Det här protokollet beskriver en teknik som används för att modellera Zika virusinfektion av hjärnans utveckling mänskliga. Med vildtyp eller konstruerade stamcellslinjer, kan forskare använda denna teknik för att avslöja de olika mekanismer eller behandlingar som kan påverka tidiga hjärninfektion och resulterande mikrocefali hos Zika virus-infekterade embryon.
Senaste uppkomsten av zikaviruset (ZIKV) i mottagliga populationer har lett till en plötslig ökning av mikrocefali och andra utvecklingsrelaterade tillstånd hos nyfödda barn. Myggor är huvudvägen för virusöverföring, har det också visat sig sprids via sexuella kontakter och vertikal mor-till-foster överföring. I detta sistnämnda fall av överföring, på grund av den unika viral tropism av ZIKV, tros viruset huvudsakligen mål de neurala stamceller (NPC) av hjärnans utveckling.
Här en metod för modellering ZIKV infektion, och den resulterande mikrocefali, som uppstår när mänskliga cerebral organoids utsätts för att leva ZIKV beskrivs. Organoids uppvisar höga nivåer av virus inom deras neurala stamceller befolkning och uppvisar allvarliga celldöd och mikrocefali över tid. Denna tredimensionella cerebral organoid modell tillåter forskare att genomföra arter-matchade experiment för att observera och potentiellt ingripa med ZIKV infektion i hjärnans utveckling mänskliga. Modellen ger ökad relevans över tvådimensionell standardmetoder, och innehåller mänskliga-specifika cellulära arkitektur och proteinuttryck som inte går i djurmodeller.
Zikaviruset (ZIKV) har snabbt spridit sig i Mikronesien, franska Polynesien och Amerika, och har nyligen visat att passera placentabarriären1,2 för att infektera utveckla fostrets hjärnan, leder till nervsystemets sjukdomar sådan som mikrocefali3,4,5,6 . De långsiktiga effekterna på dessa patienters liv, och den nuvarande bristen på behandling, har lett forskare och kliniker att förvränga för en bättre förståelse för mekanismerna bakom ZIKV infektion och replikering. Tidigare studier har undersökt ZIKV infektion av in vitro- system i en mängd olika fysiologiskt relevanta cell typer7,8,9, samt i vivo10 med immunkompetenta och immunsupprimerade möss11,12,13 och icke-mänskliga primater14,15,16. Utöver dessa mer konventionella tekniker genomfört flera grupper stamceller-derived cerebral organoids att förstå mer om ZIKV infektion i hjärnans utveckling mänskliga. Dessa grupper har utnyttjat människors cerebral organoids för att bekräfta de mikrocefali fenotyp17,18, undersöka receptorer kopplade till virus posten19, undersöka fysiologiska reaktioner till infektion20 , 21, och potentiellt skärmen för drogen kandidater22. Här beskrivs en teknik för att snabbt producera och infekterar stamceller härstammar cerebral organoids, som visas tidigare19, att förbättra förståelsen av ZIKV infektion i hjärnans utveckling mänskliga.
Eftersom organoids bildas från standard pluripotenta stamceller (PSC) kulturer, möjliggör denna teknik en mängd vetenskapliga frågor besvaras angående virusinfektion i hjärnans utveckling. CRISPR engineering kan exempelvis användas för att ändra dessa PSC rader före organoid infektion i en snabbare takt än de flesta i vivo genetiska studier19. Dessutom, till skillnad från i standard två dimensionella (2D) differentiering kulturer, organoids uppvisar den komplexa cellulära arkitektur som är kritiska för corticogenesis, och nyligen genomförda studier har visat att denna arkitektur kan störas vid infektion 21. Slutligen, den relativt låga kostnaden för generera organoids möjliggör högre genomströmning experimenterande och screening jämfört med i vivo modeller. Däremot, finns det några nackdelar att utilizationen av organoids att studera ZIKV. Medan organoids är långt mer biologiskt relevant än 2D kulturer, finns det ytterligare utmaningar i bedömningen av organoids på grund av deras tredimensionella (3D)-natur. Imaging och dissociation av organoids tenderar att involvera mer utrustning och en större investering av resurser än i vanlig 2D kulturer. Dessutom saknar organoids vaskulatur och immunologiska komponenter som finns i i vivo modeller, så forskare intresserade av de aspekterna av virusinfektion uppmanas att söka ett alternativa protokoll.
Det finns ett antal tekniker för bildandet av mänskliga organoids och neurospheres i kultur och de vanligtvis faller inom kategorierna mönstrad eller omönstrad . Mönstrad metoder genomföra faktorer för att reglera Wnt, BMP, TGFβ och andra signalvägar för att driva differentiering mot specifika härstamningar23. Omönstrade metoder, såsom den som beskrivs här, dra nytta av benägenheten för inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) och mänskliga embryonala stamceller (hESCs) att skilja mot en neuroektodermala härstamning av standard24. Efter cirka tre veckor av differentiering består de resulterande organoids av stora, biomimetiska neuroepithelial strukturer som innehåller flera celltyper som observeras i hjärnans tidiga utveckling.
Tekniken för att producera organoids från standard, feeder-fri PSC kulturer, och angriper dessa organoids med ZIKV presenteras i sin helhet. För vägledning om de culturing metoder som behövs för feeder-fri PSC, hänvisas till föregående metoder publikationer25,26. Dessutom kunna tillämpas konsekvent mängder virus för flera experiment, är det viktigt att beräkna MOI före tid. Detta görs genom att bedriva en infektion i Vero-celler, följt av behandling med overlay medium, inkubation och immunfärgning. Beskrivningar och metoder för denna teknik har varit tidigare beskrivna19,27.
När PSC kulturen når målet sammanflödet av 50% – 70%, cellerna sedan skiljas och samman till ultralåg fastsättning 96 brunnar. Cellerna är upprätthålls 3 dagar i xeno-fri stamceller underhållsmassmedia (SCMM), och sedan omvandlas till en neurala induktion media för återstoden av kulturen. När organoids ha differentierade i 3 veckor, kan infektionen genomföras. Genom att rutinmässigt ta bilder under veckan efter infektion, kommer att forskare Observera progressiva celldöd och störningar av organoid. Forskare kan också skilja organoids vid denna tid att genomföra transkriptionell eller proteomiska profilering. Kryosnitt och lightsheet metoder rekommenderas för imaging och forskare kan förvänta sig höga halter av infektion och virusreplikation bestämt inom de neurala stamceller cellpopulationer (NPC) i organoids. Slutligen, denna teknik tillåter forskare att snabbt undersöka mekanismerna bakom virusinfektion i den mänskliga hjärnan med låg kostnad och begränsad utrustning.
Det finns flera fallgropar att tänka på när utnyttja mänskliga cerebral organoids att undersöka ZIKV infektion. Ett viktigt övervägande är det organoid bildandet och struktur är starkt beroende av raden stamceller som de bildas. Var försiktig när du jämföra mellan cellinjer, inklusive syngena bakåtkompilerade linjer; Det är bäst att göra slutsatser med hjälp av flera subkloner och helst flera stamcellslinjer. Dessutom på grund av denna skillnad i cellinjer, pilot experiment för att säkerställa att korrekt differentiering sker i organoids rekommenderas. Medan de neuroepithelial strukturerna syns av brightfield mikroskopi, föreslås det också för att utföra qRT-PCR eller kryosnitt experiment att leta efter neurala differentiering markörer såsom PAX6 eller phospho-vimentin.
Man bör också förutse stora variationsrikedomen bland organoids inom samma cell linje. Omönstrade pågrund av protokollet, kan antal och storlek av neuroepithelial strukturer variera mellan enskilda organoids. Vanligtvis kan man räkna med minst två stora (> 200 µm i diameter D24) neurala rosetter per organoid. Av denna anledning är longitudinella studier, såsom observation av förändring i organoid storlek vid infektion, särskilt upplysande. Variabiliteten mellan partier kan också förekomma, med den mest troliga orsaken till detta vara felaktig cell räkna eller sådd. Det rekommenderas att genomföra flera räkningar och se till att cellsuspensionen blandas väl före sådd på ULA U-botten 96 brunnar plattorna.
När odling organoids i ULA U-botten 96 brunnar, planera att se betydande avdunstning effekter runt kanterna på plattorna. Det är idealiskt att fylla dessa brunnar med PBS och arbetar endast med center 60 brunnarna. På grund av avdunstning, kommer organoids i yttre brunnarna att utsättas för olika förhållanden än i centrera, som sannolikt kommer att påverka deras tillväxt och differentiering. Tänk på detta när du planerar antalet organoids som kommer att behövas för experiment. Dessutom kommer organoids börja växa över formatet 96 brunnar efter ungefär 30 dagar, som kommer att vara synlig på grund av missfärgning av odlingsmedium. Om du planerar att ta organoids förbi de 30 dagarna, rekommenderas det att överföra organoids till en ULA 24-well platta. Att genomföra överföringen, använd sax för att klippa ett P1000 tips så att öppningen är mycket större än organoids sig och överföra organoids genom pipettering.
Mänskliga hjärnans organoids håll stor potential i avancerad fältets förståelse av neuroutvecklingssjukdomar och sjukdom. Forskare uppmuntras att ändra protokollet som behövs. Man exempelvis kunde genomföra mallning faktorer för att effektivisera differentiering mot specifika celltyper, ger dem möjlighet att utforska de virala effekterna på vissa anatomiska regioner. Nervsystemets effekterna av ZIKV är fortfarande dåligt känd, men denna nya strategi kommer att ge forskare en tillgänglig, snabb och hög genomströmning sätt att undersöka mekanismer för infektion.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Priscilla L. Yang och Dominique J. Burri på Harvard Medical School för hjälp med inledande förökning och kvantifiering av ZIKV. Vi skulle också vilja tacka Nathaniel D. Kirkpatrick för imaging stöd. K.E. stöddes av Stanley Center för psykiatriforskning och Harvard Stem Cell Institute.
Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8 | StemCell Technologies | 5940 | Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton. Store at 4 ᵒC for up to two weeks after prepared from individual components |
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
Enzymatic Detachment Reagent, Accutase | Gibco | A11105-01 | Store aliquoted at -20 ᵒC, do not keep thawed for longer than necessary |
Y-27632 | Selleck Chem | S1049 | Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 ᵒC in 50µL aliquots. |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
Heparin | Sigma-Adrich | H4784-1G | Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 ᵒC in 250µL aliquots |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |