Denne protokollen beskriver en teknikk som brukes til å modellere Zika smitte av utvikle hjernen. Bruker wildtype eller utviklet stamcelleforskningen linjer, kan forskere bruke denne teknikken til å avdekke de ulike mekanismer eller behandlinger som kan påvirke tidlig hjernen infeksjon og resulterende microcephaly i Zika virusinfiserte embryoer.
Den nylige framveksten av Zika virus (ZIKV) i mottakelige populasjoner har ført til en brå økning i microcephaly og andre neurodevelopmental forhold i nyfødte. Mens mygg hovedruten for viral overføring, har det også vist å spre via seksuell kontakt og loddrett mor-å-fosteret overføring. I dette siste tilfelle av overføring, på grunn av den unike viral tropism av ZIKV, antas virus å hovedsakelig mål nevrale stamceller (NPC) av utvikle hjernen.
Her en metode for modellering ZIKV infeksjon, og den resulterende microcephaly, som oppstår når menneskelige hjerne organoids er utsatt å leve ZIKV er beskrevet. Organoids viser høye nivåer av virus innen nevrale befolkningen, og utstilling alvorlig celledød og microcephaly over tid. Denne tredimensjonale cerebral organoid modellen tillater forskere å utføre arter-matchet eksperimenter for å observere og potensielt gripe inn med ZIKV infeksjon av utvikle hjernen. Modellen gir forbedret relevansen over standard todimensjonal metoder, og inneholder menneske-spesifikke mobilnettet arkitektur og protein uttrykk som ikke er mulig i dyremodeller.
Zika virus (ZIKV) har raskt spre Mikronesia, Fransk Polynesia og Amerika, og har nylig blitt vist å krysse placental barriere1,2 å infisere utvikle fosterets hjernen, fører til neurodevelopmental sykdommer slik som microcephaly3,4,5,6 . Den langsiktige virkningen på disse pasientene liv, og gjeldende mangel på behandling, har ført forskere og klinikere å rykke ut for en bedre forståelse for mekanismene bak ZIKV smitte og replikering. Tidligere studier har undersøkt ZIKV infeksjon av in vitro -systemer i en rekke fysiologisk relevante cellen typer7,8,9, samt i vivo10 med immunkompetente og immunsupprimerte mus11,12,13 og ikke-menneskelige primater14,15,16. I tillegg til disse mer konvensjonelle teknikker, har flere grupper implementert Stamcelle-avledet cerebral organoids å forstå mer om ZIKV infeksjon av utvikle hjernen. Disse gruppene har utnyttet menneskelige hjerne organoids bekrefte microcephaly fenotypen17,18, undersøke reseptorer knyttet til virus oppføring19, undersøke fysiologiske responser til infeksjon20 , 21, og potensielt skjermen for narkotika kandidater22. Her er en teknikk for raskt produsere og infisere Stamcelle-avledet hjerne organoids beskrevet, som vist tidligere19, å forbedre forståelsen av ZIKV infeksjon av utvikle hjernen.
Siden organoids dannes fra standard pluripotent stamceller (PSC) kulturer, gir denne teknikken en rekke vitenskapelige spørsmål besvares om viral infeksjon av utvikle hjernen. CRISPR engineering kan for eksempel brukes til å endre disse PSC linjer før organoid infeksjon raskere enn de fleste i vivo genetiske studier19. I tillegg, i motsetning til i standard to-dimensjonale (2D) differensiering kulturer, organoids utstilling komplekse mobilnettet arkitektur som er kritisk for corticogenesis, og nyere studier har vist at denne arkitekturen kan bli avbrutt på infeksjon 21. Endelig, relativt lav pris å generere organoids lar for høyere gjennomstrømming eksperimentering og screening i forhold til i vivo modeller. På den annen side, er det noen ulemper til utnyttelse av organoids å studere ZIKV. Mens organoids er langt mer biologisk relevant enn 2D kulturer, er det flere utfordringer i vurderingen av organoids på grunn av deres tredimensjonale (3D) natur. Bildebehandling og av organoids gjerne involverer mer utstyr og en større investering ressurser enn i standard 2D kulturer. I tillegg mangler organoids blodkar og immunologiske komponenter som finnes i i vivo modeller, slik at forskere interessert i aspektene av virusinfeksjon anbefales å søke en alternativ protokoll.
Det finnes en rekke teknikker for dannelsen av menneskelig organoids og neurospheres i kultur, og de vanligvis faller innenfor kategoriene mønstret eller unpatterned . Mønstret metoder implementere faktorer å regulere Wnt, BMP, TGFβ og andre signalveier å presse differensiering mot bestemte overleveringslinjer23. Unpatterned metoder, som beskrevet her, dra nytte av hang for indusert pluripotent stamceller (iPSCs) og menneskelige embryonale stamceller (hESCs) å skille mot en neuroectodermal avstamning av standard24. Etter ca tre uker med differensiering består de resulterende organoids av store biomimetic neuroepithelial strukturer som inneholder flere celletyper som er observert i tidlig utvikle hjernen.
Teknikken for produsere organoids fra standard, mater-fri PSC kulturer og infisere disse organoids med ZIKV vises i sin helhet. Retningslinjer for culturing metodene som trengs for mater-fri PSCer, se forrige metoder publikasjoner25,26. I tillegg vil bruke konsekvent mengder virus for flere eksperimenter, er det viktig å beregne MOI forhånd. Dette gjøres ved å gjennomføre en infeksjon av Vero celler, etterfulgt av behandling med overlegg medium og inkubasjon immunostai. Beskrivelser og metoder for denne teknikken har vært beskrevet tidligere19,27.
Når PSC kultur når målet samløpet av 50% – 70%, cellene deretter avstand og samles i svært lav vedlegg 96-brønns plater. Cellene er opprettholdt i 3 dager på xeno-fri stamcelleforskningen vedlikehold media (SCMM), og konverteres til en neural induksjon media for resten av kulturen. Når organoids ha differensiert i 3 uker, kan infeksjonen utføres. Ved rutinemessig å ta bilder i løpet av uken etter infeksjon, vil forskerne observere progressiv celledød og avbrudd i organoid. Forskerne kan også oppheve tilknytningen til organoids på denne tid til å foreta transcriptional eller proteomic profilering. Og kryosnitt og lightsheet anbefales for bildebehandling, og forskere kan forvente å se høye nivåer av infeksjon og viral replikasjon spesielt innen nevrale celle (NPC) befolkningen i organoids. Til slutt, denne teknikken kan forskere raskt undersøke mekanismer for viral infeksjon av den menneskelige hjernen med lav pris og begrenset.
Det er flere ting å vurdere når du bruker menneskelige hjerne organoids å undersøke ZIKV infeksjon. Et viktig hensyn er denne organoid formasjon og strukturen er svært avhengig av stilk cellen linje som de er dannet. Vær forsiktig når du sammenligne mellom linjer, inkludert isogenic foretatt linjer; Det er best å gjøre konklusjoner med flere subclones og ideelt flere stamcelleforskningen linjer. I tillegg på grunn av denne forskjellen i linjer, piloten eksperimenter for å sikre at riktig differensiering skjer i organoids anbefales. Mens neuroepithelial strukturer er synlig ved brightfield mikroskopi, er det også foreslått for å utføre qRT PCR eller og kryosnitt eksperimenter se for neural differensiering markører som PAX6 eller phospho-vimentin.
Man bør også forventer betydelig variasjon blant organoids i samme celle linje. På grunn av unpatterned natur protokollen, kan antallet og størrelsen av neuroepithelial strukturer variere mellom individuelle organoids. Vanligvis kan man forvente minst to store (> 200 μm i diameter med D24) nevrale rosetter per organoid. Derfor er longitudinelle studier, som observasjon av endring i organoid størrelsen på infeksjon, spesielt opplysende. Variasjon mellom grupper kan også oppstå, med den mest sannsynlige årsaken til dette unøyaktig celle teller eller frø. Det anbefales å utføre flere tellinger og at cellen suspensjon er godt blandet før såing på ULA U bunn 96-brønns platene.
Når dyrking organoids i ULA U bunn 96-brønns plater, Planlegg å se betydelig fordampning effekter rundt kantene av platene. Det er ideelt å fylle disse brønnene med PBS og bare arbeide med center 60 brønnene. På grunn av fordampning, vil organoids i de ytre brønnene bli utsatt for ulike forhold enn de i midten, som sannsynligvis vil påvirke deres vekst og differensiering. Vurder dette når du planlegger antall organoids som trengs for eksperimenter. I tillegg vil organoids begynne å overgrow 96-brønns formatet etter omtrent 30 dager, som blir synlig på grunn av misfarging av kultur medium. Hvis planlegger å ta organoids forbi de 30 dagene, anbefales det å overføre organoids til en ULA 24-vel plate. Gjennomføre overføringen, bruk saks til å klippe en P1000 tips slik at åpningen er mye større enn organoids seg og overføre til organoids av pipettering.
Menneskelige hjerne organoids holder stort potensial i fremme feltets forståelse av neurodevelopment og sykdom. Forskere oppfordres til å endre protokollen som nødvendig. For eksempel kunne en gjennomføre mønstre faktorer for å forbedre differensiering effektivitet mot spesifikke celletyper, slik at de kan utforske viral virkninger på bestemte anatomiske regioner. Neurodevelopmental effekten av ZIKV er fremdeles dårlig forstått, men denne nye tilnærmingen vil gi forskerne en tilgjengelig, rask og høy gjennomstrømming måte å undersøke mekanismer for infeksjon.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Priscilla L. Yang og Dominique J. Burri ved Harvard medisinske skole for hjelp med første overføring og måling av ZIKV. Vi ønsker å takke Nathaniel D. Kirkpatrick for bildebehandling støtte. Virksomheten ble støttet av Stanley Center for psykiatrisk forskning og Harvard stamcelleforskningen Institute.
Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8 | StemCell Technologies | 5940 | Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton. Store at 4 ᵒC for up to two weeks after prepared from individual components |
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
Enzymatic Detachment Reagent, Accutase | Gibco | A11105-01 | Store aliquoted at -20 ᵒC, do not keep thawed for longer than necessary |
Y-27632 | Selleck Chem | S1049 | Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 ᵒC in 50µL aliquots. |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
Heparin | Sigma-Adrich | H4784-1G | Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 ᵒC in 250µL aliquots |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |