Il s’agit d’un protocole pour l’étude des interactions protéine-protéine intracellulaire basées sur le système de menu déroulant biotine-avidine avec la nouveauté de la combinaison de séquences de pénétration cellulaire. Le principal avantage est que la séquence cible est incubée avec les cellules vivantes au lieu de lysats cellulaires et par conséquent les interactions auront lieu dans le contexte cellulaire.
Nous présentons ici un protocole pour l’étude des interactions protéine-protéine intracellulaire qui est basé sur le système de menu déroulant biotine-avidine largement utilisé. La modification présentée comprend la combinaison de cette technique avec des séquences de pénétration cellulaire. Nous vous proposons de concevoir des appâts de pénétration cellulaire qui peuvent être incubées avec des cellules vivantes au lieu de lysats cellulaires et donc les interactions trouvées reflètent celles qui se produisent au niveau intracellulaire. Connexin43 (Cx43), une protéine qui forme des canaux de jonction gap et hémicanaux est diminuées dans les gliomes de haut grade. La région de Cx43 comprenant les acides aminés 266-283 est responsable de l’inhibition de l’activité oncogénique de c-Src dans les cellules de gliome. Ici, nous utilisons TAT comme la séquence de pénétration cellulaire, de la biotine comme la balise menu déroulant et dans la région de Cx43 comprise entre acides aminés 266-283 comme cible pour trouver des interactions intracellulaires dans les cellules de tige de dur-à-transfecter un gliome humain. Une des limites de la méthode proposée est que la molécule utilisée comme appât pourrait ne pas plier correctement et, par conséquent, les interactions trouvées pas peut-être associées avec l’effet. Cependant, cette méthode peut être particulièrement intéressante pour les interactions impliquées dans les voies de transduction de signal, parce qu’elles sont habituellement effectuées par régions intrinsèquement désordonnées et, par conséquent, ils ne nécessitent pas un pliage ordonnée. En outre, l’un des avantages de la méthode proposée est que la pertinence de chaque résidu sur l’interaction peut être facilement étudiée. Il s’agit d’un système modulaire ; par conséquent, les autres séquences de pénétration cellulaire, autres balises et autres cibles intracellulaires peuvent être employées. Enfin, le champ d’application du présent protocole dépasse de loin l’interaction protéine-protéine parce que ce système peut être appliqué aux autres cargaisons bioactifs tels que RNA séquences, nanoparticules, virus ou n’importe quelle molécule qui peut être transduite avec séquences de pénétration cellulaire et fondue aux balises de liste déroulante afin d’étudier leur mécanisme intracellulaire d’action.
Interactions protéines-protéines sont essentielles pour une grande variété de processus cellulaires. Pour bien comprendre ces processus, les méthodes d’identification des interactions de protéine dans l’environnement complexe intracellulaire sont nécessaires. Une des méthodes plus utilisées pour identifier les partenaires d’interaction d’une protéine est d’utiliser cette protéine ou un peptide mimétique d’une partie de cette protéine comme appât dans des expériences de menu déroulant affinité suivies par détection de protéines de liaison. Le système avidine-biotine est fréquemment utilisé en raison de la forte affinité, la spécificité et l’interaction stable entre l’avidine et biotine1,2. Habituellement, biotine est lié par covalence à l’appât (protéique ou peptidique) et après une période d’incubation avec des lysats de cellules pour permettre la mise en place des interactions, l’appât biotinylé lié à ses partenaires intracellulaires est tiré vers le bas avec l’avidine ou avidine dérivés conjugués avec des perles de soutien. Puis, interactions protéine-appâts sont détectées après lavage, élution et l’analyse par électrophorèse suivie par Western blot en présence. Un des problèmes de cette technique est que les interactions entre la protéine d’intérêt et ses partenaires intracellulaires se déroulent en dehors du contexte cellulaire. Ceci est particulièrement important pour les interactions impliquées dans les voies de transduction de signal parce qu’elles ont lieu dans des endroits intracellulaires spécifiques, ils sont transitoires et elles sont généralement effectuées par les protéines pas abondantes. Par conséquent, dans les lysats cellulaires ces interactions peuvent être masquées par d’autres protéines plus abondantes ou par des protéines qui ne sont généralement pas à proximité.
Peptides de pénétration cellulaire (CPPs) sont des peptides courts (≤40 aminoacides), composés principalement par des acides aminés cationiques qui sont capables de transporter une large gamme de molécules dans presque n’importe quelle cellule3. Des marchandises comme les protéines, l’ADN plasmidique, siRNA, virus, agents d’imagerie et nanoparticules divers ont été conjugués à PPC et efficacement intériorisée4,5. En raison de cette capacité de transport, ils sont également connu sous le nom domaines protéiques de transduction (DTP), séquences de translocation de la membrane (MTSs) et des peptides de Trojan. Entre le PPC, le TAT peptide de la protéine de transactivateur VIH TAT6 a été l’un du plus largement étudié 7,8,9. TAT est un nonapeptide contenant 6 arginine et 2 résidus de lysine et est par conséquent très cationiques. Études de substitution ont démontré que la charge positive nette de TAT est nécessaire pour les interactions électrostatiques avec les membranes plasmiques des cellules eucaryotes et son internalisation subséquente de10. De la même façon aux autres PPC, TAT chargé positivement fortement lie électrostatiquement aux divers charge négative espèces présentes à la surface extracellulaire des membranes cellulaires, y compris les groupes de tête de lipides, de glycoprotéines et de protéoglycanes3 , 10. bioactifs cargaisons transportées par TAT deviennent immédiatement libres dans le cytosol pour rejoindre leurs partenaires intracellulaires.
Nous présentons ici une méthode qui combine le CPP TAT avec de la biotine pour étudier les interactions intracellulaires. Le but est de concevoir des appâts de pénétration cellulaire en fusionnant la biomolécule cible de TAT et de biotine. Le principal avantage de cette proposition est que les interactions entre l’hameçon et ses partenaires aura lieu dans son contexte cellulaire. Pour montrer l’efficacité de cette méthode, nous avons utilisé comme appât une petite séquence de la protéine Cx43 qui a été rapporté d’interagir dans les cellules avec le proto-oncogène c-Src11,12,13. Cx43 est une protéine intégrale de membrane qui est largement exprimée dans les astrocytes14et diminuées dans les gliomes de haut grade, une tumeur maligne la plus courante du système nerveux central15,16,17 ,,18. Il a été précédemment montré que la région de Cx43 qui interagit avec c-Src (acides aminés 266-283 dans Cx43 humaine ; PubMed : P17302) fondu à TAT (TAT-Cx43266-283) inhibe l’activité oncogénique des cellules de gliome de c-Srcin et les cellules souches de gliomes (CSS)19,20,21. Pour concevoir l’appât intracellulaire, Cx43266-283 a été fusionnée à TAT à l’extrémité N-terminale (TAT-Cx43266-283) et à la biotine à l’extrémité C-terminale (TAT-Cx43266-283– B). Cette stratégie a été utilisée avec succès dans les gliomes de rat lignée cellulaire C6 pour identifier c-Src, c-terminal kinase Src (CSK) et la phosphatase et tensine homologue (PTEN) en tant que partenaires intracellulaires de cette région de Cx4320. Nous décrivons ici, cette méthode d’évaluation de son efficacité dans humaines CSS, qui sont très pertinentes pour le traitement des gliomes, mais beaucoup plus difficile à transfecter que les cellules souches non gliome.
Il existe de nombreuses méthodes pour étudier les interactions protéine-protéine. La méthode présentée dans cette étude est basée sur le système de menu déroulant biotine-avidine largement utilisé dans lequel un appât biotinylé est incubé avec des lysats de cellules pour permettre la mise en place des interactions. Les modifications présentées dans cette étude comprennent la combinaison de cette technique avec des séquences de pénétration cellulaire. Nous vous proposons de concevoir des appâts de pénétration cellulaire qui peuvent être incubées avec des cellules vivantes au lieu de lysats cellulaires et par conséquent les interactions trouvées reflétera ceux qui ont eu lieu dans le contexte cellulaire.
Ici, nous utilisons TAT comme la séquence de pénétration cellulaire, de la biotine comme la balise menu déroulant et dans la région de Cx43 comprise entre acides aminés 266-283 comme cible pour trouver des interactions intracellulaires dans CSS humaines. La base structurale de l’interaction entre Cx43 et c-Src est bien connu11,12. Il s’agit d’une interaction importante car elle inhibe l’activité oncogénique du c-Src dans les cellules de gliome24,13. En fait, la CPPs contenant cette région (TAT-Cx43266-283) imitent les propriétés antioncogenic de Cx43 sur cellules de gliome19,20,21. Dans les cellules de rats gliome C6, le mécanisme par lequel le TAT-Cx43266-283 inhibe c-Src comprend le recrutement de c-Src, ainsi que ses inhibiteurs endogènes CSK et PTEN20. Il convient de mentionner que les CGV est très intéressants comme une cible dans le traitement des gliomes, parce qu’elles constituent une sous-population qui résiste aux traitements conventionnels et par conséquent responsable de la réapparition de cette de tumeurs cérébrales malignes27. En outre, ils sont durs à transfecter de cellules et par conséquent, l’étude des interactions intracellulaires devienne plus difficile. CPPs sont internalisées rapidement et efficacement dans la CSS19 favorisant leur utilisation pour l’étude des interactions intracellulaires. Dans cette étude, à l’aide de CPPs fusionnées à la biotine, nous confirmons l’interaction de la séquence de266-283 Cx43 avec c-Src, ainsi que ses inhibiteurs endogènes CSK et PTEN dans CSS humaines.
Cette méthode est très puissante pour étudier le mécanisme intracellulaire de composés bioactifs. Toutefois, il est très important de confirmer que l’effet biologique de l’appât de pénétration cellulaire biotinylé n’est pas différent de celui obtenu avec la non-biotinylé un. Cette étape est requise pour associer les interactions trouvées l’effet des composés bioactifs. En outre, la stabilité de l’enceinte, sa possible dégradation par des protéases ainsi que sa possible toxicité, devrait être soigneusement testée et prise en compte avant l’expérience de la planification. Dans l’exemple présenté, l’effet antiproliférative de TAT-Cx43266-283 sur G166 CSS humaines a été précédemment documenté20. Dans cette étude, nous confirmons que l’effet anti-proliferative de TAT-Cx43266-283– B et du TAT-Cx43266-283 est très similaire. En outre, l’analyse de la morphologie cellulaire a révélé que la α-tubuline et distribution F-actine est très similaire au CSS G166 traités avec TAT-Cx43266-283– B ou avec TAT-Cx43266-283. Au total, ces résultats indiquent que l’inclusion de la biotine à l’extrémité c-terminale de TAT-Cx43266-283 n’a pas modifié les effets de ce composé sur CSS humaines. Toutefois, si biotine modifierait les effets de la molécule bioactive, autres balises pour la purification de la protéine peuvent être testés, comme le drapeau octapeptide (DYKDDDDK)28, la balise grippe humaine dérivée de hémagglutinine HA (YPYDVPDYA) ou le glutathion S-transférase (GST)29. De même, si TAT ne vise pas la population de cellules d’intérêt, autre cellulaire des séquences pénétrantes, telles que pénétratine, MPG (pour une revue, voir30) ou des séquences spécifiques de cellules peuvent être utilisé31.
En plus de l’étude des protéines qui interagissent spécifiquement avec la séquence cible, idéalement, la présence de protéines qui n’interagissent pas avec eux, en tant que témoins positifs et négatifs et les protéines qui interagissent avec le contrôle et de la séquence cible doit être adressée. En ce sens, nous avons trouvé Cav-1 dans le contrôle et traités situation, suggérant que les cavéoles ont été impliqués dans le mécanisme de l’internalisation, comme il a été démontré précédemment26. En outre, FAK, qui interagit avec c-Src, mais est censé ne pas pour interagir avec le c-terminal Cx43, était absent dans le contrôle et la situation traitée. Ces résultats renforcent la spécificité de l’interaction entre TAT-Cx43266-283– B, c-Src, CSK et PTEN. Pour confirmer les résultats obtenus avec ce protocole, la microscopie confocale permet de visualiser la répartition des protéines qui interagissent et d’étudier leur co-localisation. Ainsi, nous avons trouvé TAT-Cx43266-283– B et c-Src la pièce une distribution intracellulaire similaire avec quelques pointes de co-localisation confirmant les résultats obtenue avec les expériences de la liste déroulante. En fait, TAT-Cx43266-283– B est distribué à proximité de la membrane plasmique, suggérant que la cargaison, dans cette étude Cx43266-283, dirige la molécule à ses partenaires intracellulaires.
Une des limites de la méthode proposée est que la molécule utilisé comme appât pourrait ne pas plier correctement et les effets attendus ne seraient pas trouvées. Dans ce cas, les interactions trouvées ne saurait associées à l’effet. Cependant, cette méthode peut être particulièrement intéressante pour les interactions impliquées dans les voies de transduction de signal, parce qu’elles sont habituellement effectuées par régions intrinsèquement désordonnés32 et par conséquent, ils ne nécessitent pas un pliage ordonnée. En outre, l’un des avantages de la méthode proposée est que l’évolution temporelle de l’interaction peut être suivie, ce qui est particulièrement pertinent pour les interactions transitoires. En outre, la pertinence de chaque résidu sur l’interaction peut être facilement étudiée. En effet, il est possible d’étudier la pertinence des modifications post-traductionnelles sur les interactions protéine-protéine, par exemple, par la substitution de phosphomimetic de glutamate pour sérine ou thréonine. De même, la substitution de la sérine ou la thréonine pour alanine ou tyrosine pour la phénylalanine permet de tester l’effet de la non-phosphorylable sérine, thréonine ou tyrosine.Pour imiter la phospho-tyrosine, la manière la plus précise est la substitution de Tyr pour p-Tyr33.
Enfin, le champ d’application du présent protocole dépasse de loin l’interaction protéine-protéine parce que ce système peut être appliqué aux autres cargaisons bioactifs tels que séquences RNA, de nanoparticules, de virus ou d’autres molécules qui peuvent être fusionnées à la biotine et transduites avec RPC pour étudier leur mécanisme intracellulaire d’action.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions M. Morales et J. Bravo pour leur aide à la conception du PPC et J.C. Arévalo pour son aide avec la liste déroulante protocole. Nous sommes reconnaissants pour l’assistance technique de T. del Rey. Ce travail a été soutenu par le Ministerio de Economía y Competitividad (Espagne) ; FEDER BFU2015-70040-R, Junta de Castilla y León (Espagne) ; SA026U16 FEDER et Fundación Ramon Areces. M. Jaraíz Rodríguez et A. González-Sánchez sont lauréats d’une bourse de la Junta de Castilla y León et le Fonds Social européen.
G166 GSC line | BioRep | ||
RHB-A stem cell medium | Takara | Y40001 | |
Laminin Mouse Protein | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 23017-015 | 10 µg/ml |
B-27 Serum free Supplement (50X) | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 17504-044 | 2% |
N-2 Supplement (100x) | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 17502-048 | 1% |
Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 20 ng/ml |
Recombinant Human b-FGF | Peprotech | AF-100-18B | 20 ng/ml |
PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4 | |||
Accutase | Sigma | A6964 | |
Cryostor CS10 cryopreservation medium | StemCell Technologies | 7930 | |
TAT | GenScript | – | Custom made |
TAT-B | GenScript | – | Custom made |
TAT-Cx43266-283 | GenScript | – | Custom made |
TAT-Cx43266-283-B | GenScript | – | Custom made |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | A1275737 | 1/20 |
Monoclonal α-tubulin mouse antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | 1/500 |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 1.25 mg/ml | |
Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose | ThermoFisher Scientific | 29200 | |
Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA | |||
Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free | Calbiochem, Bionova | 539134 | 1/100 (v/v) |
Sodium Fluoride | PanReac AppliChem | 141675 | 1 mM |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | 1 mM |
Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | 0.1 mM |
Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . | 1X | ||
Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | WR0100 | |
NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | WG1402box | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | NP0001 | 1X |
NuPAGE Transfer Buffer 20x | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | NP0006 | 1X |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | IB23001 | |
iBlot 2 Dry Blotting System – Gel transfer device | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water | Sigma | P7170 | |
FAK polyclonal rabbit antibody | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | AHO0502 | 1/500 |
Src polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 2108S | 1/500 |
Csk polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 4980 | 1/500 |
PTEN polyclonal mouse antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 9552 | 1/500 |
Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody | Abcam | ab2910 | 1/1000 |
Goat anti-mouse IgG-HRP antibody | Quimigen, Santa Cruz Biotechnology | Sc-2005 | 1/5000 |
Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody | Quimigen, Santa Cruz Biotechnology | SC-2030 | 1/5000 |
Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 | |
Src polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 2108S | 1/500 |
Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide | |||
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | A11029 | 1/1000 |
Cy2-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-220-089 | 1/500 |
MicroChemi Luminescence system | DNA Bio-Imaging Systems | ||
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | V13241 | 1/500 |
SlowFade Gold antifade reagent | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | S36936 | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) | Honeywell | 41641-1L | |
Appliskan 2001 | Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific |