Här beskriver vi ett protokoll för hela berget immunofluorescens och image-baserad kvantitativ volymetrisk analys av tidiga skede musembryon. Vi presenterar denna teknik som en kraftfull metod att kvalitativt och kvantitativt bedöma hjärt strukturer under utveckling, och föreslår att det kan vara allmänt anpassas till andra organsystem.
Användning av någonsin framåt avbildningstekniker har bidragit i stort sett till vår ökad förståelse av embryonal utveckling. Pre-implantation utveckling och organogenesen är två områden av forskning som kraftigt har gynnats av dessa framsteg, på grund av den höga kvaliteten på data som kan erhållas direkt från imaging pre-implantation embryon eller ex vivo organ. Medan pre-implantation embryon har gett data med särskilt hög rumslig upplösning, varit senare skeden mindre mottaglig för tredimensionell rekonstruktion. Få högkvalitativa 3D eller volymetrisk data för kända embryonala strukturer i kombination med öde mappning eller genetiska härstamning spårning kommer att möjliggöra en mer omfattande analys av morphogenetic evenemang som äger rum under embryogenes.
Det här protokollet beskriver en helhet-mount immunofluorescens strategi som möjliggör för märkning, visualisering och kvantifiering av progenitor cellpopulationer inom den utveckla hjärt crescent, en nyckel struktur bildas under hjärtat utveckling. Metoden är utformad på ett sådant sätt att både cell – och vävnad-nivå information kan erhållas. Använda konfokalmikroskopi och bildbehandling, möjliggör detta protokoll tredimensionella rumsliga återuppbyggnad av hjärt crescent, vilket ger möjlighet att analysera för lokalisering och organisationen av specifika stamceller populationer under denna kritiska fas av hjärtat utveckling. Ännu viktigare, tillåter användning av referens antikroppar successiva maskering av hjärt crescent och efterföljande kvantitativa mätningar av områden inom månskäran. Detta protokoll kommer inte bara aktivera en detaljerad granskning av tidig hjärtat utveckling, men med anpassningar bör vara tillämplig på de flesta organsystem i gastrula till tidig somite arrangerar mus embryo.
Studien av organogenesen har länge förlitat sig på observation av morphogenetic händelser i det växande embryot. Dessa studier är ofta beroende av användning av fluorescerande färgämnen eller lineage tracing reportrar i kombination med märkning av definierade referens populationer. 1 genom att jämföra den relativa positionen av dessa etiketter, information kan utläsa på ursprung, rörelse eller ultimate bidrag i en population av intresse. Transplantation och öde mappning experiment kan du använda antingen morfologiska sevärdheter eller injektion av färgämnen i icke-rörliga härstamningar för att definiera utgångspunkten för celler i intresse, som undersöks sedan för bidrag till utvecklade embryot. 2 , 3 , 4 , 5 genetiska härstamning-tracing experiment använda samma koncept med väldefinierade reporter alleler som används till label cellpopulationer utan experimentella manipulation. Nyckeln till dessa synsätt är förmågan att avgöra, med hög rumslig upplösning, platser av den experimentella och referens etiketter. Dessa metoder har gett enastående framsteg i pre-implantation utveckling och explant organogenesen studier. 6 , 7 , 8 , 9
De utvecklingsmässiga händelser som ligger bakom hjärtat morfogenes har beskrivits allt väl under de senaste åren. 10 en av de stora upptäckterna inom detta forskningsområde är beskrivningen av ett antal stamceller populationer som kan särskiljas genom uttryck av unika markörer. 11 dessa populationer inkluderar den första och andra hjärtat fält (FHF och SHF), som finns inom hjärt månskäran på främre sidan av embryot på embryonala dag (E) 8,25 mus utveckling. 12 dessa populationer undersöks ofta genom en kombination av wide-fältet mikroskopi, som ger vävnad-nivå information, och seriell sektionering med immunofluorescens-analyser, som erbjuder hög cellulära upplösning men bara tvådimensionell rumslig information. 13 således, medan dessa studier har kraftigt avancerade vår förståelse av hjärtat utveckling, tillgängliga metoder har begränsat i djup kvantitativ analys av morfogenes under dessa stadier, skapar behovet av metoder för att undersöka den organisationen av dessa populationer på hel-organismen nivå.
Den senaste tidens framsteg inom både konfokalmikroskopi och 3D-bildanalys möjliggör hög upplösning och hög genomströmning algoritmisk rekonstruktioner av celler och strukturer i situ med relativ lätthet, därigenom bereda väg för detaljerade studier av komplexa cellulära strukturer. 14 med ökningen av datorkraft och utveckling av stordata verkställande algoritmer, båda behövs för att hantera den exponentiella ökningen av storleken på imaging data-set, analyser kan nu vara fullständigt automatiserad. 15 automatiserad analys av imaging data-set har fördelen att vara opartisk, men det är bara lika tillförlitliga som kvaliteten på de ingående datamängden. sedan, är det nödvändigt att bästa praxis används under förvärv och före bildbehandling för att säkerställa högsta kvalitet, objektiv analys. 16 protokoll kan vara helt automatiserad och delade för reproducerbarhet och de algoritmer som används av proprietär programvara är lätt tillgängliga via bibliotek som ska användas av forskare som har förtrogenhet med moderna egna eller öppen källkod utvecklarverktyg. 17
Följande protokoll förklarar de åtgärder som krävs för att utföra en sådan analys på en väl definierad modell för organogenes, bildandet av hjärt crescent under hjärtat utveckling. Närmare bestämt det här protokollet beskriver hur (1) skörden och dissekera hjärt crescent scenen embryon, (2) utföra hela mount immunofluorescens för referens (Nkx2-5) och experimentell (Foxa2Cre:YFP18,19) markörer, (3) förbereda och bild de embryon som använder konfokalmikroskopi, och slutligen (4) analysera och kvantifiera de resulterande bilderna med hjälp av avancerade tredimensionella metoder. Medan den kardiella halvmånen används som exempel här, med lämpliga ändringar, kan detta protokoll användas för analys av flera utvecklingslinjer i gastrula tidig somite arrangerar embryon.
Protokollet ovan beskriver en strategi för att erhålla kvantitativa uppgifter från hela mount immunofluorescens-bilder av hög kvalitet av konceptionsfrekvens musembryon. När de utförs korrekt, kan den 3D volymetriska data som genereras via dessa steg användas för jämförande och intersektionell analys av flera domäner i embryot. Yta signalen maskering tillvägagångssätt som beskrivs är av särskild användning när du undersöker roman cellpopulationer jämfört med väletablerade referens strukturer.
<p…The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av NIH/NHLBI R56 HL128646 och Mindich barns hälsa och utveckling Institute (MCHDI) på ISMMS (till N.D.). E.B. stöds av en NIH/NIDCR praktik T32 HD075735. Mikroskopi och bildanalys utfördes vid mikroskopi kärnan vid Icahn School of Medicine vid berget Sinai, som stöds delvis av Tisch Cancer Institute vid Mount Sinai P30 CA196521 – Cancer Center Support Grant.
Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
Forceps | Roboz | RS-8100 | |
Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
Triton | RPI | A4490 | |
Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
Imaris 8.4.1 | Bitplane |