Summary
פרוטוקול לניתוח המבני של סוכרים על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), כדוגמא מנן, מתואר.
Abstract
צמח דופן התא פוליסכרידים קשה לשמצה לנתח, לרוב השיטות דורשים ציוד יקר, אופרטורים מיומן ואת כמויות גדולות של חומר מטוהרים. כאן, אנו מתארים פשוט שיטה להשגת מידע מבני רב-סוכר, כולל רזולוציה של isomers מבנית מפורט. ניתוח רב-סוכר על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), חומר צמחי דופן התא hydrolyzed עם glycosyl hydrolases ספציפית רב-סוכר בעל עניין (למשל, mannanases עבור מנן). פורמט גדול לזיהוי ג'לים משמשות לאחר מכן להפריד את oligosaccharides המשוחררים, אשר סומנו כאנטי fluorescently. ג'לים, ניתן לאבחן עם ג'ל ששונה מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים). טביעת האצבע פחמימה # מיון הפחמימות וכתוצאה מכך ניתן גם להשוות איכותית או, עם שכפול, באופן כמותי. הצמדה ומידע מסעף ניתן להקים באמצעות hydrolases glycosyl נוספים (למשל, mannosidases ו- galactosidases). בעוד פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח מבנה glucomannan, ניתן להחיל אותה על כל רב-סוכר אשר מאופיין glycosyl hydrolases קיים. לחלופין, זה ניתן לאפיין את הרומן glycosyl hydrolases שימוש רב-סוכר מוגדר סובסטרטים.
Introduction
ניתוח רב-סוכר על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE) הוא שיטה של אפיון מפורט של פוליסכרידים-1,-2,-3. צמח דופן התא פוליסכרידים קשה לשמצה לנתח, לרוב השיטות דורשים ציוד יקר, אופרטורים מיומן ואת כמויות גדולות של חומר מטוהרים. כאן, אנו מתארים פשוט שיטה להשגת מידע מבני רב-סוכר, כולל רזולוציה של isomers מבנית מפורט.
מבנה רב-סוכר של דופן התא צמח ההבנה הוא הכרחי עבור אלה החוקרים חקר הצמח ביוסינטזה דופן התא או את התפקיד של החומה תא צמח-התפתחות הצמח. לאחרונה, עם זאת, הרכב קיר תא צמח הפך מעניין לקבוצה רחבה יותר של החוקרים בשל ההתמקדות באמצעות צמח ביומסה (למעשה קיר התא) כמו זינה כדי לייצר דלק ביולוגי, ביוכימיקלים4. לדוגמה, יעיל saccharification אנזימטי החומר הזה דורש הבנה מפורטת של המבנים רב-סוכר, קוקטיילים אנזימטי ממוטבת שניתן יהיה הנבחר5.
קצב יש כמה יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות אשר עושים את זה אידיאלי לניתוח מהיר של מבנים מורכבים glycan. ראשית, היא אינה דורשת טיהור של רב-סוכר המדובר, כפי נדרש פתרון המדינה תהודה מגנטית גרעינית (NMR)6. שנית, קצב ניתן לפתור isomers מבנית, בניגוד ספקטרומטר מסה (MS, למשל, מטריקס בסיוע לייזר desorption/יינון (MALDI) וספקטרומטריית electrospray יינון (ESI)), אשר גם עשויה להיות מאתגרת כדי לבצע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית (LC) 7. שלישית, הקצב הוא מאוד רגיש, עם רזולוציה נמוכה-picomole, שלא כמו דק-שכבה כרומטוגרפיה (TLC) או נייר כרומטוגרפיה. בסופו של דבר, זה אינו דורש ידע ציוד או מומחה יקר, כמו במקרה של MS, NMR של LC.
שיטת הקצב מסתמך על ייחודה של אנזימי הידרולז (GH) glycosyl, אשר יעד מסוימים קישורים glycosidic בתערובת של סוכרים. כאשר האנזים GH פועל על השרשרת רב-סוכר, היא מגלה קצה תוך צמצום אשר יכול אז להיות מבחינה כימית derivatized, במקרה זה עם תווית פלורסנט. בחלק unhydrolyzed של המדגם ולכן מעובד לא לגילוי על ידי שיטה זו. Oligosaccharides עם תוויות ואז מפריד של ג'ל אקרילאמיד בפורמט גדול על ידי אלקטרופורזה. זה נותן פתרון מעולה של מולקולות דומות מאוד, לדוגמה, trisaccharides Glc-גבר-גבר, Glc-גבר-Glc יהיה שונה של Rf.
קצב שימש בהרחבה לאפיין מבנים שונים xylan על פני הצמח מינים8, לזהות מוטציות glycosyltransferase תודרנית6,9,10,11 לביצוע מבחני glycosyltransferase9, כדי לאפיין את הרומן GH פעילויות12,13. גם לאחרונה השתמשנו בו כדי לאפיין שמרים mannan דופן התא (Mahboubi, מורטימר, בהכנה). כאן נתאר שיטת אפיון מבנה הצמח דופן התא glucomannan, בהתבסס על דיווחים קודמים11,14.
Protocol
1. קציר של חומר צמחי
- הקציר חומר צמחי טריים (~ 20 מ ג), מיד לתוכה אתנול 96% (v/v), דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה מבטל כל דופן התא משפילים אנזימים הנוכחי. עבור חומר יבש, מתחילים בשלב 2-
התראה: אתנול הוא דליק.
הערה: עלה אחד גזע או רוזט יספק מספיק חומר לניתוח. עם זאת, פחות שגיאות לצוץ אם בכמות גדולה יותר של רקמה זו איחדו וניתח מכיוון שזה קל יותר שוקל ולטפל. - רקמה סוג רשומה בקפידה, שלב התפתחותי, כמבנה רב-סוכר משתנה עם שניהם. לדוגמה, עם תודרנית לבנה (בשימוש כאן), שלב הרקמה לפי השיטות של בויס. et al. 15
הערה: ב פרוטוקול זה, השתמשנו החצי התחתון של הגזע ינפלוראסכאנך, איפה silique הראשון הינו מאורך מלא אבל לא הצהבה.
2. הכנה של אלכוהול לא מסיסים שאריות (אוויר)
- הכן אוויר, בעקבות השיטה של מורטימר. et al. 9 או שיטה דומה אחרת, על מנת לייצר אבקה חסר סוכרים מסיסים, כגון סוכרוז, עמילן.
3. Aliquoting וטרום טיפול של אוויר
הערה: הכמות המדויקת של אויר הדרוש עבור כל דגימה יהיה תלוי (א) של השפע את רב-סוכר עניין בחומר ו- (ב) בגודל ממוצעת של oligosaccharides שפורסמו על ידי GH. השיטה מוסיף מולקולה בודדת פלורסנט עד הסוף תוך צמצום של. פחמימה # מיון, כל הפחמימות-כך מספר oligosaccharides קובע את הרגישות של הניסוי. כקו מנחה, glucomannan בגזע תודרנית מתעכל עם GH5/GH26 (כמתואר), 500 µg מומלץ 11, ואילו xylan בגזע תודרנית מתעכל עם GH11, מומלץ 100 µg כמו מורטימר ' s המחקר 3.
- שוקל אוויר (10-15 מ ג) לתוך שפופרת צנטרפוגה 15-mL, ולהוסיף H 2 O ריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל. מערבולת כדי להשיג על ההשעיה אפילו. אם זה בעייתי, השתמש מהמגן זכוכית כדי לסייע תהליך זה-
- µG aliquot 500 לתוך microfuge צינורות. יבש aliquots באמצעות צנטריפוגה ואקום (ראה את הטבלה של חומרים) לילה ב- 30 ° C.
- האוויר לטיפול מראש עם 1 M NaOH (20 µL) לשעה בטמפרטורת החדר; זה מבטל את acetylates של סוכרים, מתנפח microfibrils תאית, לשבש את מבנה ביומסה ומאפשר גישה GH.
הערה: שלב זה ניתן לדלג על סוכרים מטוהרים. זהירות – חומצה/בסיס חזק.- כוללים את aliquot עבור פקד אוויר לא-אנזים (אותו יחס כמו כל הדגימות, למעט שלב 4.1. אינו נכלל).
- µL להוסיף 200 של H 2 O ו 20 µL 1 מ' ב- HCl כדי לנטרל. מבחן ה-pH היא ~ 6-7 על ידי הסרת 1 µL ו לראות אותו על גבי נייר אינדיקטור חומציות. מאגר אצטט
- להוסיף 50 µL 1 מ' אמוניום, pH 6.0 (או איזה pH מתאים GHs השתמשו במחקר) ו- H 2 O לתת הנפח הכולל של 500 µL.
הערה: אמוניום אצטט משמש מאז זה sublimes על ייבוש, ולכן זה לא להוסיף מלח נוספים המדגם. עודף מלח יכול להוביל הלהקה המסכן-צורה והרזולוציה על הג'ל פייס.
4. הידרוליזה של האוויר עם Glycosyl Hydrolases (GHs)
הערה: כאמור בדיון, טוהר GHs היא קריטית. רק להשתמש heterologously הביע, זיקה טהור אנזימים. לאחר קבלת כל חלקה של היצרן, hydrolyze aliquots מוגדרים של מצע (למשל, 500 µg אוויר) עם הגדלת כמויות של GH בן לילה (למשל, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 יחידות/µL). כאשר יש עודף של GH, טביעת האצבע בקצב ייראה זהה. עודף של אנזים נדרש לספק תוצאה לשחזור כי זה חייב להיות בטוח כי התגובה הידרוליזה מתקרב נקודת הקצה.
- הוסף סכום שנקבע מראש (ראה לעיל) של mannanases (GH5, GH26 11) כדי aliquots האוויר במאגר מהשלב 3.5, כמו גם חיובי (30 µg של konjac glucomannan), ובקרה פקד שלילי. לא-אייר (אנזים מיקס ב שפופרת ריק). מערבולת, ומסתובב אז בקצרה כדי לאסוף את תערובת התגובה בתחתית השפופרת.
- דגירה בין לילה-37 מעלות צלזיוס (או את הטמפרטורה המתאימה עבור GH הבחירה) עם עצבנות עדין (~ 100 סל ד).
- לעצור את התגובה על ידי המקננת ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות
הערה: כובע סגרים יכול לשמש כדי לסגור את flip-העליון microfuge צינורות.- צנטריפוגה באמצעות microfuge העליון של ספסל במהירות המרבית עבור 10 דקות ונשארים תגובת שיקוע.
- Resuspend צנפה 250 µL H 2 O, צנטריפוגה כאמור לעיל, ולשמר את תגובת שיקוע.
- לשלב שני supernatants, ויבש ומפרידה ואקום (ראה את הטבלה של חומרים) ב 30 ° C (~ 3 h או לילה ללא חימום).
5. הכנת תקנים פחמימה # מיון הפחמימות
- מניות 1 מ"מ הכן פתרונות H 2 O מנוז (אדם), mannobiose (האיש 2), mannotriose (האיש 3), mannotetraose (4 איש), mannopentaose (האיש 5), mannohexaose (איש 6), כל β, 1-4 מקושרים. Aliquot וחנות ב-20 ° C עד נדרש.
- להכין תערובת 1-6 3 ריכוזים שונים של אדם על ידי שילוב של µL 1 (תקן S1), µL 2 (S2) או 5 µL (S3) של כל ששת.
- יבש ומפרידה ואקום (ראה טבלה של חומרים) ב- 30 מעלות צלזיוס (~ 1 h).
6. Derivitization של Oligosaccharides
- להכין פתרון מניות של נמלים 0.2 מ' (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic חומצה) H 2 O: חומצה אצטית 17:3. מניות חם עד 60 ° צלזיוס לחלוטין להתמוסס המוצק. חנות ב-20 ° C, מוגן מפני אור, 2-3 חודשים.
- להכין פתרון 0.2 מ' מניות של 2-picoline borane (2-PB) ב דימתיל סולפוקסיד. זה מאוד היגרוסקופי, אז מיד resuspend כל אבקה עם קבלת ב דימתיל סולפוקסיד. Aliquot, חנות ב-20 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שנים. הפשרת aliquots ככל הנדרש (החנות ב 4 ° C עבור 2 שבועות ולאחר מכן להשליך).
- להכין מאגר derivatization של H 2 O: אצטית חומצה: דימתיל סולפוקסיד בגיל 17:3:20-
- אחד לטעום, להוסיף 5 µL של נמלים, 5 µL של µL 2-PB ו- 10 מאגר derivatization. ספין בקצרה כדי לאסוף בתחתית של הרכבת התחתית, מערבולת ביסודיות, ואז ספין בקצרה שוב. ראה איור 1 לתיאור התגובה.
- Incubate דגימות לילה ב 37 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.
- יבש ומפרידה ואקום (ראה טבלה של חומרים) ב- 30 מעלות צלזיוס (~ 2 h). תקן של אוריאה 100 של 3 מ' µL ודוגמאות
- resuspend. חנות ב-20 ° C, מוגן מפני האור עד נדרש.
7. הכנה של קצב ג ' לים
הערה: הרכבה של הציוד הליהוק ג'ל יהיה תלוי המותג. כאן, אנחנו use מערכת אלקטרופורזה אנכי (ראה טבלה של חומרים), מצוידים עם צלחות זכוכית 18 ס"מ 24 ס"מ ו- 1.5 מ מ מפרידי.
- להרכיב ג'ל מכשור יציקה לכל היצרן ' הוראות s.
- לעשות 10 x קצב מאגר (1 מ' טריס-בוראט, pH 8.2) כלהלן: להוסיף 121.14 גר' טריס-בסיס ~ 400 מ של H 2 O ומיקס להתמוסס. להתאים את ה-pH ל 8.2 על-ידי תוספת של חומצה בורית מוצק (כ- 60 גרם), ולאחר מכן לבצע אחסון עד 1 ל'
- יעשו אמוניום 10% (w/v) persulfate (APS) מניות H 2 O. Aliquot ו לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס. ההפשרה aliquots פעם אחת, לאחסן ב 4 ° C ולמחוק לאחר 2 שבועות.
- להפוך ויוצקים את הג'ל פתרון. עבור הציוד הנ ל, ג'ל 1 להקביל בין 50 מ. בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל, מערבבים H 2 O (20.2 מ"ל), מאגר בקצב של 10 x 5 מ ל, 24.6 מ ל 40% אקרילאמיד/Bis-אקרילאמיד (29:1 acrylamide:Bis). (זהירות: רעיל).
- להוסיף 200 µL של APS ו 20 µL של N, N, N, N´-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED). היפוך בעדינות לערבב (כדי למנוע היכרות עם בועות אוויר). יוצקים את הג'ל באמצעות סרולוגית או פיפטה באמצעי אחסון גדולים אחרים, ~ 4 ס מ מתחת לקצה העליון של הזכוכיות. שימו לב לאפשרות של בועות אוויר מלהילכד הג'ל. אם הם עושים להפסיק לשפוך, הטיה/ברז הג'ל לשחרר אותם.
- כיסוי את הג'ל עם אלכוהול איזופרופיל (זהירות : דליק) או, בזהירות, עם H 2 O. אפשר ג'ל פולימריזציה (20-30 דקות), ולאחר מכן יוצקים את השכבה העליונה. אם אלכוהול איזופרופיל שימש, ואז לשטוף 2 x עם H 2 יבש או כל נוזל עודף באמצעות נייר סופג.
- להפוך ויוצקים את הג'ל הערימה. לערבב 6.8 מ ל H 2 O, מאגר בקצב של 10 x 1 מ"ל, 2.8 מ"ל אקרילאמיד/Bis-אקרילאמיד (זהירות: רעילים), 80 µL APS, µL 8 של TEMED ב שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. ' היפוך ' כדי לערבב, כיסוי על גבי polymerized ג'ל פתרון. הכנס בעדינות מסרקים, הימנעות בועות אוויר השמנה תחת השיניים המסרק.
- אפשר ג'ל כדי פולימריזציה (20-30 דקות), עטוף ברקמה לחה ולאחר מכן גם בניילון נצמד, ולאחסן ב 4 ° C עד הנדרש. חנות עם המסרקים במקום.
הערה: קצב ג'לים ניתן לאחסן לתקופה מקסימלית של 2 שבועות (למרות פחות משבוע הוא אידיאלי), אם הם שמרו לחה.
8. ריצה קצב ג'ל
- להשתמש בסמן קבוע כדי לתייג את העמדות היטב על הזכוכית, אשר יסייע שמירה על מסלול של סדר טעינה, והם בזיהוי איפה הבארות המסרק הוא הוסר ברגע.
- להסיר את המסרק. למלא את הבארות מאגר בקצב 1 x-
- להשתמש microsyringe µL 10 כדי לטעון µL 2 של סטנדרטים ודוגמאות לתוך בארות. הימנע משימוש המסלולים החיצוני ביותר, אשר נוטים לרוץ דגימות גרוע.
- להרכיב התא העליון של המנגנון ג'ל-ריצה, ולמקם את הג'ל במיכל מקורר (~ 10 ° C) פועל (10 ° C) המכיל מאגר בקצב x 1. למלא את התא העליון עם מאגר בקצב 1 x-
- להפעיל כוח והפעל הג'ל ב- 200 וולט (קבוע V) במשך 30 דקות ולאחר מכן עלייה במתח עד 1000 V עבור 1 h 40 דקות. להגן על ג'לים מפני אור (למשל, על ידי ליפוף טנקים בשקיות אשפה שחור).
הערה: לבדוק ג'לים ~ 5 דקות לאחר הפעלת המתח ולאחר מכן עוד 5 דקות לאחר הגדלת המתח עד 1,000 V. אם ערכת צריכת חשמל אין אפשרות לשמור את המתח יש ככל הנראה דליפת המאגר. להסיר את הג'ל של הטנק. להרכיב מחדש את התא העליון, בודקים בזהירות השמה אטמים כל. שבב גדול בקצה העליון של לוח הזכוכית עלול למנוע את הצלחת יוצרים סגירה עם gasket. יכול בדרך כלל באופן זמני לפתור על-ידי הוספת ירידה של 5% (w/v) agarose מותכת לחלק סדוקים של הזכוכית, לפני הוספת התא העליון.
9. להמחיש ג'ל בקצב
הערה: להשתמש ג'ל הדמיה למערך עם נורות UV ארוכת גל את transilluminator, ואת מסנן פליטה למצלמה אשר מתאים fluorophore, כאן 530 ננומטר. לחלופין, סורק לייזר עשוי לשמש גם, כפי שמתואר Goubet 2-
- להבטיח הג'ל מערכת הדמיה היא בחינם אבק על-ידי. מוחקים את זה עם לחות נטולת מוך.
- להסיר את הג'ל ממיכל בקצב והצג בקצרה בזמן הג'ל עדיין נמצא הזכוכיות (< 80 ms) כדי לקבוע אם החזית צבע היא עדיין על הג'ל.
- פתח את הג'ל בעזרת כלי טריז, בעוד ג'ל הוא עדיין בצלחת כוס אחת, להשתמש בחותך פיצה כדי להסיר את הג'ל בשני הערמה, ואם החזית צבע היא עדיין על הג'ל, החלק התחתון של הג'ל.
- את ~ 5 מ ל H 2 O אל פני השטח של transilluminator, ולאחר מכן להעביר את הג'ל ישירות על גבי transilluminator. להגדיר את המסנן UV 605 והפעל את transilluminator והאזינו UV (ראה טבלה של חומרים) באמצעות התוכנה-
הערה: fluorophore נמלים המשמש כאן יש עירור/פליטה של 353/520 nm. - לקחת כמה תמונות בזמנים חשיפה שונים (למשל, 100 ms 10 s). ודא כי האור האולטרה סגול מבוטלת בין תמונות על-ידי לחיצה על לחצן אור UV (לבטל) כדי להימנע משפילים את קרינה פלואורסצנטית. להבטיח כי לפחות 2 תמונות יש להקות רוויים (הג'ל imaging התוכנה יציין זאת).
- שמור קבצים כתמונות גבוהה-resolution.tif.
הערה: תמונות ניתן לנתח באמצעות התוכנה המצורפת עם הג'ל מערכת הדמיה, או באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה בחופשיות, כגון ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). עיין בסעיף תוצאות הדיון כימות.
Representative Results
כאן, אנו מראים על ג'ל קצב דוגמה לרוץ לכל הפרוטוקול, יחד עם תיאורי כדי לסייע עם פרשנות הנתונים ופתרון בעיות, זה מלווה מדריך כללי מוצלחת בקצב ג'ל פרשנות13,16. ג'ל נציג של קצב רגיל וזמינותו של דופן התא מנן תוכן מוצגת באיור2, מתואר ליין מאת ליין.
סטנדרטים
מסלולים 1, 2 ו- 3 הצג סולם של מסחרית שנרכש oligosaccharides (גבר1- גבר6) ב 5 (S1), 10 (S2) ו- 50 ריכוז pmol (S3). בעת קבלת הרבה פחמימה # מיון הפחמימות מסחרי חדש, חשוב לבדוק את הטוהר על ג'ל. Oligosaccharides רבים, במיוחד tetrasacccharides יותר, יכול לקבל זיהום משמעותי, עם oligosaccharides של דרגות אחרות של פלמור (DPs), כמוצג כאן גבר6 (המסומנים *). בזמן quantitating ג'ל, זה חשוב שתהיה לפחות 3 ריכוזי הסטנדרטים, מאז זה הכרחי לחישוב עקומת סטנדרטי. חישוב של העקומה רגיל יכול להיות גם עוזר להבטיח כי התגובה derivatization הוא בעיקרו של דבר בעת סיום. סטנדרטים של ריכוזים ידועים לאפשר השוואות בין ג'לים, פקד שימושי עבור איכות ההפרדה ואיכות derivatization.
בקרה חיובית
ליין 4 מראה של עיכול mannanase konjac glucomannan. Konjac glucomannan זמין מסחרית, בזמן זה לא קיים באותו מבנה כמו זה, לדוגמה, נמצאו תודרנית, זה משמשת לשתי מטרות. ראשית, זה פקד חשוב לעיכול אנזימטיות. החוקר צריך לקבוע איך נראה מצע מסחרי מתעכל עם שלהם GHs להתמקד כאשר מתעכל עד לסיומו (קרי, עודף עצום של GH מתווסף התגובה). אם בעתיד ניסויים התבנית משתנה, זה יכול להצביע או לאובדן של פעילות או זיהום של המניה GH. שנית, הוא משמש פקד עבור התגובה derivatization בנוכחות האנזים ומאגר המלחים. אם הפקד חיובי הוא עני, ולאחר מכן זה עשוי לציין כי רכיב של התגובה הידרוליזה היא המעכבת כדי derivatization הסטנדרטים להיראות טוב.
תודרנית פראי סוג (WT) נובעות אוויר + mannanase קוקטייל (GH5 + GH26)
ליין 5 מציג את קצב טביעות אצבע של גבעול תודרנית WT (השוואה עם הפניות11,14).
csla9 תודרנית גזע אוויר + mannanase קוקטייל (GH5 + GH26)
6 ליין מציגה מראה טביעת האצבע בקצב של הגזע של תודרנית הצמח חסר העיקריות נובעות מנן סינתאז11. להשוות בין WT, שליטה שלילי טביעות אצבעות. בעוד רוב מנן נעדר במפעל הזה, נשארת כמות קטנה, כפי שמעידים עוצמות הלהקה מופחת עבור כל הנגזרות mannanase oligosaccharides זה הוא מסונתז על ידי מנן נוספים synthases (CSLA2, 3)11.
בקרה שלילית - אנזים בלבד
ליין 8 מראה להקות על הג'ל שאינם ספציפיים שואבים מזהמים ב mannanase קוקטייל, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
בקרה שלילית - WT אוויר בלבד
ליין 9 מציג את להקות הג'ל אינם ספציפיים, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
בקרה שלילית- csla9 אוויר בלבד
ליין 10 מראה להקות על הג'ל אינם ספציפיים, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
אורן עץ אוויר + mannanase קוקטייל (GH5 + GH26)
ליין 7 מראה טביעות אצבע בקצב של עץ אורן, אשר מכיל את galactoglucomannan. בבירור יש דפוס שונים של oligosaccharides שפורסמו כדי תודרנית, בשל מבנהו שונה.
בקרה שלילית - אורן אוויר בלבד
11 ליין מראה להקות על הג'ל אינם ספציפיים, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
לפרש ג'ל הקצב פשוט למדי, אך דורשת מודעות לנקודות הבאות. עבור נתונים, מומלץ לבצע את הקצב לפחות 3 באופן עצמאי גדל ביולוגי משכפל, מומלץ לבצע משכפל טכנית לפחות 2 על כל שכפול ביולוגי. הפקדים המתוארים הם קריטיים לפרשנויות, להקות לא ספציפית צריכה להילקח. אנו גם ממליצים טעינת דגימות השונה על שכפל ג'לים, כדי לא לכלול תופעות אשר הם תוצאה של תאורה לא אחידה על ידי transilluminator. לפירוש מדויק דורש ניתוח של להקות אשר לא רוויים. מאז יש טביעות אצבעות פחמימה # מיון הפחמימות עשוי להכיל שני סוכרים שפע מאוד גבוהות ונמוכות, אנו ממליצים ניתוח חשיפות מרובות של הג'ל אותו. הסטנדרטים יכול לשמש כדי לנרמל בין תמונות שונות.
עבור סוגים מסוימים של ניסויים, זה עשוי להיות רצוי לכמת את כמות רב-סוכר בהכנת אוויר. בזמן זה אפשרי לכמת מן הקצב ג'ל, זה דורש ידע את זהותו מולקולרית המדויק של כל פחמימה # מיון הפחמימות שפרסם את GHs, היכן הוא ממוקם על הקצב ג'ל. זה כרגע לא לגמרי ידוע מנן, אך נקבע עבור אחרים סוכרים למשל xylan3. הסטנדרטים מספקים דרך של נורמליזציה בין ג'ל, גם כאשר לא מתבצע כימות, ולכן יסייע לכל ניתוח איכותי או כמותי למחצה.
זיהוי המבנה של הפרט oligosaccharides יכולה להיות מושגת באמצעות קוקטיילים של שקריאה GHs. תוספת של עוד GHs עלול לחשוף פרטים אודות קישורים ותחליפי של oligosaccharides המשוחררים (למשל, תוספת של β - 1, 4 - glucosidase שפועל על קצה שאינם בהפחתת תחשוף אילו oligosaccharides בתערובת מכילים תכונה זו). אנזימים זמינים כוללים galactosidases, glucuronidases, glucosidases (ראה את מסד הנתונים CAZy16 לפרטים נוספים); ראה הוג, ד. et al. 17 כדוגמה.
ניתן להשתמש בפרוטוקול לעיל כדי לאפיין את הפעילות של GHs לא ידוע. במקרה זה, ביומסה מוגדר, כגון תודרנית glucomannan גזע או konjac, אמור לשמש למסך GHs13לא ידוע.
איור 1 : זה מראה את הערכה עבור derivatization הניאון של oligosaccharides עם נמלים. שונה מ- Goubet2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ג'ל בקצב נציג מציג טביעת האצבע מנן תודרנית, אורן, מוטציה של תודרנית (csla9) אשר יש ליקויי ביוסינטזה מנן. AlR היה הידרוליזה עם קוקטייל mannanase, oligosaccharides שפורסמו היו derivatized עם fluorophore. Oligosaccharides היו מופרדים על ידי אלקטרופורזה בג'ל על בסיס גודל, צורה של תשלום. סולם של manno-oligosaccharides (Man1-6) מוצג כדי לסייע בזיהוי mobilities היחסית של oligosaccharides פרסמה, הידרוליזה של מנן מטוהרים (נגזר konjac) מוצג פקד חיובי. * = להקות לא ספציפית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
קצב היא שיטה פשוטה עבור אפיון מבנה רב-סוכר. ניתן להחיל אותה על כל רב-סוכר אשר ידועים GHs עם פעילות מאופיין, לראות דוגמאות רבות הספרות1,6,9,11. Tt הוחלה גם על האפיון של הרומן GHs12,13,18 ו glycosyltransferases9, על ידי עשיית שימוש של סובסטרטים מוגדר רב-סוכר, acceptors.
לשחזור, interpretable תוצאות תלויים שלושה שלבים מרכזיים. קודם כל, GHs בשימוש צריכים להיות חופשיים ובלחות פעילויות. . זה הטוב ביותר מושגת רק באמצעות ביטוי heterologously, זיקה מטוהרים אנזימים. שנית, עבור רוב הניסויים, זה חשוב כי הידרוליזה אנזימטי של סובסטרטים הוא בעת סיום. פעולה זו תבטיח כי ביומסה באותו הידרוליזה עם GH זהה נותן מאפיינים דומים בבכל ניסוי. לבסוף, צריך להיות עודף של fluorophore ב התגובה derivatization. פעולה זו מבטיחה כי הקצוות תוך צמצום זמין לוחיות ההסבר ל 100 אחוז. התוצאה תהיה הפארמצבטית גבוהה של תוצאות, כמו גם נתונים כמותיים.
ג'ל ואיכות ריאגנט הם קריטיים להבטחת לשחזור נתונים. מאגרי באיכות ירודה, במיוחד של שגוי pH, אוויר בועות הג'ל, דגימות עם עודף מלח יכול כל משפיעים על רזולוציה ושמירה פקטור של oligosaccharides. עם זאת, הכללת הפקדים המומלצת המתוארות בסעיף הפרוטוקול ואת התוצאות יאפשר פתרון בעיות.
הקצב הוא מוגבל על ידי היכולת שלו לזהות oligosaccharides. עבור ניסויים, טביעת אצבע פשוטה הוא כל שנדרש. עם זאת, כדי באמת quantitate את כמות glucomannan במדגם של אוויר, לדוגמה, הזהות של כל oligosaccharides פרסמה נדרש, אשר הוא תהליך ממושך. . זה יותר פשוט פחות סוכרים מורכבים כגון xylan3. מאז יש כמה תקנים פחמימה # מיון הפחמימות זמין מסחרית, לא תמיד ייתכן אפשרי או רצוי לזהות את כל הלהקות. במקרה זה, קצב יכול לספק נתונים מחמיא ספקטרומטר מסה (קרי, MALDI-CID9 או ESI-MS7ו- NMR6). על שיטות אלה, לעתים קרובות מועיל לעשות הכנה בקנה מידה גדול, נפרדים על-ידי גודל-הדרה כרומטוגרפיה ולאחר מכן לנתח כל שבר על ידי שני פייס לפני MS או NMR. בעוד בעבר דווח כי להקות יכול להיות טוחנות, המזוהה על-ידי MALDI-CID, בפועל גילינו שאין לזה קצב נמוך של הצלחה (ככל הנראה כתוצאה אינטראקציות של oligosaccharides שכותרתו עם הג'ל אקרילאמיד בעת חשיפה לאור UV).
המגבלה העיקרית אחרים של קצב הוא התפוקה. יש איכות טובה, ג'לים interpretable עם הפקדים המתאימים, ג'ל כל יהיה רק דוגמאות ניסיוני ~ 10, חוקר יכול לצפות לבדוק ~ 4 משטחים הקצב לכל יום. לאחרונה, גרסה של קצב באמצעות נימי אלקטרופורזה (CE) כבר מפותחת19, אשר מאפשר הכנת דוגמאות ב 96-ובכן צלחות. זה שימש בהצלחה כדי לאפיין את פעילות האנזים glycosyltransferase,6,מבנים רב-סוכר19, למרות שזה דורש גישה למחשב לסה נ, יכול להיות יקר כדי לרכוש ולתחזק.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
שיטת הקצב היה פיתח, אופטימיזציה על ידי חברי הקבוצה דופרי (מנדרינית, בריטניה) שונים לאורך השנים, אנו מעריכים כל התרומות שלהם. עבודה זו מומן כחלק של DOE המכון BioEnergy משותף (http://www.jbei.org) נתמכת על ידי מחלקת האנרגיה של ארה ב, משרד המדע, משרד הביולוגיים המחקר הסביבתי, באמצעות חוזה דה-AC02-05CH11231 בין לורנס המעבדה הלאומית ברקלי, מחלקת האנרגיה של ארצות הברית. אנו מודים גם תיאה פיק ו- Vy Ngo לקבלת עזרה בהכנת הדגימות csla9 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligosaccaharide Standards | |||
| Mannose | Sigma-Aldrich | CAS 3458-28-4 | |
| Mannobiose | Megazyme | CAS: 14417-51-7 | |
| Mannotriose | Megazyme | CAS: 28173-52-6 | |
| Mannotetraose | Megazyme | CAS: 51327-76-5 | |
| Mannopentaose | Megazyme | CAS: 70281-35-5 | |
| Mannhexaose | Megazyme | CAS: 70281-36-6 | |
| Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) | Megazyme | P-GLCML | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other specialty chemicals | |||
| 8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid | (Molecular probes) Thermo | A350 | |
| 2-picoline borane | TCI | B3018 | |
| 40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) | Bio-rad | 1610146 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialty Equipment | |||
| Gel casting kit | Hoefer | SE660 kit | 18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers |
| Cooling recirculating water bath | Hoefer | RCB20-plus 115v | Needs to be able to maintain temperature at ~10 C |
| G:Box Chemi XRQ Imaging System | Syngene | 05-GBOX-CHEMI-XRQ | Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs |
| High Voltage Power Pack | Thermo | EC1000XL | 1000V |
| Vacuum centrifuge(Speedvac) | Savant | SPD131 | |
| Vertical Gel electrophoresis system | Hoefer | SE660 | |
| Glycosyl hydrolases | |||
| These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab supplies | |||
| 15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-918 | |
| 50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-951 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gel imaging software ( Genesys) | Syngene |
References
- Barton, C. J., et al. Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Planta. 224 (1), 163-174 (2006).
- Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).
- Mortimer, J. C. Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE. Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).
- Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage. Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).
- Mortimer, J. C., et al. An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14. Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).
- Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).
- Busse-Wicher, M., et al. Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose. Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).
- Mortimer, J., et al. Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).
- Anders, N., et al. Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses. Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).
- Goubet, F., et al. Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis. Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).
- Rogowski, A., et al. Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility. J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).
- Rogowski, A., et al. Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine. Nat Commun. 6, 7481 (2015).
- Handford, M. G., et al. Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana. Planta. 218 (1), 27-36 (2003).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).
- The Carbohydrate Active Enzyme Database. , www.cazy.org (2017).
- Hogg, D., et al. The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation. Biochem J. 371, (Pt 3) 1027-1043 (2003).
- Brennan, Y., et al. Unusual microbial xylanases from insect guts. Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).
- Li, X., et al. Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes. Biotechnol Biofuels. 6, (2013).
