Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer
Summary
Her beskriver vi en protokoll for hele mount immunofluorescence og bildebasert kvantitative volumetric analyse av tidlig stadium mouse embryoer. Vi presenterer denne teknikken som en kraftig tilnærming til kvalitativt og kvantitativt vurdere cardiac strukturer under utvikling, og foreslår at det kan være mye tilpasses andre organsystemer.
Abstract
Bruk av stadig-fremrykkende Bildeteknikker har bidratt stort til vår økt forståelse av embryonale utvikling. Før implantasjon utvikling og organogenesen er to områder av forskning som har benefitted sterkt fra disse framskrittene, på grunn av høy kvalitet som kan fås direkte fra imaging før implantasjon embryo eller ex vivo organer. Mens før implantasjon embryoer har gitt data med spesielt høy romlig oppløsning, vært senere stadier mindre mottakelig for tredimensjonale gjenoppbygging. Få høykvalitets 3D eller volumetriske data for kjente embryonale strukturer i kombinasjon med skjebnen kartlegging eller genetisk avstamning sporing vil tillate en mer omfattende analyse av Morfogenetiske hendelser som skjer under embryogenesis.
Denne protokollen beskriver en hele-mount immunofluorescence tilnærming som gjør at for merking, visualisering og kvantifisering av stamfar celle populasjoner i utvikle hjerte crescent, en nøkkel struktur dannet under heart utvikling. Tilnærmingen er utformet på en slik måte at begge celle – og vev-nivå informasjon kan fås. Bruke AC confocal mikroskopi og bildebehandling, gir denne protokollen tredimensjonale romlige rekonstruksjon av cardiac crescent, noe som gir muligheten til å analysere lokalisering og organisering av bestemte stamfar populasjoner under denne kritiske fasen av hjertet utvikling. Viktigere, gir bruk av referanse antistoffer påfølgende maskering av cardiac crescent og påfølgende kvantitativ måling av områder crescent. Denne protokollen vil ikke bare aktivere en detaljert undersøkelse av tidlig heart utvikling, men med tilpasninger skal gjelder for de fleste organsystemer i gastrula til tidlig somite scenen mus fosteret.
Introduction
Studiet av organogenesen har lenge basert på observasjon av Morfogenetiske hendelser i utviklingsland fosteret. Disse studiene er ofte avhengige av bruk av fluorescerende fargestoffer eller avstamning sporing journalister i kombinasjon med merking av definerte referanse bestander. 1 ved å sammenligne relative plasseringene til disse etikettene, informasjon kan være samlet på opprinnelse, bevegelse eller ultimate bidrag fra en populasjon av interesse. Transplantasjon og skjebne kartlegging eksperimenter bruke morfologiske landemerker eller injeksjon av fargestoffer i ikke-motile overleveringslinjer definere startpunktet for cellene av interesse, som deretter undersøkt for bidrag til utviklet fosteret. 2 , 3 , 4 , 5 genetiske avstamning-sporing eksperimenter bruke samme konsept med godt definerte reporter alleler som brukes til etiketten celle populasjoner uten eksperimentelle manipulasjon. Nøkkelen til disse metodene er muligheten til å bestemme, med høy romlig oppløsning, plasseringen av den eksperimentelle og referanse etiketter. Disse metodene har gitt enestående fremgang før implantasjon utvikling og explant organogenesen studier. 6 , 7 , 8 , 9
Utviklingsmessige hendelsene underlie hjertet morphogenesis har blitt stadig beskrevet de siste årene. 10 er en av de store funnene i dette området av forskning beskrivelsen av en rekke stamfar populasjoner som kan være preget av uttrykk for unike markører. 11 populasjonene er den første og andre hjerte-feltene (FHF og SHF), som finnes i cardiac crescent på fremre siden av embryoet på embryonale dag (E) 8,25 musen utvikling. 12 populasjonene er ofte undersøkt gjennom en kombinasjon av bred-feltet mikroskopi, som gir informasjon om vev nivåer og seriell snitting med immunofluorescence analyser, som tilbyr mobil høyoppløselig men bare todimensjonal romlig informasjon. 13 derfor, mens disse studiene har sterkt avansert vår forståelse av hjertet utvikling, de tilgjengelige metodene har begrenset grundig kvantitativ analyse av morphogenesis under disse stadiene, opprette behovet for tilnærminger til å undersøke den organisering av populasjonene på hele organismen nivå.
Den nylige fremskritt innen både AC confocal mikroskopi og 3D image analyse tillate høy oppløsning og høy gjennomstrømming algoritmisk rekonstruksjoner av celler og strukturer i situ med relativ letthet, dermed banet vei for detaljerte studier av kompleks Cellular strukturer. 14 og økt regnekraft utviklingen av stor-data administrerende algoritmer, både nødvendig å håndtere den eksplosive økningen av imaging datasett, analyser kan nå fullt automatisert. 15 automatisert analyse av tenkelig datasett har fordelen av å være objektiv, men det er bare så pålitelig som kvaliteten på input datasettet; Det er viktig, da, at beste praksis brukes under oppkjøp og bildebehandling pre for å sikre den høyeste kvalitet, saklig analyse. 16 protokoller kan være fullstendig automatisert og delte for reproduserbarhet, og algoritmer som er brukt av proprietær programvare er lett tilgjengelig via biblioteker som skal brukes av forskere som har kjennskap til moderne proprietær eller åpen kildekode utviklerverktøy. 17
Følgende protokollen forklarer fremgangsmåten for å utføre slike analyser på en veldefinert modell av organogenesen, dannelsen av cardiac crescent under utviklingen av hjertet. Spesielt denne protokollen beskriver hvordan å (1) høste og dissekere cardiac halvmåne scenen embryo, (2) utfører hele mount immunofluorescence for henvisning (Nkx2-5) og eksperimentelle (Foxa2Cre:YFP18,19) markører, (3) forberede og image embryo bruker AC confocal mikroskopi, og til slutt (4) analysere og kvantifisere bildene ved hjelp av avanserte tredimensjonale tilnærminger. Mens cardiac crescent brukes som et eksempel her, med passende endring, kan denne protokollen brukes til analyse av flere linjene i gastrula til tidlig somite fase embryo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen ovenfor beskriver en strategi for å få kvantitative data fra høy kvalitet hele mount immunofluorescence bilder av etter implantasjon mouse embryoer. Når utført korrekt, kan 3D volumetriske dataene som genereres gjennom disse trinnene brukes for sammenlignende og interseksjonell analyse av flere domener i fosteret. Overflaten signalet maskering tilnærming er beskrevet er spesielt nyttig når undersøke romanen celle populasjoner med veletablerte referanse strukturer.
Vi tror a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av NIH/NHLBI R56 HL128646 og Mindich barnehelse og utvikling Institute (MCHDI) på ISMMS (til nd). EB er støttet av en NIH/NIDCR lærlingeplass T32 HD075735. Mikroskopi og bildet ble utført mikroskopi kjernen ved Icahn School of Medicine i Sinai, som støttes delvis av Tisch Cancer Institute på Mount Sinai P30 CA196521-Cancer Center støtte Grant.
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -. K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -. K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -. L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
