Summary
Denne protokollen beskriver en teknikk som brukes til å modellere Zika smitte av utvikle hjernen. Bruker wildtype eller utviklet stamcelleforskningen linjer, kan forskere bruke denne teknikken til å avdekke de ulike mekanismer eller behandlinger som kan påvirke tidlig hjernen infeksjon og resulterende microcephaly i Zika virusinfiserte embryoer.
Abstract
Den nylige framveksten av Zika virus (ZIKV) i mottakelige populasjoner har ført til en brå økning i microcephaly og andre neurodevelopmental forhold i nyfødte. Mens mygg hovedruten for viral overføring, har det også vist å spre via seksuell kontakt og loddrett mor-å-fosteret overføring. I dette siste tilfelle av overføring, på grunn av den unike viral tropism av ZIKV, antas virus å hovedsakelig mål nevrale stamceller (NPC) av utvikle hjernen.
Her en metode for modellering ZIKV infeksjon, og den resulterende microcephaly, som oppstår når menneskelige hjerne organoids er utsatt å leve ZIKV er beskrevet. Organoids viser høye nivåer av virus innen nevrale befolkningen, og utstilling alvorlig celledød og microcephaly over tid. Denne tredimensjonale cerebral organoid modellen tillater forskere å utføre arter-matchet eksperimenter for å observere og potensielt gripe inn med ZIKV infeksjon av utvikle hjernen. Modellen gir forbedret relevansen over standard todimensjonal metoder, og inneholder menneske-spesifikke mobilnettet arkitektur og protein uttrykk som ikke er mulig i dyremodeller.
Introduction
Zika virus (ZIKV) har raskt spre Mikronesia, Fransk Polynesia og Amerika, og har nylig blitt vist å krysse placental barriere1,2 å infisere utvikle fosterets hjernen, fører til neurodevelopmental sykdommer slik som microcephaly3,4,5,6 . Den langsiktige virkningen på disse pasientene liv, og gjeldende mangel på behandling, har ført forskere og klinikere å rykke ut for en bedre forståelse for mekanismene bak ZIKV smitte og replikering. Tidligere studier har undersøkt ZIKV infeksjon av in vitro -systemer i en rekke fysiologisk relevante cellen typer7,8,9, samt i vivo10 med immunkompetente og immunsupprimerte mus11,12,13 og ikke-menneskelige primater14,15,16. I tillegg til disse mer konvensjonelle teknikker, har flere grupper implementert Stamcelle-avledet cerebral organoids å forstå mer om ZIKV infeksjon av utvikle hjernen. Disse gruppene har utnyttet menneskelige hjerne organoids bekrefte microcephaly fenotypen17,18, undersøke reseptorer knyttet til virus oppføring19, undersøke fysiologiske responser til infeksjon20 , 21, og potensielt skjermen for narkotika kandidater22. Her er en teknikk for raskt produsere og infisere Stamcelle-avledet hjerne organoids beskrevet, som vist tidligere19, å forbedre forståelsen av ZIKV infeksjon av utvikle hjernen.
Siden organoids dannes fra standard pluripotent stamceller (PSC) kulturer, gir denne teknikken en rekke vitenskapelige spørsmål besvares om viral infeksjon av utvikle hjernen. CRISPR engineering kan for eksempel brukes til å endre disse PSC linjer før organoid infeksjon raskere enn de fleste i vivo genetiske studier19. I tillegg, i motsetning til i standard to-dimensjonale (2D) differensiering kulturer, organoids utstilling komplekse mobilnettet arkitektur som er kritisk for corticogenesis, og nyere studier har vist at denne arkitekturen kan bli avbrutt på infeksjon 21. Endelig, relativt lav pris å generere organoids lar for høyere gjennomstrømming eksperimentering og screening i forhold til i vivo modeller. På den annen side, er det noen ulemper til utnyttelse av organoids å studere ZIKV. Mens organoids er langt mer biologisk relevant enn 2D kulturer, er det flere utfordringer i vurderingen av organoids på grunn av deres tredimensjonale (3D) natur. Bildebehandling og av organoids gjerne involverer mer utstyr og en større investering ressurser enn i standard 2D kulturer. I tillegg mangler organoids blodkar og immunologiske komponenter som finnes i i vivo modeller, slik at forskere interessert i aspektene av virusinfeksjon anbefales å søke en alternativ protokoll.
Det finnes en rekke teknikker for dannelsen av menneskelig organoids og neurospheres i kultur, og de vanligvis faller innenfor kategoriene mønstret eller unpatterned . Mønstret metoder implementere faktorer å regulere Wnt, BMP, TGFβ og andre signalveier å presse differensiering mot bestemte overleveringslinjer23. Unpatterned metoder, som beskrevet her, dra nytte av hang for indusert pluripotent stamceller (iPSCs) og menneskelige embryonale stamceller (hESCs) å skille mot en neuroectodermal avstamning av standard24. Etter ca tre uker med differensiering består de resulterende organoids av store biomimetic neuroepithelial strukturer som inneholder flere celletyper som er observert i tidlig utvikle hjernen.
Teknikken for produsere organoids fra standard, mater-fri PSC kulturer og infisere disse organoids med ZIKV vises i sin helhet. Retningslinjer for culturing metodene som trengs for mater-fri PSCer, se forrige metoder publikasjoner25,26. I tillegg vil bruke konsekvent mengder virus for flere eksperimenter, er det viktig å beregne MOI forhånd. Dette gjøres ved å gjennomføre en infeksjon av Vero celler, etterfulgt av behandling med overlegg medium og inkubasjon immunostai. Beskrivelser og metoder for denne teknikken har vært beskrevet tidligere19,27.
Når PSC kultur når målet samløpet av 50% - 70%, cellene deretter avstand og samles i svært lav vedlegg 96-brønns plater. Cellene er opprettholdt i 3 dager på xeno-fri stamcelleforskningen vedlikehold media (SCMM), og konverteres til en neural induksjon media for resten av kulturen. Når organoids ha differensiert i 3 uker, kan infeksjonen utføres. Ved rutinemessig å ta bilder i løpet av uken etter infeksjon, vil forskerne observere progressiv celledød og avbrudd i organoid. Forskerne kan også oppheve tilknytningen til organoids på denne tid til å foreta transcriptional eller proteomic profilering. Og kryosnitt og lightsheet anbefales for bildebehandling, og forskere kan forvente å se høye nivåer av infeksjon og viral replikasjon spesielt innen nevrale celle (NPC) befolkningen i organoids. Til slutt, denne teknikken kan forskere raskt undersøke mekanismer for viral infeksjon av den menneskelige hjernen med lav pris og begrenset.
Protocol
1. opprette Cerebral Organoids fra iPSC / hESC 2D kultur (dag 0)
Merk: denne protokollen forutsetter at stamcelleforskningen (SC) vedlikehold er gjennomført i SCMM medium med vitronectin eller Geltrex substrat. Hvis bruker en alternativ, høy-protein stamcelleforskningen dyrking media, er det tilrådelig overgang SC kulturer til SCMM for minst to ganger før du starter organoid formasjon. Protokollen er ikke testet med mater-baserte SC kultur metoder.
- Bruke vanlig SC vedlikehold metoder 25 , 26, bringe kulturer til 50% - 70% samløpet. Dette er vanligvis 3-4 dager etter passaging, selv om dette kan være avhengig av kultur metoden og cellen linje.
Merk: Ca 2 brønner fra en 6-vel-plate for å produsere en tallerken full 96-brønnen organoids. - Kontrollere kulturer via brightfield mikroskopi på 10 X-20 X forstørrelse å sikre sunne kolonien morfologi, med ingen synlig differensiering.
- Ta SCMM 37 ° C i et varmt vannbad, og tine 50 µL ampuller med 50 mM Y-27632 (Rock hemmer) og 2 mL enzymatisk avdeling reagens til romtemperatur.
- Forberede en svært lav vedlegg (ULA) U-bunn 96 godt plate, en flerkanals P200 pipette og et 25 mL reagens reservoar.
- Aliquot 45 mL av SCMM i en 50-mL konisk tube, og legge til 45 µL av 50 mM Y-27632. Mix grundig av triturating.
- Vakuum sug opp de to brønnene som inneholder SCs og legge raskt 1 mL av enzym-fri avdeling reagens til hver godt med en P1000 pipette. Inkuber platen i en 37 ° C inkubator for 4 min.
- Vakuum sug opp behandlet brønnene og tilsett 1 mL av enzymatisk avdeling reagens hver brønn bruker en P1000 pipette.
- Incubate platen i en 37 ° C inkubator for en ekstra 5 min.
- Fjerne platen og undersøke behandlet brønnene. Forsiktig Tapp på tallerkenen å bryte opp aggregert celler. Hvis store celle klynger er fortsatt synlig, ruge plate i 2 ekstra minutter på 37 ° C. Gjenta dette trinnet til klynger er ikke lenger synlig for det blotte øye.
- Når cellene er riktig avstand, tilsett 1 mL av SCMM hver brønn å deaktivere dissosiasjon enzymer. Bassenget på 4 mL av cellen suspensjon i et 50-mL konisk rør og ta en liten aliquot for celle opptelling.
- Returnere eventuelle gjenværende, ubehandlet brønner i vedlikehold platen 37 ° C inkubator.
- Mens teller, sentrifuge celle suspensjon på 300 x g i 5 min.
- Bestemmer antall celler, og beregne mengden SCMM + Y-27632 løsning som vil være nødvendig for å oppnå en 60.000 celler/mL suspensjon.
- Nøye vakuum sug opp nedbryting og legge til beregnede mengden SCMM + Y-27632 løsning. Bland 5 - 10 ganger med en 5-mL Pipetter, sikrer en jevn celle suspensjon.
- Umiddelbart overfører celle suspensjon i en reagens-reservoaret, og Pipetter 150 µL i hver brønn av ULA U bunn 96-brønns platen ved hjelp av en flerkanals P200 pipette. Dette gir 96 personlige organoids, hver utgangspunktet består av 9000 celler.
- Sentrifuger platen på 150 x g i 1
- Plasser platen i en 37 ° C inkubator, og ikke forstyrr platen i 48 h.
2. Cerebral Organoid vedlikehold (dag 2)
- forberede 17 mL SCMM med 17 µL av 50 mM Y-27643 i et 50-mL konisk rør. Varme SCMM + Y-27632 løsning på 37 ° C i et varmt vannbad.
- Ta organoid platen settefiskanlegg, og bruker en flerkanals P200 pipette satt til 75 µL, sakte trekke opp medium fra kanten av brønnen på første rad. Når mediet har blitt trukket, raskt utvise den medium ryggen inn i brønnen løft løs celler og organoids. Gjenta dette for hver rad.
Merk: Denne teknikken, heretter referert til som en " spredning, " heiser mobilnettet rusk og organoid i suspensjon. Organoid synker raskt til bunnen av brønnen, mens mindre rusk forblir i suspensjon, slik at den kan fjernes med en media-endring. Dette bidrar til å hindre at organoid hviler i mobilnettet rusk under kultur.- Etter alle brønnene har blitt fordelt, vente 15 s slik at organoids har sunket til bunns i hver brønn.
- Sakte og forsiktig Sug opp 75 µL av medium fra hver brønn ved å flerkanals P200 pipette og dispensere i et avfall reservoar.
Merk: De fleste brukere noen ganger Sug opp en organoid under vanlige feeder. Dette kan skje omtrent 1% av tiden. Vennligst planlegge deretter å sikre at nok organoids overleve til eksperimentelle tidspunkt. - Overføre SCMM + Y-27632 løsning i en reagens-reservoaret, og 150 µL i hver organoid godt med flerkanals P200 pipette.
- Plasser platen tilbake i en 37 ° C inkubator.
3. Cerebral Organoid vedlikehold (dag 3)
- varme 17 mL SCMM 37 ° c, denne gangen uten Y-27643.
- Med den flerkanals P200 pipette satt til 100 µL, spre alle brønnene av organoid plate (se trinn 2.2). Vente 15 s slik at organoids har sunket til bunns deres brønner.
- Forberede et avfall reservoar og overføre varmet SCMM i en kilde reservoaret.
- Nøye Sug opp 125 µL av medium fra hver brønn, og Erstatt med 150 µL av fersk SCMM bruker flerkanals P200 pipette.
- Plasser platen tilbake i en 37 ° C inkubator.
4. Cerebral Organoid vedlikehold (dag 4 +)
Merk: gjennomføre denne regelmessig vedlikehold annenhver dag til infeksjon.
- Før du starter fôret på dag 4, forberede Neural induksjon (NI) medium.
- Tøvær en 250 µL aliquot av 2 mg/mL heparin, sammen med en 5 mL flaske 100 X N-2 supplement. Legge til 250 µL av heparin, 5 mL av 100 X N-2 og 5 mL av 100 X MEM-NEAA til 500 mL DMEM / F12 + GlutaMAX. Sterile filtrere blandet løsningen i filtere 500 mL.
Merk: Holde NI på 4 ° C når ikke i bruk. NI varer opptil to uker før frisk medium bør være forberedt.
- Tøvær en 250 µL aliquot av 2 mg/mL heparin, sammen med en 5 mL flaske 100 X N-2 supplement. Legge til 250 µL av heparin, 5 mL av 100 X N-2 og 5 mL av 100 X MEM-NEAA til 500 mL DMEM / F12 + GlutaMAX. Sterile filtrere blandet løsningen i filtere 500 mL.
- Varme 17 mL av NI medium til 37 ° C.
- Med den flerkanals P200 pipette satt til 100 µL, spre alle brønnene av organoid plate (se trinn 2.2). Vente 15 s slik at organoids har sunket til bunns deres brønner.
- Forberede et avfall reservoar og overføre varmet NI i en kilde reservoaret.
- Nøye Sug opp 125 µL av medium fra hver brønn, og Erstatt med 125 µL av fersk NI bruker flerkanals P200 pipette.
- Plasser platen tilbake i en 37 ° C inkubator.
5. Organoid infeksjon med ZIKV (~ dag 24)
Merk: etter ca 3 uker med differensiering, der will være store neuroepithelial strukturer og rosetter synlig i organoid som vil være svært utsatt for ZIKV infeksjon.
- Bringe Earle ' s 1 X balansert Salt løsning (EBSS), 1 X PBS og NI 37 ° c i et varmt vannbad.
- Dilute ZIKV av kjente konsentrasjon i 1 X EBSS på målet infeksjonen mangfold av infeksjon (MOI).
Merk: Titrations av ulike MOIs anbefales å oppnå en viral dose-respons. Dette kan variere fra viruset belastning; ATCC VR-1838 og ATCC VR-1843, typisk MOI verdier varierer mellom 0,1 og 10). - Forsiktig fjerne alle medium fra organoid godt med en enkelt kanal P200 pipette. Raskt legge til 200 µL av 1 X PBS i hver brønn ved å en P200 flerkanals pipette for å vaske organoids.
- Forsiktig fjerne alle medium fra organoid godt med en enkelt kanal P200 pipette. Raskt legge til 50 µL av 1 X bare EBSS (mock infeksjon) eller ZIKV virus løsning å godt og sikre at organoid er helt dekket. Gjenta for hver organoid som er infisert for studien.
- Plasser platen tilbake i en 37 ° C inkubator for 2 h.
Merk: Rugende uekte-infiserte organoids for denne varigheten ikke bør betydelig innvirkning deres vekst i forhold til uforstyrret organoids. - Ca 30 min før viral inkubasjon er fullført, aliquot 25 mL av NI til en 50-mL konisk rør, og bringer til 37 ° C i et varmt vannbad.
- Etter virus eksponering er fullført, vask organoids med 200 µL av 1 X PBS for hver brønn, la organoids betale for 15 s, og deretter fjerne 1 X PBS bruker en enkelt kanal P200 pipette.
- Legge til 200 µL av fersk NI hver godt, og plassere tilbake i inkubator.
- Valgfritt: For en dag 0 tid punktet, organoids kan avbildes en time etter infeksjon.
- Fortsett til kultur ved å erstatte 125 µL NI annenhver dag med metoden spredning (se trinn 4). Sørg for å kunne avhende brukt media og tips, som inneholder smittsomme ZIKV partikler.
Representative Results
På dagtid organoid formasjonen skal SC kulturer i logg-vekst fase, der de er 50% - 70% confluent, som vist i figur 1(- vekselstrøm). Kulturer bør danne avrundet kolonier med forskjellige kanter og brønnene skal unna differensiering figur 1(D-E). Hvis differensiering oppstår, anbefales det å gjennomføre en hakke å fjerne for å rense de berørte områdene platene minst en dag før du oppretter organoids. Hvis en stor del av kulturen er differensiert, kan det være nødvendig å utføre en ekstra passasje, tine en ny medisinglass eller endre stamcelleforskningen kultur teknikker for å sikre at organoids dannes av ren stamcelleforskningen kulturer.
Dissosiasjon av en kombinasjon av enzym-fri og enzymatiske avdeling reagenser behandling bør føre til det meste enkeltceller, selv om det fortsatt kan være små mengder av celler observert under telling. Tilstedeværelsen av små mengder synes ikke å forstyrre organoid formasjon, men det kan påvirke telling nøyaktighet. Det anbefales at flere tellinger gjøres per prøve, og hvis teller varierer fra over 20%, kan det være nødvendig å øke dissosiasjon tid til å singularize celler ytterligere.
Når cellene er seeded og spunnet ned i en ULA U bunn 96-brønns plate (figur 2A), vil de vises som en flat, tett ark av celler på bunnen av hver brønn. Cellene samle sakte de neste to dagene. Det er best ikke å forstyrre platen under disse 48 timer, så mekaniske krefter kan forstyrre løst dannet samlet. For de første 10 dagene, organoid blir mest sfærisk, og vil vokse fra ~ 300 µm til 600-800 µm (figur 2B). Flere observerbare strukturer begynner å vises i organoid mellom 10 og dagen 20 (figur 2C-E). Dag 24 kunne forskerne observere rosett-lignende strukturer via brightfield mikroskopi (figur 2F). Mens du fortsetter kultur, kan disse neuroepithelial strukturer øke i antall og størrelse over flere dager (figur 2G). Under feeds, vil forskeren merke betydelig mengder avfall samler på bunnen av hver brønn, spesielt i de første ukene av kultur. Dispersjon teknikken beskrevet i trinn 2.2 fjerner de fleste av dette mobilnettet rusk å hindre apoptotisk rusk fra samler over flere strømmer (Figur 3A). Dette rusk kan forstyrre bildebehandling, kan det gjøre det mer utfordrende å observere og kvantifisere infeksjon-indusert celledød, og det kan gi asymmetrisk signalisering til den nærliggende organoid som kan påvirke differensiering. Hvis spredning teknikken er riktig utført, bør dette være redusert (Figur 3ABC, 3D-E).
Det anbefales å gjennomføre cryosections eller lightsheet imaging for å inspisere kortikale strukturen danner innenfor organoids. I dag 25 organoids er rosett strukturer og ventrikkel soner tydelig i DAPI (Figur 4A) og phospho-vimentin (Figur 4B) flekker. Tilstedeværelsen av TBR2 (Figur 4C) angir at mellomliggende progenitors er forming, med en morfologi som antyder utover migrasjon. MAP2 + (Figur 4D) neurons fylle regionene ytre av hver rosett. Fra disse proteiner, kan en visualisere ventrikkel sone (VZ), subventricular sone (SVZ), middels sone (IZ) og kortikale plate (CP) innen hvert rosett (Figur 4E, 4E'). Man kan fortsette å kultur disse organoids for å observere senere stadiene av utviklingen. Mens kortikale lagene ikke er like fremtredende i denne organoid, oppstår naturlig bytte til gliogenesis mye som den gjør i vivo. Dette kan observeres i dag 108 organoids, hvor en stor del av celler uttrykke enten MAP2 eller GFAP (Figur 4F-jeg).
Brukerne kan forvente å se forskjellene i organoid størrelse med ca 3 dager etter ZIKV infeksjon, avhengig av viral MOI på organoids (figur 5A-B). Etter disse 3 dager, vil det også være en økning i mobilnettet rusk i infiserte brønnene sammenlignet med uekte brønnene. Denne forskjellen i organoid størrelse vil øke over neste uke, til de infiserte organoids begynner å bryte fra hverandre (figur 5C-D). En rekke analyser kan brukes på dette punktet å undersøke infeksjon mekanismer, inkludert viral RNA utvinning og og kryosnitt (anbefalt antistoffer i tabellen for materiale). På og kryosnitt ser brukerne en stor tilstedeværelse av virus i regionen apikale av neuroepithelial strukturer, antyder en mottakelighet av nevrale stamceller (NPC) for ZIKV infeksjon (figur 6). Immunofluorescence av delt organoids viser også en økning i kløyvde caspase-3 uttrykket i den infiserte organoids (figur 7).
Figur 1 : Stamcelleforskningen kolonien morfologi før organoid formasjon.
Kolonier bør være 50% - 70% confluent ved dissosiasjon å produsere en rekke konsekvent organoids. (A) sparsom, nylig-seeded kulturer har ennå ikke nådd Logg-vekst fase, og ikke produserer mange organoids. (B) når cellene når riktig samløpet, er de klare for dissosiasjon. Det er også viktig at disse koloniene er inspisert for å sikre at de er klare for differensiering. (C) koloniene som er tatt langt kommer over samløpet og er ikke anbefalt for organoid formasjon. Kulturer i denne tilstanden er mer sannsynlig å inneholde unike celler. (D) kolonien kantene skal være tydelig, med konsekvent celle morfologi av avrundet celler i sentrum, og litt avlang celler mot kantene. (E) Minimal differensiering bør være til stede i kulturer. Hvis større, sammenslåtte celler er observert i sentrene eller kantene av kolonier (hvit pilspisser) og utgjør mer enn omtrent 1% av kultur, anbefales det at hakke å fjerne eller ekstra passasjer er utført for å danne en ensartet stamcelleforskningen befolkning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Cerebral organoid vekst over tid.
(A) et diagram for produksjon av cerebral organoids fra 2D PSCer opprettholdt i xeno-fri, mater-fri medium. (B) For de første 8 dagene, organoids blir mest sfærisk med noen synlig funksjoner. Diameteren på organoid vil variere fra ca 300 µm til 500 µm. (C-E) på dag 10 klarere regioner begynner å bli synlig rundt periferien av organoids og de vil miste sin sfærisk form. De vil fortsette å øke til ca 1 mm i diameter, avhengig celle linjen som brukes til å produsere organoids av. (F) etter ca 20 dager med differensiering, brukere vil se dannelsen av neuroepithelial strukturer (svart pilspisser) i Fjern eksterne regioner i de fleste organoids. Disse har en ring-lignende morfologi, med apikale og basal strukturer etterligne de av utvikle cortex. (G) disse neuroepithelial strukturer vil fortsette å vokse og øker i størrelse i ca 20-30 dager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Clearing av mobilnettet rusk via spredning feed teknikk.
Under organoid vekst, mye celledød er å forvente, og kan føre til opphopning av mobilnettet rusk rundt bunnen av organoid. (A) avbildet spredning teknikken tillater forskere å fjerne det meste av dette rusk under hver feed. Du gjør dette ved hjelp av en flerkanals P200 pipette, sakte utarbeide brukte medium og raskt utvise dem å løfte organoid og celle rusk i suspensjon. Organoid vil raskt synke til bunnen av brønnen, da en vanlig mate kan utføres. Eksempler på en dag 6 organoid før (B) og etter (C) spredning fôring viser betydelig avfall reduksjon. Dette fortsetter i flere uker, som vist av en dag 18 organoid før (D) og etter (E) spredning fôring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Karakterisering av cerebral organoids via immunohistochemistry.
Lightsheet bilder av cerebral organoids er vist å gi et eksempel på mobilnettet arkitekturen som danner. På dag 25, DAPI (A) og fosfor-Vimentin (B) angi personlige rosetter og ventrikkel soner, henholdsvis. (C) TBR2 merker mellomliggende progenitors som overfører utover, og MAP2 (D) etiketter nevroner som har dannet i kortikale plate. (E, E') Kombinasjonen av disse proteinene viser tydelig recapitulation av kortikale utvikling i cerebrale organoid modeller. (F-jeg) Dag 108, har gliogenesis oppstått, med en blanding av GFAP + og MAP2 + celler fyller mye av organoid. VZ = ventrikkel sone, SVZ = subventricular sone, IZ = middels sone, CP = kortikale tallerken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Nedbrytning av infiserte organoids.
(A) lyse feltet bilder av Mock og ZIKV-infiserte cerebral organoids på MOI = 0,1 og 10. Bildene ble tatt umiddelbart etter smitte (dag 0), samt 3 og 6 dager etter smitte. (ABC) Brightfield bilder av celle rusk rundt (B) mock og (C) ZIKV-infiserte på MOI = 10 hjerne organoids 3 dager etter smitte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Cryosection og immunofluorescence av infisert organoids.
Dag 24 organoids ble utsatt for ZIKV på MOI = 0,1 og cryosectioned 6 dager senere. På dette stadiet er det en klare tilstedeværelse av virus i ventrikkel, subventricular og mellomliggende soner av organoid, der nevrale stamceller og radial glia ligger. (A) Via kjernefysiske flekker, disse neuroepithelial områder er klart synlig grunn (hvite piler) til av kjerner som ring-lignende strukturer rundt apikale overflaten. (B) av flekker for viral konvolutten, kan man observere en relativt høy tilstedeværelse av virus i disse rosett strukturer (hvit pilspisser). Merk at det er en liten mengde virus i ulike uidentifisert perifere celler. (C-D) MAP2 eller andre Nevron-spesifikke flekker viser at det er nevroner i kulturer som ikke synes å bli infisert av viruset når kledde med viral flekken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Kløyvde caspase-3 immunofluorescence av infiserte organoid.
Etter infeksjon, kan man bruke apoptotisk indikatorer undersøke mekanismer for celledød som oppstår innenfor organoids. I dette eksemplet dag 24 organoids ble utsatt for ZIKV på MOI = 0,1 og cryosectioned 6 dager senere. (A) infisert organoids viser ingen viral konvolutten (4G 2 protein), og en minimal mengde kløyvde caspase-3 på grunn av homøostatisk apoptose forekommer i vevet. (B) infisert rosetter begynne å vise økte nivåer av apoptose. (C) rosetter som viser alvorlig infeksjon via 4G 2 flekker også tendens til å ha høye nivåer av kløyvde caspase-3 i disse regionene. Det er en direkte sammenheng mellom infeksjon alvorlighetsgrad og kløyvde caspase-3 uttrykket i infiserte rosetter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Det er flere ting å vurdere når du bruker menneskelige hjerne organoids å undersøke ZIKV infeksjon. Et viktig hensyn er denne organoid formasjon og strukturen er svært avhengig av stilk cellen linje som de er dannet. Vær forsiktig når du sammenligne mellom linjer, inkludert isogenic foretatt linjer; Det er best å gjøre konklusjoner med flere subclones og ideelt flere stamcelleforskningen linjer. I tillegg på grunn av denne forskjellen i linjer, piloten eksperimenter for å sikre at riktig differensiering skjer i organoids anbefales. Mens neuroepithelial strukturer er synlig ved brightfield mikroskopi, er det også foreslått for å utføre qRT PCR eller og kryosnitt eksperimenter se for neural differensiering markører som PAX6 eller phospho-vimentin.
Man bør også forventer betydelig variasjon blant organoids i samme celle linje. På grunn av unpatterned natur protokollen, kan antallet og størrelsen av neuroepithelial strukturer variere mellom individuelle organoids. Vanligvis kan man forvente minst to store (> 200 μm i diameter med D24) nevrale rosetter per organoid. Derfor er longitudinelle studier, som observasjon av endring i organoid størrelsen på infeksjon, spesielt opplysende. Variasjon mellom grupper kan også oppstå, med den mest sannsynlige årsaken til dette unøyaktig celle teller eller frø. Det anbefales å utføre flere tellinger og at cellen suspensjon er godt blandet før såing på ULA U bunn 96-brønns platene.
Når dyrking organoids i ULA U bunn 96-brønns plater, Planlegg å se betydelig fordampning effekter rundt kantene av platene. Det er ideelt å fylle disse brønnene med PBS og bare arbeide med center 60 brønnene. På grunn av fordampning, vil organoids i de ytre brønnene bli utsatt for ulike forhold enn de i midten, som sannsynligvis vil påvirke deres vekst og differensiering. Vurder dette når du planlegger antall organoids som trengs for eksperimenter. I tillegg vil organoids begynne å overgrow 96-brønns formatet etter omtrent 30 dager, som blir synlig på grunn av misfarging av kultur medium. Hvis planlegger å ta organoids forbi de 30 dagene, anbefales det å overføre organoids til en ULA 24-vel plate. Gjennomføre overføringen, bruk saks til å klippe en P1000 tips slik at åpningen er mye større enn organoids seg og overføre til organoids av pipettering.
Menneskelige hjerne organoids holder stort potensial i fremme feltets forståelse av neurodevelopment og sykdom. Forskere oppfordres til å endre protokollen som nødvendig. For eksempel kunne en gjennomføre mønstre faktorer for å forbedre differensiering effektivitet mot spesifikke celletyper, slik at de kan utforske viral virkninger på bestemte anatomiske regioner. Neurodevelopmental effekten av ZIKV er fremdeles dårlig forstått, men denne nye tilnærmingen vil gi forskerne en tilgjengelig, rask og høy gjennomstrømming måte å undersøke mekanismer for infeksjon.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takke Priscilla L. Yang og Dominique J. Burri ved Harvard medisinske skole for hjelp med første overføring og måling av ZIKV. Vi ønsker å takke Nathaniel D. Kirkpatrick for bildebehandling støtte. Virksomheten ble støttet av Stanley Center for psykiatrisk forskning og Harvard stamcelleforskningen Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
| Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
| Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
| Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
| Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
| Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
| Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
| phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
| TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
| MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
| GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| 488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
| 594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
| 647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
References
- Jurado, K. A., et al. Zika virus productively infects primary human placenta-specific macrophages. JCI Insight. 1, 1-6 (2016).
- Quicke, K. M., et al. Zika Virus Infects Human Placental Macrophages. Cell Host Microbe. 20, 83-90 (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. New Engl J Med. 374, 951-958 (2016).
- Rubin, E. J., Greene, M. F., Baden, L. R. Zika Virus and Microcephaly. New Engl J Med. 374, 984-985 (2016).
- Soares de Oliveira-Szejnfeld, P., et al. Congenital Brain Abnormalities and Zika Virus: What the Radiologist Can Expect to See Prenatally and Postnatally. Radiology. , 161584 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, 8880-8896 (2015).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18, 587-590 (2016).
- Xu, M., et al. Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen. Nat Med. 22, 1101-1107 (2016).
- Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of virology. , 00009-00017 (2017).
- Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19, 720-730 (2016).
- Manangeeswaran, M., Ireland, D. D. C., Verthelyi, D., Tonelli, L., Wang, V. Zika (PRVABC59) Infection Is Associated with T cell Infiltration and Neurodegeneration in CNS of Immunocompetent Neonatal C57Bl/6 Mice. PLOS Pathog. 12, 1006004 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears. Cell reports. 16, 3208-3218 (2016).
- Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nat Commun. 7, 12204 (2016).
- Li, X. -F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).
- Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nat Med. 22, 1448-1455 (2016).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352, 816-818 (2016).
- Wells, M. F., et al. Genetic Ablation of AXL Does Not Protect Human Neural Progenitor Cells and Cerebral Organoids from Zika Virus Infection. Cell Stem Cell. 19, 703-708 (2016).
- Dang, J., et al. Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19, 258-265 (2016).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell Stem Cell. 20, 397-406 (2017).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Eiraku, M., et al. Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8, 424-429 (2011).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
- Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro. Prophylactic Effect of Interferons. J Vis Exp. , e10-e13 (2016).
