 mm van de limbus). Een kleine snede in het bindvlies kan ook worden gemaakt met een iris schaar ter vergemakkelijking van de passage van de naald door de Tenon capsule.
- Eenmaal binnen Tenon de capsule, ervoor te zorgen dat de naald vrij mobiel is door het bewegen van het links-naar-rechts. Gedurende deze tijd, moet de hele wereld niet verplaatsen. Dit bevestigt de juiste plaatsing van de naald boven de sclera in de sub-Tenon van (sT) ruimte.
- Injecteer de oplossing van de spuit en de naald te negeren. Direct na de injectie, zal de vloeistof zich ophopen in de ruimte van de sT maken een anterior Ardennen gezien door het bindvlies (dat wil zeggen, chemosis).
- Herhaal de meting IOP om te bevestigen dat het niet als gevolg van een onbedoelde perforatie van de hele wereld veranderen.
- Verwijder de deksel speculum en uitvoeren van digitale massage door middel van de gesloten oogleden voor ongeveer 2-3 min.
- Laat het hoofd voor een incubatietijd van 3,5 h (kamertemperatuur 18 ° C =), voorafgaand aan het verplaatsen naar de volgende stap.
3. de weefsels voorbereiding
- Intrekken van de oogleden met behulp van het ooglid speculum oog op het optimaliseren van de toegang tot de hele wereld. Selecteer de optimaal formaat speculum volgens de grootte van het oog.
- Het bindvlies rond de limbus te scheiden. Als het heeft al zijn ingesneden in de buurt van de plaats van injectie, omtrek vouwt de grenzen dus het een entmateriaal grootte van ongeveer 1 x 1 cm bevatten zou.
- Knip de extra oogbeschadigingen en/of spieren op hun sites van scleral inbrengen.
- Verhoog de oogbol met pincet, het duwen van de posterieure zijde. Dit biedt toegang tot de achterste bol en snijden van de oogzenuw met ophthalmic slagader en ader vlakbij de achterste stok van de wereld zal vergemakkelijken.
- Knip de corneoscleral complex, met de buitenrand, met inbegrip van de gemarkeerde injectieplaats. De vlek moet wel zichtbaar op het resterende deel van de sclera.
- Verwijder het corpus vitreus en alle lagen die zijn gekoppeld aan de binnenzijde van de sclera door tractie met weefsel pincet toe te passen.
Opmerking: Verdere stappen afhankelijk zijn van de volgende procedures wordt uitgevoerd: 4. - DSC analyse, 5. - SHG microscopie.
4. voor regionale DSC analyse
-
Voor het behandelde oog: knip vier scleral sectoren van de resterende scleral cup met de schaar zodat de plaats van de injectie is gevestigd in de bovenste sector en uitgelijnd centraal. Snijd de resterende 3 sectoren van zowel laterale zijden (d.w.z., nasale en temporele), en de onderkant.
Opmerking: de nummering van de sectoren (1-4) die zijn verder onderverdeeld in vierkanten (1-16) wordt geïllustreerd in figuur 1A. - Snijd de scleral sectoren (1-4) in kleinere vierkantjes (1-16) van ongeveer 4 x 4 mm elke. Sector 1 moet worden onderverdeeld in 9 vierkantjes (zorg de exacte plaats van de injectie een individuele vierkant [plein 2]). Verdeel sectoren 2 en 3 in 2 vierkanten (pleinen 10-11 en 12-13) en sector 4 in 3 vierkanten (pleinen 14-16).
- Een nummer toewijzen aan elk vierkant, zoals weergegeven in figuur 1A, om het lokaliseren van de afstand van de geanalyseerde weefsel van de locatie van het geïnjecteerde gebied.
- Voor het controle-oog: nadat het weefsel te verdelen in vier scleral sectoren (vergelijkbaar met het behandelde weefsel) knip vierkante stukjes weefsel van de volgende locaties: 3 vierkanten uit de top sector (sector 1), 1 van elke zijde (sectoren 2 en 3), en 1 van de onderkant sector (sector 4).
- Schraap de resterende netvlies en choroidal lagen en spoel tweemaal met verse PBS telkens verlaten de stukken ondergedompeld in de oplossing voor ongeveer 10 s tegelijk.
5. voor SHG Imaging
- Snij het bovenste gedeelte van de sclera met behulp van schaar een 1 x 1 cm om ruimte te creëren met de plaats van injectie uitgelijnd centraal.
- Schraap de resterende netvlies en choroideus lagen en spoel tweemaal met verse PBS telkens verlaten van de stukken in de oplossing voor ongeveer 10 s.
- Plaats het weefsel in 1 mL buizen gevuld met PBS oplossing voor vervoer naar de imaging faciliteit. Alle procedures, volgend op de incubatietijd en beginnen met de dissectie van de oogbol moeten worden uitgevoerd binnen een uur.
6. microscopie Protocol
Opmerking: Dit protocol voor imaging achterwaarts-verstrooid SHG signaal van collageen van sclera weefsel is op maat gemaakt voor de laser scanning microscoop.
-
Microscopie instellen
- Als u wilt maximaliseren optimaliseren het signaal en de resolutie bij het uitvoeren van de SHG microscopie een objectief gebruiken voor het verzenden van infrarood licht en met een hoge numerieke diafragma (NB). Onze doelstelling is Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 water onderdompeling.
- Aanpassen van de kraag van de correctie van de lens aan de diepte van het monster, in dit geval dat is de dikte van het dekglaasje aan, 0,17 millimeter.
- Monteren van het objectief van 25 x en een royaal bedrag van smeerolie watergedragen gel ter dekking van de beeldvorming oppervlak voor montage van het monster toe te voegen. De gel op basis van water zal niet verdampen tijdens het experiment en vandaar beeldkwaliteit zal handhaven.
- Plaats het scleral weefsel uit een tube van 1 mL met PBS zonder drogen tussen twee 25-mm ronde coverslips (episcleral zijde naar beneden) bieden maximale contact tussen de episclera en het dekglaasje aan oppervlak.
Opmerking: Het weefsel kan ook worden geplaatst vanuit een ongedekte positie op het dekglaasje aan. Een goede hoeveelheid PBS moet houden het weefsel gehydrateerd tijdens imaging. In dit geval het stuk weefsel en de PBS toevoegen na het monteren van de cellchamber. - Monteren van de kamer van de cel door het plaatsen van een 25-mm ronde dekglaasje aan, enkel of in een sandwich techniek, op het onderste gedeelte van de kamer en schroef het bovenste deel naar beneden om te creëren een verzegelde ronde kamer. Niet schroef naar beneden strak wanneer een top dekglaasje aan wordt gebruikt, teneinde te vermijden kunstmatig afvlakken en schade aan het weefsel.
- Monteer de zaal van de cel met het monster weefsel in het werkgebied van de Microscoop.
- De Microscoop voor oog weergave met doorvallend licht aangezet.
- Het werkgebied plaatsen en aanpassen van de hoogte van de doelstelling, zodat het onderste oppervlak van het monster in beeld, is zoals bepaald door heldere veldkeuring via het oog stuk.
- Alle lichten met uitzondering van de monitor van de computer uit te schakelen en zo veel licht van de monitor mogelijk blokkeren met aluminiumfolie vellen gedrapeerd in het werkgebied van de Microscoop. Minimaliseren van alle strooilicht bereiken de detectoren zorgt geluidsarme verwerving, zoals de GaAsP NDD detectoren hoge gevoeligheid hebben.
- Controleer of de definitie van de lens juist is in het deelvenster Ti Pad van de software.
- In het deelvenster A1 Compact GUI kiezen de IR laser voor imaging de NDD detectoren en kies de DAPI-kanaal dat is uitgerust met een 400-450 nm bandfilter filter.
- Stel in het deelvenster A1 MP GUI de golflengte van de infrarood laser naar 860 nm en open de sluiter.
- Laser scannen voorwaarden in het deelvenster A1 Compact GUI als volgt instellen Selecteer: (a) Galvano scanner, (b) unidirectionele scannen, (c) Pixel Nadruktijd tijd 6.2 µs, (d) Frame grootte 1024 x 1024 pixels, (e) lijn gemiddeld 2 x
Opmerking: De Galvano scanner en unidirectionele scannen zorgt voor nauwkeurige puntsgewijs uitlijning. Een formaat van 1024 x 1024 voor de volledige gezichtsveld vertaalt zich in een pixelgrootte van 0,5 μm /pixel. Lijn gemiddeld zal de shot ruis in de afbeelding. - Set imaging voorwaarden in A1 Compact GUI deelvenster door laser macht en detector winst aan te passen. Open het deelvenster tabel kijken (LUTs) waarin een histogram van de intensiteitswaarden van de pixels in de huidige afbeelding. Levende imaging in "Zoeken"-modus inschakelen en de gedetecteerde bereik van pixelwaarden te maximaliseren door laser macht en detector winst aan te passen. Vermijd verzadiging. Gebruikelijke waarden zijn 2,5% laser macht, uit een totaal van 2,35 W op 860 nm, en 100 HV (detector winst).
- Opmerking: Voor deze opstelling is de kracht van de laser gemeten met een interne Energiemeter 5.2 mW. Elke keer dat een experiment wordt uitgevoerd, opnieuw het percentage van de laser aanpassen zodat de interne vermogensmeting constant op 5.2 is mW tussen imaging sessies. Zorg moet worden genomen bij de vaststelling van de macht van de laser. De kameleon II-laser is een 3 W laser bij 800 nm en een 10% of hogere macht kon potentieel weefselschade veroorzaken.
-
Beeldacquisitie
- Scan het weefsel gebied met het gereedschap XYZ overzicht in de schermafdrukmodus.
- Stel de beeldvorming op lagere resolutie (256 x 256 pixels en geen regel gemiddeld) om de overname van afbeeldingen in deze modus te versnellen.
- Het vastleggen van 5 x 5, 3 x 3 of één gezichtsveld ter dekking van het gehele oppervlak van het weefsel. Op elke bedieningsplaats, vóór de verovering van het overzicht, de "Scan"-modus inschakelen en brengen het weefsel in beeld. Merk op dat de verschillende regio's van het weefsel lichtjes verschillende posities in de axiale richting zal hebben.
- Zoek een vlak stuk waar de collageenvezels worden gezien in het hele gezichtsveld en dubbelklikt u op die positie in het overzicht hulpprogramma om de etappe naar die specifieke locatie.
- Live "Scan"-modus inschakelen, aanpassen van positie op de Z van de doelstelling, zodat de onderkant vlak in focus is, en in de Ti-Pad, de Z-drive te gebruiken om te verplaatsen het optische vliegtuig 10-15 μm boven deze onderste laag.
- Verwerven van een afbeelding met hoge resolutie met 1024 x 1024 pixels en 2 x lijn gemiddeld, met behulp van de "Capture"-knop.
- De locatie opslaan in het XYZ-overzicht met de "+" knop. Dit zorgt ervoor dat het zelfde gebied van weefsel is niet heroverd.
- Voor elk stukje weefsel 10 foto's vastleggen van niet-overlappende gezichtsveld.
7. DSC Protocol
Opmerking: Ga verder met deze stap zodra weefsel voorbereiding voltooid, regionale DSC p.a., of is na het weefsel imaging wanneer SHGM wordt uitgevoerd.
- DSC pannen, gewogen en label voor te bereiden.
Opmerking: Deze stap moet gebeuren vóór weefsel dissectie om te minimaliseren van weefsel uitdroging. - Elk scleral vierkant met een absorberend tissue droog en leg het plat op de bodem van een pan van de DSC met getande pincet.
- Weeg de pan met de weefsel binnen en het deksel gekruld en bedekt te verkrijgen van het weefsel nat gewicht (de massa van de monsters moet worden in de range van 5 tot en met 11 mg).
Opmerking: Seal elke pan met behulp van de krimptang alvorens tot het volgende weefsel monster. De pannen zijn hermetisch afgesloten, voorkomen van waterverlies vóór thermische analyse. - Zodra het monster is geribbeld, plaats het op de aangewezen locatie op de DSC-lade. Moet er 6 monsters voor het besturingselement en 16 voor het behandelde oog.
- Maken van een methode met behulp van instrument beheren van software, het opgeven van het gewicht van het weefsel en uitvoeren van de thermische analyse met behulp van de volgende parameters: temperatuurbereik van 40 tot 80 ° C, opwarmsnelheid: 1 ° C/min, warmtestroom: 17.37 mW, gasstroom (N2): 19,8 mL/min, Gas druk: 2,2 bar.
- Zodra voltooid, analyseren de gegevens voor elk monster door het extraheren van de overgang temperatuur piek op welke thermische denaturatie optreedt met behulp van het instrument voor het beheer van software.
8. de beeldanalyse
-
SHG signaal
- Selecteer ten minste 5-10 van de meest representatieve beelden van elke behandeling en de controle, zodat het gebied van de afbeelding wordt bezet door meestal collageenvezels.
- Elke afbeelding in ImageJ software uploaden en meten van de intensiteit van de gemiddelde pixel door het selecteren van analyseren > maatregel voor de actieve afbeelding.
- De waarden die geëxtraheerd worden gerapporteerd als de gemiddelde pixel intensiteit en kan ook worden aangetoond door het uitzetten van het histogram van intensiteiten door te selecteren in het menu analyseren > Histogram.
- Met behulp van een Excel-werkblad, een tabel voor het documenteren van alle gemeten gegevens dienovereenkomstig maken de monster-id.
- Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie van pixel intensiteit voor elke voorwaarde die behandeling en controle.
- Met behulp van de student t-test, verschillen voor alle paarsgewijze vergelijkingen van concentraties (d.w.z., 40 mM SMG vs. 0 en 400 mM SMG vs. 0) te vergelijken. [P≤0.05].
-
Waviness
- Selecteer een afbeelding die wordt weergegeven de collageenvezels. Ten minste 10 beelden per monster moeten worden geanalyseerd (met inbegrip van een controlemonster voor elke concentratie - ten minste 40 in totaal).
- Open ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ vereist de voorafgaande installatie.
- Upload alle imagesby naar een geopend venster van de NeuronJ te slepen.
- Maken van tracering lijnen langs de vezels, volgt de omtrek van de fibril met de muis (pen Tekentabletten kan worden gebruikt), klikt u op M voor het meten van de afstand van totale vezel lengte.
- Selecteer "Optie" tangentiële rechte lijnen tekenen en verbinden het begin en het einde van de eerder getekende vezel contour. Klik nu op M voor het meten van de lengte van de end-to-end.
- Herhaal dezelfde procedure op ten minste 10 fibrillen per beeld.
- Deze twee metingen van elk van de 10 fibrillen verzamelen en inbreng van de gegevens in een excel-spreadsheet, totale vezel lengte (omtrek) en end-to-end lengte (rechte verbindingslijnen lijn) uitdrukken als lengte [kromme] en lengte [lineaire], respectievelijk.
- Berekening van de waviness-index (W) met behulp van de formule: W = lengte [kromme] / lengte [lineaire].
- Bereken het % van waviness vergelijking van de gegevens van de beelden van de behandelde samples(SMG) met de beelden van de controlemonsters met behulp van de formule: (W [SMG] - 1) / (W [beheer] - 1)
- Een paarsgewijze t-toets voor waviness index (W) uitvoeren om te bepalen van de statistische verschillen (p-waarden) van collageen vezels morfologie tussen verschillende behandeling voorwaarden en controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thermische denaturatie temperatuur (Tm) als een test method to evaluate methode TXL dwarsbinding effect: Een totaal van 16 paren van konijn ogen werden gebruikt in deze experimenten voor de TXL-procedure. Als een eerste deel van deze studie, werd de lokalisatie van cross-linking effect geïnduceerd door een enkele injectie van de cross-linking agent SMG via sT ruimte in het hoofd van dode foetussen konijn geëvalueerd. Dit type experiment sinds relevantie voor de klinische behandeling van patiënten, injecties in meer dan één locatie zou nodig om te stabiliseren een gewenste gedeelte van de sclera.
Zoals zou worden voorspeld op basis van de beginselen van de fundamentele richtgetal, was het effect grootste op de plaats van injectie met effecten geïnduceerd in aangrenzende gebieden zo goed, afhankelijk van de concentratie van de oplossingen. Figuur 1A vertegenwoordigt de schematische locatie van scleral sectoren (1-4 in rode holle lettertype) (verder onderverdeeld in vierkanten (1-16 in zwarte dunne lettertype)) die onderging aparte thermische denaturatie analyse na een injectie van één sT met kleur toewijzing index. Tabel 1 toont de verandering in Tm waarden voor elke genummerde sector ten opzichte van het bijbehorende besturingselement. Waarden zijn inbegrepen voor zowel 40 mM en 400 mM injecties en omvatten de standaardfout van het gemiddelde berekend voor een minimum van drie onafhankelijke vaststellingen.
Cijfers 1B-C vertegenwoordigen de resultaten met behulp van twee verschillende concentraties van SMG, 40 mM (figuur 1B) en 400 mM (Figuur 1 c). In figuur 1Btoonde het lagere concentratie 40 mM monster een lichte verschuiving in Tm die werd opgemerkt in plein 2 (de injectieplaats). Soortgelijke verschuivingen werden waargenomen in de aangrenzende pleinen 1 en 3 (lichter blauw). Marginale verschuivingen worden gezien in de vakken 4 tot en met 6 en 7 tot en met 9 zonder statistisch significant verschillen ten opzichte van het geïnjecteerde plein. Geen verschuiving Tm werd gezien in de lagere pleinen 14 tot en met 16, die vertegenwoordigd de meest afgelegen sector uit de buurt van de injectieplaats.
Zoals blijkt uit Figuur 1 c, had de hogere concentratie (400 mM) een statistisch sterk significant cross-linking effect (aangegeven als tinten van Oranje). Een grote verschuiving in de Tm met bijbehorende kleine standaarddeviatie en p < 0.05 werden waargenomen, als gevolg van een groot verschil in het effect van de 400 mM in vergelijking met lagere concentratie van 40 mM. De meest dramatische effecten werden vermeld in de sector 1 in de bovenste bol. Met betrekking tot de overige sectoren, een mindere effect werd waargenomen in de vakken 10 en 14 (die geweest zijn als gevolg van sommige tracking van cross-linking vloeistof posteriorly) en geen enkel effect werd waargenomen in de vakken 11, 12, 13, 15 en 16. Over het geheel genomen de cross-linking effecten waren marginale sectoren 2 en 3 met geen effect waargenomen in sector 4 (dat wil zeggen, de meest afgelegen locatie van de injectieplaats), vergelijkbaar met het monster van 40 mM. Deze resultaten aangegeven dat er een '' zone van effect'' en dat dit soort patroon kon worden verwacht na een injectie van de sT van de cross-linking agent. Dit kan wijzen op de noodzaak voor injectie in verschillende locaties om een effect over een groot gebied van weefsel.
Studie van de cross-linking effecten veroorzaakt in intact ogen TXL evalueren met twee concentraties van SMG werd ook uitgevoerd. Thermische denaturatie analyse van weefsel dat onderging dergelijke scleral dwarsbinding werd uitgevoerd. Cross-linking tijd was 3,5 h voor TXL met behulp van drie verschillende concentraties, 40 (Tm = 1.11 +/-1.2), 100 (Tm = 5.12 +/-2.9), en 400 (Tm = 14,34 +/-1.1) mM SMG. De resultaten toonden aan dat er een concentratie afhankelijke effect gezien in SMG kruislings gekoppelde weefsel is.
Tweede harmonische generatie (SHG) imaging als een methode om te evalueren van TXL dwarsbinding effect:
SHG microscopie beelden werden geanalyseerd zowel voor pixel intensiteit van de SHG-signaal en vezels bundel waviness. Een ruime hoeveelheid dwarsbinding concentraties (van 40 tot 400 mM) werd gebruikt om te verkennen van de SHG signaal veranderingen die over een breed scala optreden kunnen aan effecten dwarsbinding. Met behulp van het histogram analyse vermogen opgenomen in de Fiji beeldverwerking programma20, bleek het mogelijk om het kwantificeren van het signaal van de SHG geproduceerd in scleral weefsel door sT injectie, vergelijken van de effecten op 40 mM die geïnduceerde gebruik van 400 mM. Het gemiddelde verschil in gemiddelde pixel intesities op 40 mM waren 66.3 ± 27,7 ten opzichte van 361.4 ± 28.3 voor de 400 mM monsters, een verhoging van bijna 6-fold. Dit komt overeen met een toename van de weefsel dwarsbinding, aangezien de overeenkomstige toename van Tm ook onder deze omstandigheden werden vastgesteld. Figuur 2 toont representatieve SHG beelden van sclera ontleend aan controle (figuur 2A), 40 mM (figuur 2B), en 400 mM (figuur 2C). De begeleidende histogram analyse, met inbegrip van gemiddelde helderheid (of pixel intensiteit) wordt ook weergegeven. Bedroeg het totale aantal afbeeldingen geanalyseerd: 120 voor 40 mM en 98 voor haar controle; 121 voor 400 mM en 94 voor haar eigen controle. De diepte van het weefsel imaging was 10 tot 15 µm van het oppervlak episcleral. De resultaten van de analyses van het histogram, die betrokken de gemiddeld van talrijke afbeeldingsvelden zijn, aangegeven dat hogere concentraties van cross-linking effect (Figuur 3) geproduceerd groter pixel intensiteiten.
Zoals blijkt uit Figuur 4, werd ook een beeldanalyse uitgevoerd met methoden uit de cardiovasculaire bloedvat literatuur, met behulp van de plugin ImageJ ''Neuron J''21aangenomen. Wij geschat de waviness factor W = lengte [kromme] / lengte [lineaire] en we waargenomen dat dwarsbinding resulteerde in het rechttrekken van vezelbundels zoals aangegeven door een verminderde waviness % in 40 mM en 400 mM kruislings gekoppelde sclera versus onbehandeld controlegewas sclera (W % (W [= SMG]-1)/(W[Control]-1), tabel 2). Het verschil in waviness tussen 40 en 400 mM SMG behandeld monsters was niet statistisch significant.
Figuur 1 : Lokalisatie van TXL effect via sT injectie met behulp van 40 en 400 mM SMG.
(A) schematische weergave van 4 scleral sectoren (nummers 1-4 in grote rode holle lettertype), met sclera onderverdeeld in vierkantjes [nummers 1-16 in kleinere zwarte dunne lettertype] (niet op schaal getekend) onderging thermische analyse. De injectieplaats kwamen overeen met het centraal gelegen plein (plein 2) in sector 1. Het thermische denaturatie dwarsbinding effect van TXL met (1B) 40 mM SMG en 1 C 400 mM SMG. (D) kleurgecodeerde temperatuur schaal legende voor (B) en (C). Dit cijfer is gewijzigd van Zyablitskaya et al. met toestemming22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief beelden van concentratie afhankelijke stijgingen van de SHG signaalniveaus helderheid geproduceerd na TXL gebruik van SMG via sT injectie van sclera ex vivo . Concentraties van SMG worden weergegeven als (B) 40 mM en (C) 400 mM. Elke afbeelding bevat een 50 µm omvang bar (juiste lagere hoek) en de gemiddelde intensiteit pixelwaarde (rechterbovenhoek) - absolute waarden. Dit cijfer is gewijzigd van Zyablitskaya et al. met toestemming22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Staafdiagram van de verandering (Δ) in SHG pixel signaalsterkte (in vergelijking met een gekoppelde besturingselement van het dezelfde konijn hoofd) in scleral intact globes kruiselings gekoppelde via sT injectie (TXL) met 40 en 400 mM SMG oplossingen. Gemiddelde waarden met de standaardfout van het gemiddelde waren: 66 ± 27,7 voor 40 mM en 361 ± 28.3 voor 400 mM. Dit cijfer is gewijzigd van Zyablitskaya et al. met toestemming22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Voorbeeld van waviness Vezelanalyse (zoals verwoord door lineariteit). Afbeelding van controlemonster voor 40 mM SMG concentratie met een schaal van 50 µm bar (juiste lagere hoek). Dit cijfer is gewijzigd van Zyablitskaya et al. met toestemming22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Schematische weergave van sT injectie. Genummerd van 1-3 gebieden komen overeen met gebieden vertegenwoordigd in de figuur 1A. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| ±Δ Tm | ||
| gebied | 40mM | 400mM |
| 1 | 3.4 ±2.8 | 20.5 ±0.6 |
| 2 | 3.4 ±0.53 | 19.58 ±1.5 |
| 3 | 2.5 ±2.47 | 17.99 ±3.06 |
| 4 | 0,72 ±0.9 | 20,36 ±0.19 |
| 5 | 0,85 ±0.55 | 19.11 ±1.33 |
| 6 | 0.52 ±1.35 | 18.66 ±4.1 |
| 7 | 0.78 ±1.6 | 18.44 ±2.8 |
| 8 | 0.56 ±0.9 | 17.77 ±2.69 |
| 9 | 0,22 ±0.6 | 18.92 ±2.6 |
| 10 | 0.46 ±0 | 8.75 ±10.56 |
| 11 | 0.47 ±0.18 | 0.63 ±1.84 |
| 12 | 0.11 ±0.08 | 0,66 ±1.52 |
| 13 | 0.08 ±0.05 | 0.71 ±2.17 |
| 14 | 0,22 ±0.7 | 5.71 ±0.29 |
| 15 | 0.32 ±0.2 | 0.29 ±0.7 |
| 16 | 0,24 ±0.73 | 0,26 ±0.79 |
Tabel 1: DSC resultaten voor lokalisatie van TXL effect studie. Verandering in thermische smeltende temperaturen (ΔTm) met standaardfouten voor elke bemonsterde sector is zoals afgebeeld in figuur 1A. Elke waarde wordt uitgedrukt als het verschil in Tm ascompared naar de gekoppelde besturingselement en is een gemiddelde van minimaal 3 onafhankelijke vaststellingen.
| SMG, mM | Waviness | Waviness-% | t-toets vs. [0 mM SMG] |
| 0 | 1.106 ± 0.044 | 100 | |
| 40 | 1.067 ± 0,017 | 63 | p < 0.02 |
| 400 | 1.059 ± 0.009 | 55 | p < 0.003 |
| Lineaire vezels | 1,000 | 0 | |
| (Theoretische) |
Tabel 2. Resultaten van waviness Vezelanalyse. SHG beelden uit de omgeving van TXL injectie werden geanalyseerd voor de mate van waviness van de vezel met behulp van Neuron J software. Tien vezels werden geselecteerd uit elk beeld en een totaal van ongeveer 100 vezels werden geanalyseerd voor de mate van waviness. Gemiddelde waarden met de standaardfout van het gemiddelde zijn opgenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uitgevoerde experimenten hebben aangetoond bewijs ter ondersteuning van het gebruik van de SHG signaal microscopie als een methode voor de evaluatie van collageen dwarsbinding effecten in sclera, verhogen van de toekomstige mogelijkheid van het gebruik van deze techniek als een controle-instrument voor de dwarsbinding behandelingen die gericht collageen eiwitten. Van de nota is een instrument al in klinische gebruik dat potentieel dit signaal SHG kan vangen. Hoewel dit instrument was vooral bedoeld voor imaging huid menselijke dermis, is het gebruikt met succes tot en met afbeelding cornea en sclera23.
Het is noodzakelijk om identieke scanning en imaging voorwaarden bij het vergelijken van controle en monsters behandeld. Tweede harmonische generatie microscopie van collageen in sclera weefsel vereist een fluorescentie Microscoop compatibel met meerdere photon imaging, een gepulseerde infrarood laser afstembare in het golflengtegebied van 800-900 nm, en een zeer gevoelige detector zoals de GaAsP niet-descanned (NDD) detectoren. In dit manuscript beschreven richtlijnen vormen een vertrekpunt. De voorwaarden moeten worden vastgesteld, speciaal voor de nieuwe experimenten of voor de verschillende systemen.
De cornea en sclera ook geëvalueerd gelijktijdig in studies met behulp van deze techniek24,25,26,27. Wetende dat het SHG-signaal zich in zowel voorwaartse en achterwaartse richting voortplant, hebben verschillende studies onderzocht hoornvlies weefsel onafhankelijk in zijn geboortestaat28,29,30,31, 32,33,34 en in keratoconus35,36 , alsmede na CXL (zoals hieronder wordt besproken). De resultaten van deze studies blijkt dat het hoornvlies signaal in de voorwaartse verspreide richting, wat logisch is gezien het hoornvlies van transparantie en het feit dat licht doorlaten van het weefsel stakingsrecht een monitor in voorwaartse verspreide systemen wordt geoptimaliseerd. Typisch, het SHG-signaal is in de blauwe zichtbaar bereik en zal sterk worden verminderd wanneer een zeer verstrooiing weefsel zoals de sclera oog passeren. Dientengevolge, zou detectie van de voorwaartse verspreide SHG vereisen een dunne sectie weefsel van 50 μm of minder in dikte, evenals een speciale optische set-up. In tegenstelling, het achterwaarts-verstrooid signaal kan worden vastgelegd door de regelmatige lichtpad van een fluorescentie Microscoop zonder weefsel afdelen en daarom deze modus heeft de voorkeur wanneer imaging collageen in intact sclera weefsel tot een diepte van 30-40 μm. In deze studie merkte we een verhoging van de concentratie-afhankelijk in signaal dichtheid. Het is echter heel goed mogelijk, dat de TXL extra en soortgelijke effecten op de diepere lagen van de sclera zouden kunnen gehad hebben, en dat zou het effect meer uitgesproken en uit te breiden naar diepere lagen, met name met de hogere concentratie. Echter, als gevolg van de beperkte SHG signaal penetratie in de sclera en voor de doeleinden van deze eerste studie kozen we om te werken met de beste kwaliteitsbeelden, die zijn verkregen uit de meest oppervlakkige sclera (15 µm diepte). In de toekomst studies, zullen we overwegen diepte afhankelijke effecten volgende TXL methoden zoals dit kan extra belangrijke informatie verschaffen over de vraag waarom zelfs grotere verschillen niet werden waargenomen tussen 40 en 400 mM behandelde monsters.
Bovendien, met betrekking tot het gebruik van de SHG voor de evaluatie van riboflavine CXL geïnduceerde weefsel dwarsbinding, SHG microscopie imaging volgende riboflavine CXL van het hoornvlies zijn gemeld door verschillende groepen37,-38,39 , 40 , 41. in een studie van Steven et al. 37, hoornvlies stabilisatie met behulp van de CXL-techniek resulteerde in een '' homogenisering '' van signaal en verlies van weefsel '' plooien '' of '' golvingen '' gezien in niet-kruis-unit linked monsters. Deze typen wijzigingen, echter werden ook opgemerkt in een studie ter evaluatie van de effecten van veranderingen in IOP op hoornvlies SHG signalen, verhogen van de mogelijkheid van technische artefacten. Organisatorisch van de fibril, alsmede de hogere orde vezel bundel/lamellaire organisatie oogpunt, de sclera en hoornvlies zijn heel verschillend en is veel bekend over deze verschillen van elektronenmicroscopie studies. De twee weefsels verschillen met betrekking tot verpakken, fibril waarin de verdeling van de diameter fibril (kleine uniforme fibrillen voor het hoornvlies en variabele diameter fibrillen voor de sclera) en inter fibril afstand (uniform voor hoornvlies en variabele voor sclera). Als goed, is de hogere orde organisatie in lamellaire bladen (hoornvlies) versus vezelbundels (sclera) heel anders. Dergelijke structurele verschillen worden weerspiegeld in de signalen van de SHG geproduceerd door deze twee weefsels. Dus, veranderingen bij dwarsbinding kunnen wijzigen het SHG signaal verschillende maar parallelle manieren. Met andere woorden, waren de '' straightening'' van vezels in de sclera waargenomen in deze studie, en de '' homogenisering '' van signaal in het hoornvlies gemeld in de literatuur, beide het resultaat van collageen dwarsbinding wijziging. Dus, het effect van de '' homogenisering '' in het hoornvlies op een bepaalde manier zou analoog aan het '' straightening'' effect van de sclera die hier heeft gemeld.
De mechanismen die leiden dit straightening effect tot, geproduceerd door TXL zijn onduidelijk op basis van de huidige studie. Een mogelijkheid zou kunnen zijn dat het weefsel een of andere manier '' vast was '' in een mechanisch '' geladen '' positie. Dit zou een steun in het idee dat geïnduceerde '' fibril en vezel stabilisatie '' had plaatsgevonden. Veranderingen in de intraoculaire druk waarschijnlijk niet heeft bijgedragen aan dit effect omdat IOP was gecontroleerd vóór en na de injectie van de sT en stabiel gebleven. Over het algemeen de betekenis van deze opmerkingen zijn onduidelijk en verdere studies noodzakelijk zal zijn. Van de nota, aparte beeldvormende technieken zoals Brillouin microscopie42, die is gebleken om kwantitatieve metingen van de cross-linking (zoals bepaald door afschuifmodulus) na CXL Fotochemie nuttig kan zijn bij de bevestiging van de bevindingen met SHG beeldvorming in deze studie. Echter moet worden opgemerkt dat het gebruik ervan met zeer verstrooiing weefsels zoals de sclera43, technische wijzigingen vereist en is niet gevalideerd met kruislings gekoppelde scleral weefsel.
Laser polarisatie en SHG microscopie is een belangrijke kwestie. Het laserlicht is lineair gepolariseerd en georiënteerde loodrecht op de richting van de SHG signaal voortplanting en onder sommige hoek in de xy-oppervlakte met elke collageen vezels. Dus, vezels in de xy-oppervlakte die goed uitgelijnd en precies loodrecht op de gepolariseerde laserlicht zal produceren een hogere SHG signaal dan die bij andere hoeken, met inbegrip van die parallel aan het invallende licht (dat wil zeggen, z-plane), die zal produceren de laagste SHG signaal (als gevolg van destructieve interferentie). Met betrekking tot de sclera weefsel, collageen vezels gericht op verschillende hoeken op een microscopisch niveau, zijn hoewel de voorkeur anatomische vezel oriëntaties zijn bekend op basis van globe locatie. Dus, aangezien het signaal van de SHG geproduceerd afhankelijk van de invalshoek van de xy-oppervlakte van elke vezel variëren zal, het totale signaal kan minder zijn dan die welke zouden worden geproduceerd als alle de collageenvezels waren precies uitgelijnd onder dezelfde hoek (in een weefsel zoals een pees bijvoorbeeld). Dus in deze studie, vanwege de aard van het monster image wordt gemaakt, de richting van polarisatie was niet opzettelijk bepaald maar consequent door de studie werd gehouden. Bovendien zorgden we verkrijgen weefsels van behandeld en controle globes uit identieke scleral regio's, minimaliseren van eventuele verschillen in vezels richting tussen de monsters. Ten slotte, geanalyseerd wij meer dan 100 afbeeldingen per monster met het oog op de intensiteitswaarden. Deze uitgebreide evaluatie moet hebben genormaliseerd geen afwijkende SHG signalen die mogelijk zijn geregistreerd. Dat gezegd zijnde, is het mogelijk dat als gevolg van de "vezel straightening" dat we waargenomen in de kruiselings gekoppelde monsters (zie hierboven), een groter deel van "in focal plane" vezels kunnen hebben bijgedragen aan de stijging van de SHG signaal evenals verhoogd SHG signalen van grotere uitlijning van de xy-oppervlakte. Beide van deze mogelijkheden zou uitingen van geïnduceerde cross-linking effecten.
Een regionale analyse van de cross-linking wijzigingen (door Tm) geïnduceerd door een sT-injectie van SMG werd uitgevoerd. Zoals verwacht, was het niveau van de cross-linking effect geconcentreerd in het gebied van de injectie. Weinig of geen cross-linking effect werd opgemerkt in het gebied direct tegenover (verst weg) van de injectie, consistent met wat is bekend over de lokalisatie van effect na sT injectie, zoals blijkt uit de echografie lokalisatie44, 45 en tomografie46berekend.
Tot slot, met betrekking tot de cross-linking therapie en bijziendheid, collageen cross-linking van het hoornvlies is het vinden van wijdverbreide gebruik in de behandeling van hoornvlies destabilisatie inclusief keratoconus, post LASIK keratectasias, pellucid marginale degeneratie (PMD), en als een aanvulling op refractieve chirurgische ingrepen47. Het succes van de behandeling van ziekte van de cornea met dwarsbinding heeft geleid tot de verkenning van de toepassing van deze aanpak van de behandeling aan de achterkant van het oog en in het bijzonder, de sclera, voor het beperken van axiale rek in hoge bijziendheid2, een concept dat tot teruggaat de zeer vroegste stadia van de therapeutische cross-linking concept48,49.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Tongalp Tezel, MD, voor raadpleging met betrekking tot sT injectie; Theresa Swayne, PhD, voor raadpleging met betrekking tot de SHG microscopie; en Jimmy Duong uit de ontwerp- en Biostatistiek Resource- alsmede de Biostatistical kern faciliteit van het Irving Institute at Columbia University Medical Center.
Deels gesteund door onderzoek te voorkomen blindheid en door de nationale instituten van gezondheid subsidies NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007 NCI P30 CA013696 en NEI R01EY020495 (DCP). Verwante intellectuele eigendom van de eigenaar van de Columbia University: U.S. afgegeven octrooien neen: 8,466,203 en no: 9,125,856. International patent aangevraagd: PCT/US2015/020276.
Beelden werden verzameld in de Confocal en gespecialiseerd microscopie gedeelde Resource van de Herbert Irving uitgebreide Cancer Center aan de Columbia University, ondersteund door de NIH grant #P30 CA013696 (National Cancer Institute). De confocal microscoop werd gekocht met NIH verlenen van #S10 RR025686.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V | EMD Millipore, Massachusetts, USA | Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1 | |
| Sodium hydroxymethylglycinate | Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA | Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2 | |
| Injection needle with luer-lock syringe | BD Eclipse, NJ, USA | Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1 | |
| Rabbit head | La Granja poultry | Outbred | Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2 |
| Tono-pen | Reichter Technologies Depew, NY | IOP measurements - protocol step 2.4 | |
| DSC 6000 Autosampler | Perkin-Elmer Waltham, MA, USA | Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4 | |
| Pyris software | Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA | Ver 11.0 | protocol step 7.5 |
| CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1. | |
| GenTeal | Alcon, Fort Worth, TX | B000URVDQ8 | Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1 |
| Chameleon Vision II | Coherent, Santa Clara,CA, USA | Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11 | |
| AttoFluor cell chamber | Thermo Fisher Scientific Inc | A7816 | Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3 |
| 25-mm round coverslips, #1.5 | Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA | GG-25-1.5 | protocol step 8.1.3 |
| Eclipse Ti-E | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | protocol step 8.1.4. | |
| Non-descanned (NDD) GaAsP detector | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7 | |
| A1R-MP laser scanning system | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8 | |
| NIS Elements software | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Ver 4.3 | refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9 |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | protocol step 9.1.2 | |
| NeuronJ | Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands | https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | Ver 14 | protocol step 9.2.8 |
References
- McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
- Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Ophthalmic Physiol Opt. 33 (3), 385-389 (2013).
- Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
- Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon's administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90 (6), 787-793 (2003).
- Guise, P. Sub-Tenon's anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
- Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon's capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196 (1), 103-108 (2013).
- Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27 (3), 353-356 (2008).
- Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91 (4), e253-e257 (2013).
- Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89 (2015).
- Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1274-1282 (2015).
- Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35 (4), 550-556 (2016).
- da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. , (2017).
- Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42 (4), 528-533 (2017).
- Freund, I., Deutsch, M.
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215 (6), 682-691 (2009).
- Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10 (83), 20121004 (2013).
- Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (1), 21-29 (2017).
- Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14 (6), 064040 (2009).
- Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13 (15), 5791-5797 (2005).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1216-1224 (2006).
- Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Jr Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34 (24), 3779-3781 (2009).
- Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32 (11), 1784-1791 (2006).
- Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2459-2465 (2010).
- Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 8818-8827 (2011).
- Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 911-915 (2011).
- Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (4), 2476-2481 (2014).
- Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5622-5629 (2015).
- Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
- Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8377-8385 (2014).
- Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (3), 1087-1094 (2007).
- Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36 (12), 2150-2159 (2010).
- Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (8), 5325-5331 (2011).
- McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33 (2), 125-130 (2014).
- Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3584-3592 (2015).
- Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4231-4238 (2011).
- Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
- Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24 (19), 22232-22238 (2016).
- Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon's cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17 (9), 1003-1007 (2003).
- Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon's, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25 (1), 56-59 (1999).
- Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17 (4), Fi72-Fi74 (1998).
- Meek, K. M., Hayes, S.
- Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30 (3), 689-695 (2004).
- Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87 (3), 279-285 (2008).
