इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक तकनीक विकसित मानव मस्तिष्क के Zika वायरस संक्रमण मॉडल के लिए इस्तेमाल किया । wildtype या इंजीनियर स्टेम सेल लाइनों का प्रयोग, शोधकर्ताओं इस तकनीक का उपयोग करने के लिए विभिंन तंत्र या उपचार है कि जल्दी मस्तिष्क संक्रमण को प्रभावित कर सकते है और जिसके परिणामस्वरूप Zika वायरस में microcephaly संक्रमित भ्रूण को उजागर कर सकते हैं ।
अतिसंवेदनशील आबादी में Zika वायरस (ZIKV) का हाल ही में उद्भव microcephaly और नवजात शिशुओं में अन्य neurodevelopmental स्थितियों में अचानक वृद्धि हुई है । जबकि मच्छरों वायरल संचरण का मुख्य मार्ग है, यह भी यौन संपर्क और ऊर्ध्वाधर मां से भ्रूण संचरण के माध्यम से फैल दिखाया गया है । संचरण के इस उत्तरार्द्ध मामले में, ZIKV के अद्वितीय वायरल tropism के कारण, वायरस को मुख्य रूप से विकासशील मस्तिष्क के तंत्रिका जनक कोशिकाओं (NPCs) को लक्षित करने के लिए माना जाता है ।
यहां ZIKV संक्रमण मॉडलिंग के लिए एक विधि है, और जिसके परिणामस्वरूप microcephaly, जब मानव मस्तिष्क organoids ZIKV रहने के लिए उजागर कर रहे है वर्णित है । organoids उनके तंत्रिका जनक जनसंख्या के भीतर वायरस के उच्च स्तर का प्रदर्शन, और समय के साथ गंभीर कोशिका मृत्यु और microcephaly प्रदर्शन । यह तीन आयामी सेरेब्रल organoid मॉडल शोधकर्ताओं प्रजातियों का संचालन करने के लिए मिलान प्रयोगों का पालन करने के लिए अनुमति देता है और संभावित विकासशील मानव मस्तिष्क के ZIKV संक्रमण के साथ हस्तक्षेप. मॉडल मानक दो आयामी तरीकों पर बेहतर प्रासंगिकता प्रदान करता है, और मानव विशेष सेलुलर वास्तुकला और प्रोटीन अभिव्यक्ति है कि पशु मॉडलों में संभव नहीं है शामिल हैं ।
Zika वायरस (ZIKV) तेजी से माइक्रोनेशिया, फ्रेंच पोलिनेशिया, और अमेरिका में फैल गया है, और हाल ही में अपरा बैरियर पार करने के लिए दिखाया गया है1,2 विकासशील भ्रूण मस्तिष्क को संक्रमित करने के लिए, neurodevelopmental रोगों के लिए अग्रणी ऐसे microcephaly3,4,5,6 के रूप में । इन रोगियों के जीवन पर दीर्घकालिक प्रभाव है, और उपचार के मौजूदा कमी, शोधकर्ताओं और चिकित्सकों नेतृत्व में ZIKV संक्रमण और प्रतिकृति के पीछे तंत्र की एक बेहतर समझ के लिए हाथापाई है । पिछले अध्ययनों से इन विट्रो प्रणालियों में के ZIKV संक्रमण की जांच की है शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेल प्रकार7,8,9, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से vivo में10 के साथ असुरक्षित और प्रतिरक्षा चूहों11,12,13 और गैर मानव रहनुमाओं14,15,16। इन अधिक परंपरागत तकनीकों के अलावा, कई समूहों स्टेम सेल लागू किया है-सेरेब्रल organoids व्युत्पंन के लिए विकासशील मानव मस्तिष्क के ZIKV संक्रमण के बारे में अधिक समझते हैं । इन समूहों मानव सेरेब्रल organoids का उपयोग किया है microcephaly phenotype17,18की पुष्टि करने के लिए, वायरस प्रविष्टि19से जुड़े रिसेप्टर्स की जांच,20 संक्रमण के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं की जांच , 21, और संभावित दवा के लिए स्क्रीन उंमीदवारों22। यहां तेजी से उत्पादन और संक्रमित स्टेम सेल व्युत्पंन सेरेब्रल organoids के लिए एक तकनीक का वर्णन किया है, के रूप में पहले दिखाया गया है19, विकासशील मानव मस्तिष्क के ZIKV संक्रमण की समझ में सुधार करने के लिए ।
चूंकि organoids मानक pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) संस्कृतियों से बना रहे हैं, इस तकनीक वैज्ञानिक प्रश्नों की एक किस्म के लिए अनुमति देता है विकासशील मस्तिष्क के वायरल संक्रमण के बारे में जवाब दिया जाएगा । उदाहरण के लिए, CRISPR इंजीनियरिंग का उपयोग इन पीएससी लाइनों को organoid संक्रमण से पहले संशोधित करने के लिए किया जा सकता है जिससे vivo जेनेटिक स्टडीज19 में सबसे अधिक तेज दर पर है । इसके अतिरिक्त, मानक दो आयामी (2d) विभेद संस्कृतियों के विपरीत, organoids जटिल सेलुलर वास्तुकला है कि corticogenesis के लिए महत्वपूर्ण है प्रदर्शन, और हाल के अध्ययनों से पता चला है कि इस वास्तुकला संक्रमण पर बाधित हो सकता है 21. अंत में, organoids पैदा करने के अपेक्षाकृत कम लागत उच्च प्रवाह प्रयोग और स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है जब vivo में मॉडलों की तुलना में । दूसरी ओर, वहां organoids के उपयोग के लिए कुछ नुकसान ZIKV अध्ययन कर रहे हैं । जबकि organoids 2 डी संस्कृतियों की तुलना में अधिक तार्किक रूप से प्रासंगिक हैं, वहां organoids के आकलन में अतिरिक्त चुनौतियां है उनके तीन आयामी (3 डी) प्रकृति के कारण । इमेजिंग और organoids के पृथक्करण के लिए और अधिक उपकरण और मानक 2 डी संस्कृतियों की तुलना में संसाधनों का एक बड़ा निवेश को शामिल करने के लिए जाता है । इसके अतिरिक्त, organoids vasculature और प्रतिरक्षा घटक है कि में मौजूद है कमी vivo मॉडल में , इसलिए शोधकर्ताओं ने वायरल संक्रमण के उन पहलुओं में रुचि के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल की तलाश की सलाह दी है ।
वहां संस्कृति में मानव organoids और neurospheres के गठन के लिए तकनीक का एक नंबर रहे हैं, और वे आम तौर पर नमूनों या un pattern ed श्रेणियों के भीतर गिर जाते हैं । नमूनों तरीके Wnt, BMP, TGFβ, और अंय संकेत रास्ते को विनियमित करने के लिए विशिष्ट वंश23की ओर भेदभाव धक्का कारकों को लागू । ऐसी एक यहां वर्णित के रूप में unpatterned तरीके,, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) और मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESCs) के लिए प्रवृत्ति का लाभ लेने के लिए डिफ़ॉल्ट द्वारा एक neuroectodermal वंश की ओर अंतर24। भेदभाव के लगभग तीन सप्ताह के बाद, जिसके परिणामस्वरूप organoids बड़े, biomimetic neuroepithelial संरचनाओं कि कई कोशिका प्रकार है कि जल्दी विकासशील मस्तिष्क में मनाया जाता है शामिल हैं ।
मानक, फीडर मुक्त पीएससी संस्कृतियों से organoids के उत्पादन के लिए तकनीक, और ZIKV के साथ इन organoids संक्रमण पूर्ण में प्रस्तुत किया है । संवर्धन फीडर मुक्त पीएससी के लिए आवश्यक तरीकों पर मार्गदर्शन के लिए, पिछले तरीकों प्रकाशन25,26कृपया देखें । इसके अतिरिक्त, कई प्रयोगों के लिए वायरस के अनुरूप मात्रा लागू करने के लिए, यह समय से आगे मुि की गणना करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह वीरो कोशिकाओं के संक्रमण का आयोजन, मध्यम, गर्मी और immunostaining ओवरले के साथ उपचार के बाद किया जाता है । वर्णन और इस तकनीक के तरीकों को पहले19,27वर्णित किया गया है ।
एक बार जब पीएससी संस्कृति 50%-७०% के लक्ष्य संगम पर पहुंचती है, तो कोशिकाओं को असंबद्ध और अल्ट्रा-कम लगाव ९६-वेल प्लेट्स में एकत्रित कर लिया जाता है । कोशिकाओं एक्सो में 3 दिनों के लिए बनाए रखा है मुक्त स्टेम सेल रखरखाव मीडिया (SCMM), और फिर संस्कृति के शेष के लिए एक तंत्रिका प्रेरण मीडिया में परिवर्तित । एक बार organoids 3 सप्ताह के लिए भेदभाव किया है, संक्रमण का आयोजन किया जा सकता है । नियमित रूप से संक्रमण के बाद सप्ताह के दौरान छवियों को लेकर, शोधकर्ताओं प्रगतिशील सेल मौत और organoid के विघटन का निरीक्षण करेंगे । शोधकर्ताओं ने इस समय organoids को transcriptional या proteomic profile का संचालन करने के लिए अलग भी कर सकते हैं । Cryosectioning और lightsheet तरीकों इमेजिंग के लिए सिफारिश की है, और शोधकर्ताओं ने संक्रमण और वायरल प्रतिकृति के उच्च स्तर विशेष रूप से तंत्रिका जनक सेल (एनपीसी) में organoids में आबादी के भीतर देखने की उंमीद कर सकते हैं । अंततः, इस तकनीक शोधकर्ताओं तेजी से कम लागत और सीमित उपकरणों के साथ मानव मस्तिष्क के वायरल संक्रमण के तंत्र की जांच करने के लिए अनुमति देता है ।
1. iPSC/hESC 2d संस्कृति से सेरेब्रल Organoids बनाना (0 दिन)
नोट: यह प्रोटोकॉल मानता है कि स्टेम सेल (SC) रखरखाव SCMM माध्यम में आयोजित किया जाता है एक vitronectin या Geltrex के साथ सब्सट्रेट. यदि एक वैकल्पिक, उच्च प्रोटीन स्टेम सेल संवर्धन मीडिया का उपयोग कर, यह संक्रमण अनुसूचित जाति संस्कृतियों के लिए सलाह दी जाती है organoid गठन की शुरुआत से पहले ंयूनतम दो मार्ग के लिए SCMM । प्रोटोकॉल फीडर आधारित अनुसूचित जाति संस्कृति विधियों के साथ परीक्षण नहीं किया गया है । नियमित SC रखरखाव विधियों का उपयोग 25 , 26 , संस्कृतियों को 50%-७०% संगम में लाएं । यह आमतौर पर 3-4 दिन passaging के बाद है, हालांकि यह संस्कृति विधि और सेल लाइन पर निर्भर कर सकते हैं । नोट: एक 6-अच्छी तरह से थाली से लगभग 2 कुओं organoids. की एक पूरी ९६ अच्छी तरह से थाली का उत्पादन करने की जरूरत है 10x-20X आवर्धन पर brightfield माइक्रोस्कोपी के माध्यम से संस्कृतियों का निरीक्षण करने के लिए स्वस्थ कॉलोनी आकृति सुनिश्चित, कोई पता लगाने के भेदभाव के साथ । लाओ SCMM को ३७ & #176; ग एक गरम पानी में स्नान, और गल एक ५० & #181; एल की शीशी ५० mM Y-२७६३२ (रॉक अवरोधक) और एंजाइमी टुकड़ी के 2 मिलीलीटर के कमरे के तापमान के लिए एजेंट । एक अल्ट्रा कम लगाव (ुला) U-नीचे ९६ अच्छी तरह से थाली, एक मल्टीचैनल P200 पिपेट, और एक 25 मिलीलीटर एजेंट जलाशय तैयार करते हैं । Aliquot ४५ मिलीलीटर में SCMM के ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब, और जोड़ें ४५ & #181; L के ५० mM Y-२७६३२ । triturating. द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण वैक्यूम SCs युक्त दो कुओं महाप्राण, और जल्दी से एक अच्छी तरह से एक P1000 पिपेट का उपयोग करने के लिए एंजाइम मुक्त टुकड़ी के 1 मिलीलीटर एजेंट जोड़ें । एक ३७ & #176 में थाली मशीन, 4 min. के लिए सी मशीन वैक्यूम इलाज कुओं महाप्राण, और एक अच्छी तरह से एक P1000 पिपेट का उपयोग करने के लिए एंजाइमी टुकड़ी रिएजेंट के 1 मिलीलीटर जोड़ें । में थाली एक ३७ & #176; सी एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए मशीन थाली निकालें और इलाज कुओं की जांच । धीरे थाली पर नल को एकत्रित कोशिकाओं को तोड़ने के लिए । यदि बड़े सेल क्लस्टर अभी भी दिखाई दे रहे हैं, ३७ पर 2 अतिरिक्त मिनट के लिए थाली मशीन & #176; C. इस चरण को दोहराएँ जब तक कि क्लस्टर अब नग्न आंखों से दिखाई दे रहे हैं. एक बार कोशिकाओं को ठीक से असंबद्ध हैं, SCMM एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए एक अच्छी तरह से पृथक्करण के 1 मिलीलीटर जोड़ें । पूल एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब में सेल निलंबन के 4 मिलीलीटर और सेल गिनती के लिए एक छोटे से aliquot ले लो । के रखरखाव की थाली में किसी भी शेष, अनुपचारित कुओं को वापस ३७ & #176; सी मशीनर. जबकि गिनती, 5 मिनट के लिए ३०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करते हैं, और SCMM + Y-२७६३२ समाधान है कि एक ६०,००० कोशिकाओं/एमएल निलंबन प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा की मात्रा की गणना ध्यान से वैक्यूम महाप्राण supernatant और SCMM + Y-२७६३२ समाधान की गणना की मात्रा जोड़ें । एक समान सेल सस्पेंशन को सुनिश्चित करते हुए 5 मिलीलीटर प्लास्टिक के साथ 5-10 बार मिक्स करें । तुरंत एक रिएजेंट जलाशय में सेल निलंबन हस्तांतरण, और पिपेट १५० & #181; ुला U-नीचे ९६ के प्रत्येक कुआं में अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल P200 पिपेट का उपयोग कर प्लेट । यह ९६ व्यक्तिगत organoids, प्रत्येक शुरू में ९,००० कोशिकाओं से मिलकर पैदा करता है । 1 min. के लिए १५० x g पर थाली केंद्रापसारक प्लेट को ३७ & #176; सी मशीन में रखें, और ४८ h. के लिए प्लेट डिस्टर्ब न करें
2. सेरेब्रल Organoid मेंटेनेंस (Day 2) 17 एमएल SCMM के 17 & #181; ५० mM Y-२७६४३ का ५०-एमएल शंकु ट्यूब में तैयार करें । गर्म SCMM + Y-२७६३२ समाधान के लिए ३७ & #176; C एक गरम पानी में स्नान । मशीन से organoid प्लेट ले, और एक मल्टीचैनल P200 पिपेट सेट करने के लिए ७५ & #181 का उपयोग कर, एल, धीरे से पहली पंक्ति पर अच्छी तरह के किनारे से मध्यम आकर्षित. एक बार मध्यम खींचा गया है, जल्दी से अच्छी तरह से मध्यम वापस निष्कासित करने के लिए ढीला कोशिकाओं और organoids उठा । प्रत्येक पंक्ति के लिए यह दोहराएं । नोट: यह तकनीक, इसके बाद एक & #34;d ispersion, & #34; सेलुलर मलबे और निलंबन में organoid लिफ्टों के रूप में संदर्भित । organoid तेजी से अच्छी तरह से नीचे करने के लिए डूब, जबकि छोटे मलबे निलंबन में रहता है, यह एक मीडिया परिवर्तन के साथ हटाया जा करने की अनुमति । यह संस्कृति के दौरान सेलुलर मलबे में आराम करने से organoid को रोकने में मदद करता है । के बाद सभी कुओं फैलाया गया है, 15 एस के लिए प्रतीक्षा करने के लिए सुनिश्चित करें कि organoids एक अच्छी तरह से नीचे के लिए डूब गया है । धीरे और जतन महाप्राण ७५ & #181; प्रत्येक अच्छी तरह से मल्टीचैनल P200 पिपेट का उपयोग और एक अपशिष्ट जलाशय में बांटना से माध्यम के एल । नोट: अधिकांश उपयोगकर्ता कभी-कभार नियमित फ़ीड्स के दौरान एक organoid महाप्राण । यह समय के लगभग 1% हो सकता है । कृपया तदनुसार योजना सुनिश्चित करें कि पर्याप्त organoids प्रयोगात्मक समय अंक के लिए जीवित रहने के लिए । स्थानांतरण SCMM + Y-२७६३२ समाधान एक रिएजेंट जलाशय में, और वितरण १५० & #181; L प्रत्येक organoid में अच्छी तरह से मल्टीचैनल P200 पिपेट का उपयोग कर. थाली में वापस एक ३७ & #176; सी मशीनर.
3. सेरेब्रल Organoid मेंटेनेंस (Day 3) उष्ण 17 एमएल के SCMM से ३७ & #176; ग, इस समय बिना Y-२७६४३. के साथ मल्टीचैनल P200 पिपेट सेट के लिए १०० & #181; L, organoid प्लेट के सभी कुओं को फैलाएं (चरण २.२ देखें). रुको 15 एस सुनिश्चित करें कि organoids उनके कुओं के नीचे करने के लिए डूब गया है । एक अपशिष्ट जलाशय तैयार करने और एक स्रोत जलाशय में गर्म SCMM हस्तांतरण । जतन महाप्राण १२५ & #181; प्रत्येक कुआं से माध्यम का एल, और १५० के साथ प्रतिस्थापित & #181; l ताजा SCMM का प्रयोग मल्टीचैनल P200 पिपेट. थाली में वापस एक ३७ & #176; सी मशीनर.
4. सेरेब्रल Organoid रखरखाव (4 दिवस +)
नोट: इस नियमित रखरखाव हर दूसरे दिन जब तक संक्रमण आचरण । 4 दिन पर फ़ीड शुरू करने से पहले, तंत्रिका प्रेरण (एनआई) मध्यम तैयार करते हैं । गल a २५० & #181; L aliquot 2 mg/एमएल हेपरिन के साथ-साथ एक 5 मिलीलीटर की शीशी 100X N-2 के पूरक । जोड़ें २५० & #181; हेपरिन, 100X N-2 के 5 मिलीलीटर, और 100X मेम के 5 मिलीलीटर-NEAA के लिए ५०० मिलीलीटर की DMEM/F12 + GlutaMAX । बाँझ फ़िल्टर एक ५०० मिलीलीटर फिल्टर में मिश्रित समाधान. नोट: NI at 4 & #176; C जब उपयोग में नहीं है; नी ढ़ाई से दो सप्ताह पहले ताजा माध्यम तैयार किया जाना चाहिए । उष्ण १७ मिलि च्या नी मध्यम ते ३७ & #176; ग. के साथ मल्टीचैनल P200 पिपेट सेट के लिए १०० & #181; L, organoid प्लेट के सभी कुओं को फैलाएं (चरण २.२ देखें). रुको 15 एस सुनिश्चित करें कि organoids उनके कुओं के नीचे करने के लिए डूब गया है । एक अपशिष्ट जलाशय तैयार करने और एक स्रोत जलाशय में गरम नी हस्तांतरण । जतन महाप्राण १२५ & #181; प्रत्येक कुआं से माध्यम का एल, और १२५ & #181 के साथ प्रतिस्थापित करें; l ताजी नी का उपयोग मल्टीचैनल P200 पिपेट. थाली में वापस एक ३७ & #176; सी मशीनर.
5. ZIKV के साथ Organoid संक्रमण (~ दिन 24)
नोट: लगभग 3 सप्ताह के अंतर के बाद, वहां will बड़े neuroepithelial संरचनाओं और organoid कि अत्यधिक ZIKV संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील हो जाएगा भीतर दिखाई rosettes । लाएगी अर्ल् & #39; एस 1x संतुलित नमक समाधान (EBSS), 1x पंजाबस, और NI to ३७ & #176; C एक गरम पानी में स्नान । संक्रमण (मुि) के लक्ष्य संक्रमण गुणा करने के लिए 1x EBSS में ज्ञात एकाग्रता के ZIKV पतला । नोट: विभिन्न MOIs के Titrations एक वायरल खुराक प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. यह वायरस तनाव के द्वारा भिंन हो सकते हैं; ATCC vr-१८३८ और ATCC vr-१८४३ के लिए, विशिष्ट मुि मान ०.१ और 10 के बीच श्रेणी). ध्यान से सभी माध्यम organoid अच्छी तरह से एक चैनल P200 पिपेट का उपयोग कर हटा दें । जल्दी जोड़ें २०० & #181; 1x पंजाबियों के एल प्रत्येक अच्छी तरह से एक P200 मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए organoids धोने के लिए. ध्यान से सभी माध्यम organoid अच्छी तरह से एक चैनल P200 पिपेट का उपयोग कर हटा दें । जल्दी जोड़ें ५० & #181; 1x EBSS के एल-केवल (मॉक इंफेक्शन) या ZIKV वायरस के समाधान के लिए अच्छी तरह से और सुनिश्चित करें कि organoid पूरी तरह से जलमग्न है । प्रत्येक organoid है कि अध्ययन के लिए संक्रमित होना करने के लिए दोहराएं । एक ३७ & #176 में थाली वापस जगह; सी मशीन 2 एच के लिए नोट: इस अवधि के लिए नकली संक्रमित organoids मशीन काफी प्रभावित नहीं करना चाहिए उनके विकास के रूप में परेशान organoids की तुलना में । लगभग 30 मिनट पहले वायरल मशीन पूरा हो गया है, एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब में एनआई के aliquot 25 मिलीलीटर, और एक गर्म पानी के स्नान में ३७ & #176; C करने के लिए लाने के लिए । के बाद वायरल एक्सपोजर पूरा हो गया है, organoids के साथ धो २०० & #181; 1x पंजाबियों के एल के लिए एक अच्छी तरह से, organoids 15 एस के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, और फिर एक चैनल P200 पिपेट का उपयोग कर 1x पंजाबियों को हटाने । Add २०० & #181; एक अच्छी तरह से ताजा नी के एल, और वापस मशीन में जगह है । वै: एक दिन 0 समय बिंदु के लिए, organoids संक्रमण के बाद एक घंटे imaged हो सकता है । की जगह से कल्चर जारी १२५ & #181; L नी हर दूसरे दिन फैलाव विधि का उपयोग कर (चरण 4 देखें) । ठीक से खर्च मीडिया और सुझावों के निपटान के लिए सुनिश्चित हो, के रूप में इस संक्रामक ZIKV कणों शामिल हैं ।
वहां कई निरंतर पर विचार जब मानव मस्तिष्क organoids का उपयोग करने के लिए ZIKV संक्रमण की जांच कर रहे हैं । एक महत्वपूर्ण विचार यह है कि organoid गठन और संरचना स्टेम सेल लाइन जहां से वे गठन कर रहे है पर अत्यधिक निर्भर है । isogenic इंजीनियर लाइनों सहित सेल लाइनों, के बीच तुलना करते समय ध्यान रखना; यह कई उपक्लोनों का उपयोग कर निष्कर्ष बनाने के लिए सबसे अच्छा है, और आदर्श रूप से कई स्टेम सेल लाइनों । इसके अतिरिक्त सेल लाइनों में इस अंतर के कारण, यह सुनिश्चित करने के लिए कि उचित भेदभाव organoids में हो रहा है पायलट प्रयोगों की सिफारिश की है । जबकि neuroepithelial संरचनाओं brightfield माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई दे रहे हैं, यह भी qRT-पीसीआर या cryosectioning प्रयोगों जैसे PAX6 या phospho-vimentin के रूप में तंत्रिका भेदभाव मार्करों के लिए देखने के संचालन के लिए सुझाव दिया है ।
एक भी एक ही सेल लाइन के भीतर organoids के बीच काफी परिवर्तनशीलता आशा करनी चाहिए । प्रोटोकॉल की विकृत प्रकृति के कारण, संख्या और neuroepithelial संरचनाओं के आकार व्यक्तिगत organoids के बीच भिन्न हो सकते हैं । आम तौर पर, एक की उंमीद कर सकते है कम से अधिक दो बड़े (> D24 द्वारा व्यास में 200 µm) organoid प्रति तंत्रिका rosettes । इस कारण से, अनुदैर्ध्य अध्ययन, जैसे संक्रमण पर organoid आकार में परिवर्तन के अवलोकन के रूप में, विशेष रूप से शिक्षाप्रद हैं । बैचों के बीच परिवर्तनशीलता भी हो सकता है, इस गलत सेल गिनती या बोने के लिए सबसे अधिक संभावना कारण के साथ. यह एकाधिक गिनती आचरण और सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन अच्छी तरह से ुला U-नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेटों पर बोने से पहले मिश्रित है बनाने के लिए सिफारिश की है ।
जब संवर्धन organoids ुला यू-बॉटम ९६-वेल प्लेट्स, प्लेटों के किनारों के आसपास काफी वाष्पीकरण प्रभाव देखने पर योजना बनाते हैं । यह पंजाब के साथ इन कुओं को भरने और केवल केंद्र ६० कुओं के साथ काम करने के लिए आदर्श है । वाष्पीकरण के कारण, बाहरी कुओं में organoids केंद्र में उन लोगों की तुलना में विभिन्न स्थितियों को उजागर किया जाएगा, जिसकी संभावना उनके विकास और विभेद को प्रभावित करेगी. कृपया इस पर विचार जब organoids कि प्रयोगों के लिए आवश्यक हो जाएगा की संख्या की योजना बना । इसके अतिरिक्त, organoids लगभग 30 दिनों के बाद ९६-well स्वरूप को तबदील करने के लिए शुरू हो जाएगा, जो संस्कृति माध्यम के रंग के कारण दिखाई देगा । अगर 30 दिन पिछले organoids लेने पर योजना, यह एक ुला 24 अच्छी तरह से थाली के लिए organoids हस्तांतरण की सिफारिश की है । हस्तांतरण का संचालन करने के लिए, एक P1000 टिप में कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें ताकि खोलने organoids खुद से बहुत बड़ा है, और pipetting द्वारा organoids हस्तांतरण ।
मानव मस्तिष्क organoids neurodevelopment और रोग के क्षेत्र की समझ को आगे बढ़ाने में महान क्षमता पकड़ो । शोधकर्ताओं के लिए आवश्यक के रूप में प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है । उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट कोशिका प्रकार की ओर विभेदक दक्षता में सुधार करने के लिए, उन्हें कुछ संरचनात्मक क्षेत्रों पर वायरल प्रभावों का पता लगाने की अनुमति देते हुए पैटर्न कारकों को लागू कर सकता है । ZIKV के neurodevelopmental प्रभाव अभी भी खराब समझ रहे हैं, लेकिन इस नए दृष्टिकोण शोधकर्ताओं एक सुलभ, तेजी से, और संक्रमण के तंत्र की जांच का उच्च प्रवाह रास्ता दे देंगे ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों प्रिसिला एल यांग और हार्वर्ड मेडिकल स्कूल के Dominique जे Burri प्रारंभिक प्रचार और ZIKV के ठहराव के साथ मदद के लिए धंयवाद । हम भी इमेजिंग समर्थन के लिए Nathaniel D. Kirkpatrick शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । K.E. को मनोरोग अनुसंधान के लिए स्टेनली सेंटर और हार्वर्ड स्टेम सेल संस्थान द्वारा समर्थन दिया गया था ।
Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8 | StemCell Technologies | 5940 | Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton. Store at 4 ᵒC for up to two weeks after prepared from individual components |
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
Enzymatic Detachment Reagent, Accutase | Gibco | A11105-01 | Store aliquoted at -20 ᵒC, do not keep thawed for longer than necessary |
Y-27632 | Selleck Chem | S1049 | Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 ᵒC in 50µL aliquots. |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
Heparin | Sigma-Adrich | H4784-1G | Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 ᵒC in 250µL aliquots |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |