Summary

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

Published: October 12, 2017
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Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para toda montagem imunofluorescência e baseados em imagem volumétrica análise quantitativa de embriões adiantados de rato de palco. Apresentamos esta técnica como uma poderosa abordagem qualitativa e quantitativamente avaliar estruturas cardíacas durante o desenvolvimento, e propor que seja amplamente adaptável a outros sistemas de órgãos.

Abstract

O uso de técnicas de imagem já avançando contribuiu largamente para nossa maior compreensão do desenvolvimento embrionário. Organogênese e desenvolvimento pré-implantação são duas áreas de investigação que se beneficiaram enormemente destes avanços, devido à alta qualidade dos dados que podem ser obtidos diretamente a partir de imagens de pré-implantação embriões ou ex vivo de órgãos. Enquanto os embriões pré-implantação produziram dados com especialmente alta resolução espacial, estágios posteriores foram menos passíveis de reconstrução tridimensional. Obtenção de dados de alta qualidade 3D ou volumétricos para estruturas embrionárias conhecidas em combinação com mapeamento de destino ou rastreamento de linhagem genética permitirá uma análise mais abrangente dos acontecimentos morfogenéticas ocorrendo durante a embriogênese.

Este protocolo descreve uma abordagem de imunofluorescência toda a montagem que permite a rotulagem, visualização e quantificação de populações de células progenitoras dentro o desenvolvimento crescente cardíaca, uma chave estrutura formada durante o desenvolvimento do coração. A abordagem é projetada de tal forma que ambas as informações de nível de células e tecidos podem ser obtidos. Utilizando microscopia confocal e processamento de imagem, este protocolo permite a reconstrução espacial tridimensional do crescente cardíaca, proporcionando assim a capacidade de analisar a localização e organização das populações específicas progenitor durante nesta fase crítica do desenvolvimento do coração. Importante, o uso de anticorpos de referência permite sucessivo mascaramento do crescente cardíaca e subsequentes medições quantitativas das áreas dentro do crescente. Este protocolo permitirá não só um exame detalhado do desenvolvimento inicial do coração, mas com adaptações deverá ser aplicável à maioria dos sistemas de órgãos na gástrula de embrião somite palco do mouse.

Introduction

O estudo da organogênese tem tempo baseou-se na observação de eventos morfogenéticas no desenvolvimento do embrião. Esses estudos dependem frequentemente o uso de corantes fluorescentes ou repórteres de rastreamento linhagem em combinação com rotulagem das populações de referência definido. 1 , comparando a posição relativa desses rótulos, informações podem ser recolhidas na origem, movimento ou derradeira contribuição de uma população de interesse. Transplante e experimentos de mapeamento de destino usam Marcos morfológicos ou injeção de corantes em non-motile linhagens para definir o ponto de partida das células de interesse, que são então examinadas pela contribuição para o embrião desenvolvido. 2 , 3 , 4 , 5 experiências genéticas de linhagem de rastreamento usam o mesmo conceito com alelos repórter bem definidas que são usadas para populações de células rótulo sem manipulação experimental. Chave para essas abordagens é a capacidade de determinar, com alta resolução espacial, os locais de experimental e rótulos de referência. Estas abordagens têm rendido notável progresso no desenvolvimento de pré-implantação e explantes estudos organogênese. 6 , 7 , 8 , 9

Os eventos do desenvolvimento que sustentam a morfogênese de coração têm sido cada vez mais bem descritos nos últimos anos. 10 uma das principais descobertas nesta área de pesquisa é a descrição de um número de populações de progenitor que podem ser distinguidos pela expressão de marcadores exclusivos. 11 estas populações incluem o primeiro e segundo campos de coração (FHF e SHF), que estão presentes dentro do crescente cardíaco no lado anterior do embrião no dia embrionário (E) 8.25 do desenvolvimento do mouse. 12 estas populações são frequentemente examinadas através de uma combinação de microscopia campo amplo, que fornece informações de nível de tecido e seccionamento serial com ensaios de imunofluorescência, que oferece alta resolução celular mas só informações espaciais bidimensionais. 13 assim, enquanto estes estudos avançaram grandemente a nossa compreensão do desenvolvimento do coração, os métodos disponíveis têm limitado na análise quantitativa de profundidade da morfogênese durante esses estágios, criando a necessidade de abordagens examinar o organização dessas populações a nível de todo o organismo.

Os recentes avanços em microscopia confocal e análise de imagem 3D permitem reconstruções algorítmicas de alta resolução e elevado-produção de células e estruturas em situ com relativa facilidade, assim, abrindo o caminho para estudos detalhados do complexo estruturas celulares. 14 com o aumento do poder computacional e o desenvolvimento de algoritmos gerenciamento de grande volume de dados, ambas necessárias para lidar com o aumento exponencial do tamanho da imagem latente conjuntos de dados, análises podem agora ser totalmente automatizadas. 15 análise automatizada de conjuntos de dados de imagem tem a vantagem de ser imparcial, mas só é tão confiável quanto a qualidade do conjunto de dados entrada; é imperativo, então, que as práticas recomendadas são usadas durante a aquisição e pré-processamento de imagem para garantir a mais alta qualidade, a análise imparcial. 16 protocolos podem ser completamente automatizado e compartilhado para reprodutibilidade, e os algoritmos usados pelo software proprietário estão prontamente disponíveis através de bibliotecas para ser usado por cientistas que têm familiaridade com moderna proprietárias ou open source ferramentas de desenvolvedor. 17

O protocolo a seguir explica os passos necessários para executar tal análise em um modelo bem definido da organogênese, a formação do crescente cardíaca durante o desenvolvimento do coração. Especificamente, este protocolo descreve como (1) colheita e dissecar embriões estágio crescente cardíaca, (2) executar toda montagem imunofluorescência para referência (Nkx2-5) e experimental (Foxa2Cre:YFP18,19) marcadores, (3) Prepare-se e os embriões utilizando microscopia confocal, de imagem e, finalmente, (4) analisar e quantificar as imagens resultantes usando abordagens avançadas tridimensionais. Enquanto o crescente cardíaco é usado como um exemplo aqui, com modificações apropriadas, este protocolo pode ser utilizado para análise de várias linhagens em gástrula de embriões adiantados do palco somite.

Protocol

todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso na escola de medicina Icahn no Monte Sinai e institucional Cuidado Animal. 1. colheita e processamento de embriões de palco de crescente cardíaca Mate um rato fêmea fértil com um macho garanhão fértil. Verificar a presença de uma cópula vaginal plug usando uma sonda sem corte ou fórceps. Meio-dia o dia da deteção do plug é considerada embrionária dia (E) 0,5 (ver figura…

Representative Results

A qualidade dos dados finais e análise depende grandemente (1) a integridade e a morfologia dos embriões dissecados, (2) a utilização de anticorpos de alta especificidade e (3) a instalação adequada dos parâmetros de imagem. Os embriões danificados vão confundir o processo de geração de superfície e dificultam a análise quantitativa. Exemplos de embriões devidamente dissecados e encenados são mostrados na Figura 2B. Os embriões podem ser ainda…

Discussion

O protocolo acima descreve uma estratégia para a obtenção de dados quantitativos de imagens de alta qualidade toda montagem imunofluorescência de embriões do rato após a implantação. Quando realizado corretamente, os dados volumétricos 3D gerados através desses passos podem ser usados para a análise comparativa e interseccional de vários domínios dentro do embrião. O sinal de superfície mascarando a abordagem descrita é de uso particular na investigação de populações de células romance em comparaçã…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo NIH/NHLBI R56 HL128646 e Mindich criança saúde e Instituto de desenvolvimento (MCHDI) em ISMMS (para N.D.). E.B. é suportado por um NIH/NIDCR estágio T32 HD075735. Microscopia e análise de imagem, realizou-se no núcleo microscopia o Icahn School of Medicine, no Monte Sinai, que é suportado em parte pelo Instituto do câncer Tisch no Mount Sinai P30 CA196521 – câncer centro de concessão de apoio.

Materials

Blunt probe Roboz RS-9580
Forceps Roboz RS-8100
Fine forceps Roboz RS-5015
Dissection scissors Roboz RS-5912
Saponin Sigma Aldrich 84510
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A8022
Triton RPI A4490
Goat anti-Nkx2-5 Santa Cruz Biotech sc-8697 Used at 1:100-1:500
Chicken anti-GFP abcam ab13970 Used at 1:500
Rabbit anti-Islet1 abcam ab109517 Used at 1:100
Rabbit anti-Hcn4 Millipore AB5808 Used at 1:100
488 anti-chicken Jackson Immunoresearch 703-546-155 Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
555 anti-goat Thermo Fisher Scientific A21432 Used at 1:500
647 anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-606-152 Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
DAPI Sigma Aldrich D9542
n-Propyl gallate Sigma Aldrich 2370 Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution.
Superfrost Plus microscopy slides VWR Scientific 48311-703
22×22 mm coverslips VWR Scientific 48366-227
Imaris 8.4.1 Bitplane

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Bardot, E., Tzavaras, N., Benson, D. L., Dubois, N. C. Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (128), e56446, doi:10.3791/56446 (2017).

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