Summary
En protokoll for strukturell analyse av polysakkarider av gel geleelektroforese (TEMPO), bruke mannan som et eksempel, er beskrevet.
Abstract
Anlegget cellen vegg polysakkarider er notorisk vanskelig å analysere de fleste metodene krever dyrt utstyr, dyktige operatører og store mengder renset materiale. Her beskriver vi en enkel metode for å få detaljert polysakkarid strukturelle informasjon, inkludert oppløsning av strukturelle isomerene. For polysakkarid analyse av gel geleelektroforese (TEMPO) hydrolyzed cellevegg plantemateriale med glycosyl hydrolases gjelder for polysakkarid av interesse (f.eks mannanases for mannan). Stort format polyakrylamid gels brukes deretter til å skille de lanserte oligosaccharides, som er fluorescently merket. Gels kan visualiseres med en modifisert gel tenkelig system (se Tabell for materiale). Resulterende oligosaccharide fingeravtrykket kan enten sammenlignes kvalitativt eller, med replikering kvantitativt. Sammenhengen og forgrening informasjon kan etableres ved hjelp av flere glycosyl hydrolases (f.eks mannosidases og galactosidases). Mens denne protokollen beskriver en metode for å analysere glucomannan struktur, kan det brukes på alle polysakkarid som preget glycosyl hydrolases finnes. Alternativt kan det brukes til å karakterisere romanen glycosyl hydrolases bruker definerte polysakkarid underlag.
Introduction
Polysakkarid analyse av gel geleelektroforese (TEMPO) er en metode for detaljert karakterisering av polysakkarider1,2,3. Anlegget cellen vegg polysakkarider er notorisk vanskelig å analysere de fleste metodene krever dyrt utstyr, dyktige operatører og store mengder renset materiale. Her beskriver vi en enkel metode for å få detaljert polysakkarid strukturelle informasjon, inkludert oppløsning av strukturelle isomerene.
Forståelse anlegget cellen vegg polysakkarid struktur er nødvendig for disse forskerne å utforske anlegget cellen vegg biosyntesen eller rollen anlegget cellen vegg i anlegget utvikling. Nylig imidlertid har anlegget cellen vegg sammensetning blitt interessant å en bredere gruppe forskere på grunn av fokuset på bruke anlegget biomasse (i hovedsak cellen vegg) som råstoff til å produsere biodrivstoff og biokjemikalier4. Som et eksempel krever effektiv enzymatisk saccharification av dette materialet en detaljert forståelse av polysakkarid strukturer, slik at optimalisert enzymatisk cocktailer kan valgte5.
PACE har flere fordeler over alternativ metoder som gjør det ideelt for rask analyse av komplekse glycan strukturer. Først, den ikke krever rensing av polysakkarid i spørsmålet, er nødvendig for løsning staten kjernefysiske magnetisk resonans (NRM)6. Dernest TEMPO kan løse strukturelle isomerene, i motsetning til massespektrometri (MS, f.eks matrix-assistert desorpsjon/ionisering (MALDI) og electrospray ionization (ESI)), som kan også være utfordrende for å utføre av flytende kromatografi (Langbane) 7. det tredje TEMPO er veldig følsom, med lav-picomole oppløsning, i motsetning til tynne lag kromatografi (TLC) eller papir kromatografi. Til slutt, den ikke krever dyrt utstyr eller spesialist kunnskap, som er tilfellet for MS, NMR og LC.
Metoden TEMPO er avhengig av spesifisitet av glycosyl hydrolase (GH) enzymer som målrette bestemte glycosidic sammenhengene i en blanding av polysakkarider. Når GH enzymet fungerer på polysakkarid kjeden, avslører det en redusert slutten som kan deretter bli kjemisk derivatized, i dette tilfellet med et fluorescerende plateselskap. Den unhydrolyzed delen av prøven gjengis derfor undetectable av denne metoden. De merket oligosaccharides skilles deretter i et stort format akrylamid gel med geleelektroforese. Dette gir utmerket oppløsning på veldig like molekyler, for eksempel trisaccharides Glc-mann-mann og Glc-mann-Glc har en annen Rf.
PACE har vært brukt mye å karakterisere ulike xylan strukturer over plante arter8, for å identifisere glycosyltransferase mutanter i Arabidopsis6,9,10,11 , utføre glycosyltransferase analyser9og å karakterisere romanen GH aktiviteter12,13. Vi har også nylig brukte det som kjennetegner gjær cellevegg mannan (Mahboubi og Mortimer, forberedelse). Her beskriver vi en metode for å karakterisere anlegget cellen vegg glucomannan struktur, basert på tidligere rapporter11,14.
Protocol
1. høsting av plantemateriale
- høste frisk plantemateriale (~ 20 mg) og umiddelbart dukke det i 96% (v/v) etanol og ruge på 70 ° C i 30 min, dette deaktiverer alle cellevegg nedverdigende enzymer stede. For tørr materiale, starter på trinn 2.
FORSIKTIG: Etanol er brannfarlig.
Merk: Et enkelt stammen eller rosett blad vil gi nok materiale for analyse. Men færre feil oppstår hvis et større antall vev er samlet og analysert siden dette er enklere å veie og håndtere. - Oppføringstypen nøye vev og utviklingsstadiet, som polysakkarid struktur varierer med begge. For eksempel med Arabidopsis thaliana (brukt her), scenen vevet etter metoder fra Boyes et al. 15
Merk: I denne protokollen, har vi brukt den nedre halvdelen av sitter stilken, der den første silique er fullt langstrakte men ikke gulfarging.
2. forberedelse av alkohol uløselig rester (luft)
- forberede luften, etter metode for Mortimer et al. 9 eller en annen lignende måte, for å produsere en pulver mangler løselig sukker, som sukrose og stivelse.
3. Aliquoting og forbehandling av luft
Merk: den eksakte mengden av luft for hvert utvalg vil avhenge av (a) overflod av polysakkarid interesse i materialet og (b) den gjennomsnittlige størrelsen på oligosaccharides utgitt av GH. Metoden legger et enkelt fluorescerende molekyl å redusere slutten av hver oligosaccharide, slik at antall oligosaccharides bestemmer sensitiviteten av eksperimentet. Som en retningslinje, glucomannan i Arabidopsis stem fordøyd med GH5 GH26 (som beskrevet), 500 µg anbefales for 11, mens xylan i Arabidopsis stem fordøyd med GH11, 100 µg anbefales som Mortimer ' s studien 3.
- veie AIR (10-15 mg) i en 15-mL sentrifuge rør, og legge H 2 O til en endelig konsentrasjon av 2 mg/mL. Vortex å oppnå en selv suspensjon. Hvis dette er problematisk, deretter bruke en glass homogenizer for å hjelpe denne prosessen.
- Aliquot 500 µg i microfuge rør. Tørr dele ved hjelp av et vakuum sentrifuge (se Tabell for materiale) overnatting på 30 ° C.
- Forbehandlingsfasen luften med 1 M NaOH (20 µL) 1t ved romtemperatur; dette de acetylates polysakkaridene og svulmer cellulose microfibrils, forstyrre biomasse strukturen og GH tilgang.
Merk: Denne steg kan hoppet for renset polysakkarider. FORSIKTIG – sterk syre/base.- Inkluderer en aliquot for en nei-enzym AIR kontroll (behandlet det samme som alle prøver, unntatt trinn 4.1. er utelukket).
- Legge til 200 µL av H 2 O og 20 µL 1 M HCl å nøytralisere. Test at pH er ~ 6-7 ved å fjerne 1 µL og flekkete den på papir pH indikator strimler.
- Legge til 50 µL 1 M ammonium acetate buffer, pH 6.0 (eller pH er passende for GHs brukes i studien) og H 2 O gi et totalt volum på 500 µL.
Merk: Ammonium acetate brukes det sublimerer ved tørking, og så det ikke legges ekstra salt til prøven. En overflødig salt kan føre til dårlig band-form og oppløsning på TEMPO gel.
4. Hydrolyse av luft med Glycosyl Hydrolases (GHs)
Merk: som nevnt i diskusjonen, renheten av GHs er avgjørende. Bare bruk heterologously uttrykt, affinitet renset enzymer. Ved mottak av hver mye fra produsenten, hydrolyze definert dele substrat (f.eks 500 µg AIR) med økende mengder GH natten (f.eks 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 enheter/µL). Når det er et overskudd av GH, ser TEMPO fingeravtrykket identiske. Et overskudd av enzymet er nødvendig for å levere en reproduserbar resultatet fordi det må være sikker på at hydrolyse reaksjonen nærmer seg sluttpunktet.
- Legg til et forhåndsbestemt beløp (se ovenfor) i mannanases (GH5 og GH26 11) til luft dele buffer fra trinn 3.5, samt en positiv kontroll (30 µg av konjac glucomannan) og en nei-AIR negativ kontroll (enzym blanding i en Tom rør). Vortex og deretter spinne kort å samle reaksjonsblandingen i bunnen av røret.
- Ruge over natten på 37 ° C (eller den riktige temperaturen for GH valgfrihet) med mild agitasjon (~ 100 rpm).
- Stoppe reaksjonen rugende ved 95 ° C i 20 min.
Merk: Cap nedleggelser kan brukes til å forsegle flip-top microfuge rør.- Sentrifuge med en benk toppen microfuge med maksimal hastighet for 10 min og beholde nedbryting.
- Resuspend pellets i 250 µL H 2 O, sentrifuger som ovenfor, og beholder nedbryting.
- Kombinerer både supernatants og tørr i et vakuum sentrifuger (se Tabell for materiale) på 30 ° C (~ 3 h eller overnatting uten varme).
5. Utarbeidelse av Oligosaccharide standarder
- forberede 1 mM lager løsninger i H 2 O mannose (mann), mannobiose (Man 2), mannotriose (mann 3), mannotetraose (mann 4), mannopentaose (mann 5) og mannohexaose (mann 6), alle β, 1-4 knyttet. Aliquot og butikk på 20 ° C til nødvendig.
- Lag 3 ulike konsentrasjoner av en mann 1-6 blanding ved å kombinere 1 µL (Standard S1), 2 µL (S2) eller 5 µL (S3) av alle seks.
- Tørr i et vakuum sentrifuger (se Tabell for materiale) på 30 ° C (~ 1 h).
6. Derivitization av Oligosaccharides
- forberede en lagerløsning av 0,2 M MAUR (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) i H 2 O: eddiksyre 17:3. Varm lager til 60 ° C å løse solid. Butikken på 20 ° C, beskyttet fra lys, for 2-3 måneder.
- Utarbeide en 0,2 M lager løsning av 2-picoline borane (2-PB) i DMSO. Dette er ekstremt hygroskopisk, så umiddelbart resuspend alle pulver mottak i DMSO. Aliquot, og butikken på 20 ° C i 1-2 år. Tine dele som nødvendig (butikken ved 4 ° C i 2 uker, og deretter Forkast).
- Forberede derivatization bufferen H 2 O: eddiksyre acid: DMSO 17:3:20.
- Hver prøve, legge til 5 µL av MAUR, 5 µL av 2-PB og 10 µL derivatization bufferen. Spin kort å samle i bunnen av røret, vortex grundig, og deretter spinne kort igjen. Se figur 1 reaksjon beskrivelse.
- Incubate prøver overnatting på 37 ° C, beskyttet fra lys.
- Tørr i et vakuum sentrifuger (se Tabell for materiale) på 30 ° C (~ 2 h).
- Resuspend prøver og standard i 100 µL 3 M urea. Butikken på 20 ° C, beskyttet mot lyset til nødvendig.
7. Utarbeidelse av TEMPO gels
Merk: montering av gel avstøpning utstyret vil avhenge av merke. Her vi use en loddrett geleelektroforese system (se Tabell for materiale), utstyrt med 18 cm x 24 cm glassplater og 1,5 mm avstandsstykker.
- Montere gel avstøpning utstyr per produsenten ' s instruksjoner.
- Lag 10 x TEMPO buffer (1 M Tris-Borate, pH 8.2) som følger: Legg 121.14 g Tris-Base til ~ 400 mL H 2 O og blandingen til å oppløse. Justere pH til 8,2 ved tillegg av solid borsyre (ca 60 g), og gjør deretter volum opp til 1 L.
- Gjør en 10% (w/v) ammonium persulfate (APS) lager i H 2 O. Aliquot og lagre på-20 ° C. tine dele en gang, lagre på 4 ° C og kaste etter 2 uker.
- Gjør og hell løse gel. For over utstyr tilsvarer 1 gel 50 mL. I en 50 mL sentrifuge tube, bland H 2 O (20.2 mL), 5 mL 10 x TEMPO buffer, 24,6 mL 40% akrylamid/Bis-akrylamid (29:1 acrylamide:Bis). (Advarsel: giftig).
- Legge til 200 µL av APS og 20 µL av N, N, N, N´-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED). Inverter forsiktig å blande (for å unngå å innføre luftbobler). Hell gel bruker en serologisk eller andre store volum pipette, ~ 4 cm under toppen av glass platene. Vær oppmerksom på muligheten for luftbobler innestengt i gel. Hvis de gjør, stoppe helle og tilt/trykk gel å løslate dem.
- Overlegg gel isopropanol (forsiktig : brannfarlig) eller nøye, med H 2 O. Tillat gel til danner (20-30 minutter), og hell av det øverste laget. Hvis isopropanol ble brukt, så vaske 2 x med H 2 O. tørr overflødig væske med blotting papir.
- Gjør og hell stabling gel. Bland 6.8 mL H 2 O, 1 mL 10 x TEMPO buffer, 2,8 mL akrylamid/Bis-akrylamid (forsiktig: giftig), 80 µL APS og 8 µL av TEMED i et 15 mL sentrifuge rør. Inverter for å mikse og overlegg på toppen av polymerized løse gel. Forsiktig inn kammer, unngå overtrykk luftbobler under kam tennene.
- Tillat gel til danner (20-30 min), pakk i fuktig vev og deretter i plastfolie, og lagre på 4 ° C til nødvendig. Butikk med kammene på plass.
Merk: TEMPO gels kan lagres maksimalt 2 uker (men mindre enn 1 uke er ideelle), hvis de holdes fuktig.
8. Kjører et TEMPO Gel
- bruker en permanent markør merke godt stillingene på glass, som vil bistå i å holde oversikt over lasting rekkefølgen, og identifisere hvor brønnene er når kammen er fjernet.
- Fjerne kammen. Fylle brønnene med 1 x TEMPO buffer.
- Bruker en 10 µL microsyringe for å laste 2 µL av standarder og prøver i brønner. Unngå å bruke de ytterste lanes, som pleier å kjøre prøver dårlig.
- Montere den øvre kammeret av gel-kjører apparater, og plasser gel i en avkjølt (~ 10 ° C) kjører tank (10 ° C) som inneholder 1 x TEMPO buffer. Fyll den øvre kammeret med 1 x TEMPO buffer.
- Slå på kraften og Kjør gel 200 V (konstant V) i 30 minutter, og øke spenningen til 1000 V for 1 h 40 minutter. Beskytte gels fra lys (f.eks ved å pakke tanker i svarte søppelsekker).
Merk: Se på geléer ~ 5 min etter aktivere spenningen, og deretter en annen 5 minutter etter økende spenningen til 1000 V. Hvis pakningen er ikke opprettholde spenningen så er det sannsynligvis en buffer lekkasje. Fjerne gel fra tanken. Montere det øvre kammeret, nøye sjekke plasseringen av alle pakninger. En stor brikke på den øvre kanten av glassplaten kan hindre platen danner en god tetning med pakningen. Dette kan vanligvis bli midlertidig løst ved å legge til en dråpe 5% (w/v) smeltet agarose delen kuttet i glasset, før du legger det øvre kammeret.
9. Visualisere en TEMPO gel
Merk: Bruk en gel tenkelig system utstyrt med jevne UV pærer i transilluminator og et utslipp filter for kameraet som er egnet til fluorophore, her 530 nm. Alternativt en laser skanneren kan også brukes som beskrevet i Goubet 2.
- Sikre gel tenkelig system er støvfritt ved å tørke den med fuktig bomullsklut vev.
- Fjerner gel TEMPO tanken og vise kort mens gel er fortsatt i glassplater (< 80 ms) å finne ut hvis dye foran gel.
- Åpner gel benytter en kile verktøyet og mens gel er fortsatt på en glassplate, bruker en pizza kutter fjerne begge stabling gel og hvis dye fronten er fortsatt på gel, bunnen av gel.
- Sette ~ 5 mL H 2 O på overflaten av transilluminator, og deretter overføre gel direkte på transilluminator. Angi filteret til UV 605, og slå på Langbølge UV-transilluminator (se Tabell for materiale) programmvre.
Merk: MAUR fluorophore brukt her har en eksitasjon/utslipp av 353/520 nm. - Tar flere bilder på ulike eksponeringstider (f.eks 100 ms 10 s). Kontroller at UV-lyset er slått av mellom bilder ved å klikke UV lys (for å slå det av) for å unngå nedverdigende fluorescensen. Kontroller at minst 2 bilder har ingen mettet band (gel tenkelig programvare vil indikere dette).
- Lagre filer som høy-resolution.tif bilder.
Merk: Bilder kan analyseres ved hjelp av programvaren som følger med gel tenkelig system, eller ved hjelp av fritt tilgjengelig image analyseprogramvare, som ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Se delen resultater for en diskusjon for kvantifisering.
Representative Results
Her viser vi en eksempel TEMPO gel kjører per protokoll, sammen med beskrivelser for å hjelpe med data tolkning og feilsøking, og dette etterfølges av en generell veiledning til vellykket TEMPO gel tolkning13,16. En representant gel av en standard TEMPO analysen cellevegg mannan innhold er vist i figur 2, og er beskrevet kjørefelt av lane.
Standarder
Baner 1, 2 og 3 viser en stige av kjøpt kommersielt oligosaccharides (mann1- mann6) på 5 (S1), 10 (S2) og 50 (S3) pmol konsentrasjon. Når du mottar en kommersiell oligosaccharide nye mye, er det viktig å sjekke renheten på en gel. Mange oligosaccharides, spesielt tetrasacccharides og lenger, kan ha betydelig forurensning med oligosaccharides av andre grader av polymerisasjon (DPs), som vist her for mann6 (merket med *). Mens quantitating en gel, er det viktig å ha minst 3 konsentrasjoner av, siden det er nødvendig for å beregne standardkurven. Beregning av standardkurve kan også være nyttig for å sikre at derivatization reaksjonen er i hovedsak ved fullføring. Standarder for kjent at sammenligninger mellom gels, og er en nyttig for separasjon kvalitet og derivatization kvalitet.
Positiv kontroll
Lane 4 viser en mannanase fordøyelsen av konjac glucomannan. Konjac glucomannan er tilgjengelig kommersielt, og mens den ikke har den samme strukturen som, for eksempel i Arabidopsis, det tjener to formål. Først, det er en viktig kontroll for enzymatisk fordøyelsen. Forskeren bør etablere hva en kommersiell substrat fordøyd med deres GHs valg ser ut når fordøyd til ferdigstillelse (dvs. et stort overskudd av GH legges til reaksjonen). Hvis i fremtiden eksperimenter mønsteret endres, kan dette bety enten tap av aktivitet eller forurensning av GH aksjen. For det andre, det fungerer som en kontroll for derivatization reaksjonen i nærvær av enzym og buffer salter. Hvis standardene ser bra ut, men positivt kontrollen er dårlig, kan så dette bety at en komponent hydrolyse reaksjonen er hemmende til derivatization.
Wild type (WT) Arabidopsis stem AIR + mannanase cocktail (GH5 + GH26)
Lane 5 viser TEMPO fingeravtrykk av en WT Arabidopsis stamme (Sammenlign med referanser11,14).
csla9 Arabidopsis stem AIR + mannanase cocktail (GH5 + GH26)
Lane 6 viser viser TEMPO fingeravtrykk av stammen fra en Arabidopsis plante mangler store stammen mannan syntase11. Sammenligne WT og negativ kontroll fingeravtrykk. Mens fleste av mannan er fraværende i dette anlegget, en liten mengde fortsatt, som dokumentert av redusert bandet intensiteter for alle mannanase-avledet oligosaccharides dette er synthesized av ekstra mannan synthases (CSLA2, 3)11.
Negativ kontroll - enzym bare
Lane 8 viser band på gel som ikke er spesifikke som stammer fra miljøgifter i mannanase cocktail, og bør utelukkes fra analysis (merket med *).
Negativ kontroll - WT luft bare
Lane 9 viser band på gel som er ikke spesifikke og bør utelukkes fra analysis (merket med *).
Negativ kontroll- csla9 AIR bare
Lane 10 viser band på gel som er ikke spesifikke og bør utelukkes fra analysis (merket med *).
Furu tre AIR + mannanase cocktail (GH5 + GH26)
Lane 7 viser TEMPO fingeravtrykk av furu, som inneholder galactoglucomannan. Dette har klart et annet mønster av utgitt oligosaccharides til Arabidopsis, på grunn av ulike strukturen.
Negativ kontroll - Pine luft bare
Lane 11 viser band på gel som er ikke spesifikke og bør utelukkes fra analysis (merket med *).
Tolke en TEMPO gel er relativt enkelt, men krever bevissthet om følgende punkter. Robust data anbefales det for å utføre TEMPOET på minst 3 uavhengig vokst biologiske replikerer, og det anbefales å utføre minst 2 teknisk gjentak på hver biologiske replikere. Kontrollene beskrevet er avgjørende for tolkning, ikke-spesifikk band trenger å bli ekskludert. Vi anbefaler også lasting prøvene i rekkefølgen på Repliker geleer, utelate effekter som følge av ujevn belysning av transilluminator. Nøyaktig tolkning krever analyse av band som ikke er mettet. Siden noen oligosaccharide fingeravtrykk kan inneholde både svært høye og lave mengder polysakkarider, anbefaler vi analysere flere eksponeringer av samme gel. Standardene kan brukes til å normalisere mellom forskjellige bilder.
For noen typer eksperimenter, kan det være ønskelig å kvantifisere mengden av polysakkarid AIR forberedelse. Mens det er mulig å kvantifisere fra en TEMPO gel, det krever kunnskap om nøyaktig molekylær identiteten til hver oligosaccharide utgitt av GHs og hvor det er plassert på TEMPOET gel. Dette er for øyeblikket ikke fullstendig kjent for mannan, men det er bestemt for andre polysakkarider f.eks xylan3. Standarden gir en måte å normalisere mellom geleer, selv når kvantifisering ikke blir utført, og så vil hjelpe noen kvalitativ eller semi kvantitativ analyse.
Identifisere strukturen i enkelte oligosaccharides kan oppnås ved hjelp av cocktailer av GHs. sekvensiell tillegg av ytterligere GHs kan røpe detaljer om sammenhengene og erstatninger av de utgitt oligosaccharides (f.eks tillegg av β - 1,4 - glucosidase som virker på ikke-reduserende slutten vil avdekke hvilke oligosaccharides i blandingen inneholder funksjonen). Tilgjengelige enzymer inkluderer galactosidases, glucuronidases og glucosidases (se CAZy databasen16 for mer informasjon); se Hogg, D. et al. 17 som et eksempel.
Protokollen ovenfor kan brukes til å beskrive aktiviteten til ukjent GHs. I dette tilfellet bør en definert biomasse, som Arabidopsis stammen eller konjac glucomannan, brukes til skjermen ukjent GHs13.
Figur 1 : Dette viser oppsettet for fluorescerende derivatization av oligosaccharides med MAUR. Endret Goubet2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant TEMPO gel viser mannan fingeravtrykket fra Arabidopsis, furu og en Arabidopsis mutant (csla9) som har svekket mannan biosyntesen. AlR var hydrolyzed med en mannanase cocktail og utgitt oligosaccharides ble derivatized med en fluorophore. Oligosaccharides var atskilt med gel geleelektroforese basert på størrelse, form og kostnad. En stige av manno-oligosaccharides (Man1-6) er vist å hjelpe identifisere relative mobilities av de utgitt oligosaccharides, og en hydrolyse av renset mannan (avledet fra konjac) vises som en positiv. * = Uspesifisert band. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
TEMPO er en enkel metode for å karakterisere polysakkarid struktur. Det kan brukes til alle polysakkarid som det er kjent GHs preget aktivitet, kan du se mange eksempler i litteratur1,6,9,11. TT er også brukt på karakterisering av romanen GHs12,13,18 og glycosyltransferases9, ved å bruke definerte polysakkarid underlag og acceptors.
Reproduserbare, interpretable resultater er avhengig av tre viktige trinn. Først bør GHs brukes være fri fra forurensende aktiviteter. Dette er best oppnås ved bare å bruke heterologously uttrykt, affinitet renset enzymer. Andre, for de fleste eksperimenter er det viktig at enzymatisk hydrolyse av substrater ved fullføring. Dette sikrer at samme biomasse hydrolyzed med den samme GH gir samme fingeravtrykket i hvert eksperiment. Til slutt, bør det være et overskudd av fluorophore i derivatization reaksjonen. Dette sikrer at tilgjengelig redusere endene er merket på nær 100%. Dette vil resultere i høy reproduserbarhet resultater, i tillegg til kvantitative data.
Gel og reagens kvalitet er avgjørende for å sikre reproduserbar data. Dårlig kvalitet buffere, spesielt av feil pH, luftbobler i gel, og eksempler med en salt kan alle påvirker oppløsningen og oppbevaring faktor av oligosaccharides. Inkludering av anbefalte kontrollene beskrevet under protokollen og resultatene vil imidlertid aktivere feilsøking.
TEMPO er begrenset av dens evne til å identifisere oligosaccharides. For noen eksperimenter er et enkelt fingeravtrykk alt som er nødvendig. Men for å virkelig quantitate mengden av glucomannan i en prøve av luft, for eksempel identiteten til alle utgitt oligosaccharides er nødvendig, som er en tidkrevende prosess. Dette er enklere for mindre komplekse polysakkarider som xylan3. Siden det er få oligosaccharide standarder kommersielt tilgjengelig, kan det ikke alltid være mulig eller ønskelig å identifisere alle feltene. I dette tilfellet kan TEMPO gi helt gratis data massespektrometri (dvs. MALDI-CID9 eller ESI-MS7og NMR6). For disse metodene er det ofte nyttig å gjøre en storstilt forberedelse, Skill med størrelse-utestenging Ture, og deretter analysere hver fraksjon av både TEMPO før MS eller NMR. Mens det har blitt rapportert at band kan forbrukeravgift og identifisert av MALDI-CID, i praksis har vi funnet at dette har en lav rate suksess (muligens på grunn av interaksjoner av merket oligosaccharides med akrylamid gel utsettes for UV lys).
Den andre store begrensningen av TEMPO er gjennomstrømning. For å ha god kvalitet, interpretable gels med riktige kontroller, hver gel vil bare ha ~ 10 eksperimentelle prøver, og en forsker kan forvente å kjøre ~ 4 TEMPO gels per dag. En versjon av TEMPO ved hjelp kapillært geleelektroforese (CE) har nylig vært utviklet19, hvilke innrømmer forberedelse av prøver i 96-brønnen plater. Det har blitt brukt med hell å karakterisere glycosyltransferase enzym aktiviteter og polysakkarid strukturer6,19, selv om det krever tilgang til en CE maskin som kan være dyrt å kjøpe og vedlikeholde.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
TEMPO metoden ble utviklet og optimalisert av ulike medlemmer av gruppen Dupree (University of Cambridge, UK) gjennom årene, og vi setter pris på alle sine bidrag. Dette arbeidet ble finansiert som en del av DOE felles bioenergi Institute (http://www.jbei.org) støttet av US Department of Energy, Office of Science, Office av biologiske og miljøforskning, gjennom kontrakten DE-AC02-05CH11231 mellom Lawrence Berkeley National Laboratory og US Department of Energy. Vi takker også Thea plukke og Vy Ngo for hjelp med å forberede csla9 prøvene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligosaccaharide Standards | |||
| Mannose | Sigma-Aldrich | CAS 3458-28-4 | |
| Mannobiose | Megazyme | CAS: 14417-51-7 | |
| Mannotriose | Megazyme | CAS: 28173-52-6 | |
| Mannotetraose | Megazyme | CAS: 51327-76-5 | |
| Mannopentaose | Megazyme | CAS: 70281-35-5 | |
| Mannhexaose | Megazyme | CAS: 70281-36-6 | |
| Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) | Megazyme | P-GLCML | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other specialty chemicals | |||
| 8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid | (Molecular probes) Thermo | A350 | |
| 2-picoline borane | TCI | B3018 | |
| 40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) | Bio-rad | 1610146 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialty Equipment | |||
| Gel casting kit | Hoefer | SE660 kit | 18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers |
| Cooling recirculating water bath | Hoefer | RCB20-plus 115v | Needs to be able to maintain temperature at ~10 C |
| G:Box Chemi XRQ Imaging System | Syngene | 05-GBOX-CHEMI-XRQ | Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs |
| High Voltage Power Pack | Thermo | EC1000XL | 1000V |
| Vacuum centrifuge(Speedvac) | Savant | SPD131 | |
| Vertical Gel electrophoresis system | Hoefer | SE660 | |
| Glycosyl hydrolases | |||
| These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab supplies | |||
| 15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-918 | |
| 50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-951 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gel imaging software ( Genesys) | Syngene |
References
- Barton, C. J., et al. Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Planta. 224 (1), 163-174 (2006).
- Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).
- Mortimer, J. C. Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE. Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).
- Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage. Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).
- Mortimer, J. C., et al. An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14. Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).
- Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).
- Busse-Wicher, M., et al. Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose. Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).
- Mortimer, J., et al. Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).
- Anders, N., et al. Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses. Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).
- Goubet, F., et al. Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis. Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).
- Rogowski, A., et al. Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility. J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).
- Rogowski, A., et al. Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine. Nat Commun. 6, 7481 (2015).
- Handford, M. G., et al. Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana. Planta. 218 (1), 27-36 (2003).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).
- The Carbohydrate Active Enzyme Database. , www.cazy.org (2017).
- Hogg, D., et al. The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation. Biochem J. 371, (Pt 3) 1027-1043 (2003).
- Brennan, Y., et al. Unusual microbial xylanases from insect guts. Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).
- Li, X., et al. Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes. Biotechnol Biofuels. 6, (2013).
