Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Published: December 20, 2017 doi: 10.3791/56457
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCYL), Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca, 2Centre for Cancer Research & Cell Biology (CCRCB), School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University Belfast

Summary

זהו פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים המבוסס על מערכת נפתחים ביוטין-אבידין עם החידוש של שילוב רצפים חודר לתא. היתרון העיקרי הוא הרצף היעד מודגרת עם תאים חיים במקום תא lysates, ולכן האינטראקציות תתרחש בתוך ההקשר הסלולר.

Abstract

כאן אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים המבוססים על מערכת נפתחים ביוטין-אבידין בשימוש נרחב. השינוי הציג כוללת השילוב של טכניקה זו עם רצפי חודר לתא. אנו מציעים עיצוב פיתיונות חודר לתא יכול להיות מודגרות עם תאים חיים במקום תא lysates, ולכן האינטראקציות נמצאו ישקף אלה המתרחשות בתוך ההקשר תאיים. Connexin43 (Cx43), חלבון המהווה gap junction ערוצים ו- hemichannels הוא למטה מוסדר ב gliomas בדרגה גבוהה. האזור Cx43 הכוללת חומצות אמינו 266-283 אחראי על עיכוב הפעילות oncogenic של c-Src glioma תאים. כאן אנו משתמשים תאת. כמו רצף חודר לתא, ביוטין התג נפתחים, האזור של Cx43 מורכבת בין חומצות אמינו 266-283 היעד נמצא אינטראקציות תאיים תאי גזע glioma אנושי קשה-עד-transfect אחת המגבלות של השיטה המוצעת היא כי מולקולת לשמש פיתיון עלול לגרום לכשל לקפל כראוי, וכתוצאה מכך, האינטראקציות נמצאו אין אפשרות לשייך עם האפקט. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מעניין במיוחד עבור האינטראקציות מעורב האות התמרה חושית מסלולים כי הם מתבצעים בדרך כלל לפי אזורים המתוסבכים ממהותם, לכן, הם אינם דורשים של קיפול מסודרות. בנוסף, אחד היתרונות של השיטה המוצעת היא כי ניתן יהיה ללמוד בקלות הרלוונטיות של כל השאריות על האינטראקציה. זוהי מערכת מודולרית; לכן, רצפים אחרים חודר לתא תגים אחרים, מטרות תאיים אחרים יכול להיות מועסק. לבסוף, הטווח של פרוטוקול זה הוא הרבה מעבר אינטראקציית חלבון כי מערכת זו ניתן להחיל על מטענים ביואקטיביות אחרים כגון ה-RNA רצפים, חלקיקים, וירוסים או כל מולקולה זה יכול להיות transduced עם רצפי חודר תא ו התמזגו לתגים נפתחים ללמוד שלהם מנגנון פעולה תאיים.

Introduction

אינטראקציות חלבון-חלבון חיוניים עבור מגוון גדול של תהליכים תאיים. להבין תהליכים אלה, נדרשות שיטות לזיהוי אינטראקציות חלבון בתוך הסביבה תאיים מורכבים. באחת השיטות בשימוש כדי לזהות אינטראקציה עם שותפים של חלבון היא להשתמש את הפרוטאין או פפטיד מימטי של חלק את הפרוטאין כפיתיון בניסויים משיכה זיקה ואחריו זיהוי מחייב חלבונים. מערכת אבידין-ביוטין משמש לעתים קרובות בשל זיקה גבוהה, ירידה לפרטים יציב האינטראקציה בין אבידין ו ביוטין1,2. בדרך כלל, ביוטין מאוגד covalently הפיתיון (חלבון או פפטיד), לאחר תקופת דגירה עם lysates התא כדי לאפשר הקמת אינטראקציות, הפיתיון biotinylated מאוגדים לעמיתיו תאיים מורד אבידין או אבידין נגזרים מצומדת עם תמיכה חרוזים. לאחר מכן, פיתיון חלבונים מזוהים אחרי כביסה, • תנאי ו ניתוח מאת denaturing אלקטרופורזה ואחריו תספיג חלבון. אחת הבעיות של טכניקה זו היא כי האינטראקציות בין החלבון עניין ושותפיה תאיים מתקיימים מחוץ להקשר הסלולר. זה חשוב במיוחד עבור האינטראקציות מעורב האות התמרה חושית מסלולים כי הן מתרחשות במקומות תאיים ספציפיים, הם ארעיים, הם מתבצעים בדרך כלל על ידי חלבונים לא שופע. לכן, בתוך lysates תא אינטראקציות אלה יכול להיות רעולי פנים על-ידי אחרים חלבונים בשפע רב יותר או חלבונים אשר בדרך כלל אינם בסמיכות.

פפטידים חודר לתא (CPPs) הם קצרים פפטידים (חומצות אמינו ≤40), מורכב בעיקר על ידי חומצות אמינו cationic המסוגלים להעביר מגוון רחב של מולקולות אל תוך התא כמעט כל3. מטענים כגון חלבונים, דנ א פלסמיד, siRNA, וירוסים, סוכני דימות חלקיקים שונים יש כבר מצומדת CPPs, ביעילות למביטה4,5. בגלל יכולת קיבול זו הם הידוע גם חלבון התמרה חושית תחומים (PTDs), קרום רצפים translocating (MTSs) ופפטידים טרויאני. בקרב CPPs, פפטיד בלשכת המידע לתיירים של החלבון transactivator HIV TAT6 כבר אחת נרחב ביותר למד 7,8,9. TAT היא nonapeptide מכיל ארגינין 6, 2 ומשקעים ליזין, כתוצאה מכך הוא cationic מאוד. החלפת מחקרים הראו כי המטען החיובי נטו של תאת הכרחי עבור אלקטרוסטאטיות עם פלזמה הממברנות של התאים האיקריוטים ו שלה הפנמה עוקבות10. באופן דומה על CPPs אחרים, TAT מפרוטונים שמטענם חריפה נקשר electrostatically-אניון המינים השונים נוכח פני השטח חוץ-תאי של קרום התא, כולל קבוצות ראש השומנים, glycoproteins ו- proteoglycans3 , 10. מטעני ביואקטיביות לליברה TAT שיתפנה מיד ב ציטוזול להגיע זוגם תאיים.

כאן אנו מציגים שיטה המשלבת את CPP בלשכת המידע לתיירים עם ביוטין ללמוד אינטראקציות תאיים. המטרה היא לעצב פיתיונות חודר לתא על ידי מיזוג של biomolecule היעד TAT, ביוטין. היתרון העיקרי של הצעה זו היא כי האינטראקציות בין הפיתיון ושותפיה יתקיים בתוך ההקשר הסלולר שלה. כדי להציג את היעילות של שיטה זו השתמשנו כפיתיון רצף קטן של החלבון Cx43 שדווחו לתקשר intracellularly עם12,1311,c-Src proto-oncogene. Cx43 הוא חלבון ממברנלי אינטגרלי מתבטאת נרחב האסטרוציטים14והוא למטה מוסדר ב gliomas בדרגה גבוהה, גידול ממאיר הנפוצות ביותר מערכת העצבים המרכזית15,16,17 ,18. . זה היה בעבר הראו כי האזור Cx43 המקיים אינטראקציה עם c-Src (חומצות אמינו 266-283 Cx43 האנושי; Pubmed: P17302) התמזגו כדי תאת (TAT-Cx43266-283) מעכב את הפעילות oncogenic של תאים glioma c-Srcin ו glioma גזע תאים (GSCs)19,20,21. כדי לעצב את הפיתיון תאיים, Cx43266-283 יש כבר התמזגו טאט-קצה אמיני (TAT-Cx43266-283), ביוטין-קצה קרבוקסילי (TAT-Cx43266-283- B). אסטרטגיה זו כבר בהצלחה בשימוש של glioma עכברוש קו תא C6 לזהות c-Src, c-מסוף Src קינאז (צסק א) ופוספטאז, tensin homolog (PTEN) כשותפים תאיים של אזור זה של Cx4320. כאן, אנו מתארים שיטה זו בדיקות יעילותה GSCs האנושי, אשר מאוד רלוונטי לטיפול glioma אבל הרבה יותר transfect מאשר glioma הלא-גזע תאים.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני בוצעו על הכתב לאוניברסיטת סלמנקה לבחינה.

1. תאים

  1. יומיים לפני תחילת ההליך, צלחת התאים-צפיפות נדרש להיות confluent היום של הניסוי. צלחת התאים מבחנות או צלחות. עם זאת, החילוץ חלבון יהיה קל יותר של צלחות. זה נוח להכין לפחות ארבע פלטות של 78 ס מ2 או 2 בקבוקונים של 150 ס"מ2 לכל תנאי לכל ניסוי, כדי להיות בטוח כי התוצאות אינן עקביות.
  2. במחקר זה, צלחת GSCs G166 האנושי ב- 4 מבחנות של 150 ס מ2, תרבותי במדיום תאי גזע RHB-A בתוספת 2% B27, 1% N2, 20 ng/mL EGF ו b-FGF כפי שתואר על ידי פולארד et al.22. תהליך כאשר הנהרות הושג. למשל, כאשר 5 x 106 G166 תאים מצופים בבקבוקון2 150 ס מ, הם עובדו 2 ימים לאחר ציפוי.

2. Biotinylated CPPs

  1. לסובב את הבקבוקונים המכיל את biotinylated lyophilized CPPs (BCPPs) ב 8200 x g ב-30 s, כדי להימנע כמה האבקה שנותרה על המכסה. כוללות פקד BCPP כדי לוודא האינטראקציות נמצאו הספציפיים של הרצף היעד. במחקר זה, הפקד BCPP היה טאט-ביוטין (TAT-B), הטיפול BCPP טאט-Cx43266-283- בי פקדים אחרים יכול לשמש, כגון ערבות שברי מאוחה מקושקשות או מוטציה TAT ביוטין.
  2. להמיס את BCPPs במדיום תרבות המתאימים לפתרון מניות שציין היצרן; למשל, כדי להשיג פתרון מניות של 2 מ"ג/מ"ל BCPP לטיפול GSCs להוסיף 0.5 מיליליטר GSC תרבות בינוני בקבוקון אחד המכיל 1 מ ג של BCPP. מערבולת ולוודא פפטיד טוב התפרקה.

3. צינורות

הערה: להכין לפחות 12 1.5 mL צינורות לכל תנאי הנדרש בסעיף 7.

  1. סמן את צינורות הראשון 3 לכל תנאי. יהיה להם את הנפח הכולל של lysates הסלולר שהושג בשלב 6.4.
  2. סימון A 3 צינורות לכל תנאי. הצינורות האלה יש את supernatants הראשון שהושג לאחר lysing, ספינינג lysates הסלולר, צעד 7.2.
  3. סימון a B 3 צינורות לכל תנאי. צינורות אלה יהיו aliquot קטן של supernatants הראשון. Lysates אלה ישמש הדגימות תספיג בשלב 7.3.
  4. סמן סי 3 צינורות לכל תנאי. הצינורות האלה יש את supernatants שהושג לאחר נפתחים עם NeutrAvidin, שלב 7.7.
    הערה: זה חשוב במקרה תספיג הראה שאין אותות עבור חלבונים, כלומר החלבונים היו לא הוריד או אבדו בשלב כלשהו של ההליך. אם זה היה המצב, חזור על התהליך כדי להוריד את החלבונים.

4. הסלולר טיפול עם BCPPs

  1. האחות המדיום תרבות.
  2. החלף את האחסון המתאימים בינוני טריים נדרשים דגירה של BCPPs אפשרי בהיקף בינוני לפי הזמנים הדגירה הקטן ביותר. חשוב מאוד כי בכל מקרה, המדיום מכסה לחלוטין פני הבקבוק/הצלחת כך התאים לא יתייבש, למשל, 6 מ לכל 150 ס"מ2 עבור דגירה 30 דקות.
  3. הוסף את עוצמת הקול של הפתרון מניות של BCPP תרביות תאים כדי להגיע ריכוז זה הוכח כיעיל. בזה מחקר 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283- B הוכח כדי לצמצם את התפשטות GSC.
    1. לכן, הוספת 92.8 µL של 2 מ"ג/מ"ל טאט-Cx43266-283- B (MW = 3723.34 g/mol) לכל מיליליטר תרבות בינוני בריכוז הסופי של 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283- בי אם אמצעי האחסון שיתווספו שונה עבור פקד פפטידים, להשלים עם תרבות בינוני עד גמר באותו אמצעי אחסון. למשל, 49.1 µL טאט-B (MW = 1914.31 g/mol) ובנוסף 43.7 µL GSC בינוני נוספו לכל מיליליטר תרבות בינוני בריכוז הסופי של 50 מיקרומטר טאט-בי
  4. מקם את התאים בחממה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות לוודא מתקיימים יחסי גומלין של BCPP ושותפיה תאיים. אם האינטראקציה לוקח יותר זמן, דגירה משכי זמן ארוכים יותר או להתאים פעמים במקרה הניסוי כללה זמן-קורס. בנוסף, האינטראקציה עניין יכול להיות קידום או למניעה על ידי גירוי שונים תאיים איתות המסלולים.

5. מאגרי ופתרונות.

  1. להכין PBS pH 7.4: 136 מ"מ NaCl; 2.7 מ"מ אשלגן כלורי; 7.8 מ מ נה2HPO4·2H2O; 1.7 מ"מ ח'2PO4.
  2. להכין מאגר פירוק חלבון: 20 מ מ טריס-HCl (pH 8.0), 137 מ מ NaCl, 1% IGEPAL, לפני השימוש, להוסיף את הדברים הבאים: 1/100 (v/v) פרוטאז מעכב קוקטייל, 1 מ"מ נתרן פלואוריד, 1 מ Phenylmethanesulfonyl פלואוריד (PMSF), orthovanadate נתרן 0.1 מ מ.
  3. הכנת מאגר Laemmli: (4 x: מ' טריס-HCl 0.18 pH 6.8; 5 מ' גליצרול; מרחביות 3.7% (p/v); 0.6 מטר β-mercaptoethanol או 9 מ מ DTT; bromophenol 0.04% (v/v) כחול (BB)).

6. חלבון החילוץ

הערה: חלבון החילוץ בוצע כפי שתואר לעיל20,23. לבצע שכל האזור הזה של ההליך ב 4 º C.

  1. תשאף המדיום תרבות לחלוטין.
  2. שטיפת 3 x 10 מ עם פוספט כקרח buffered תמיסת מלח (PBS) לכל 150 ס"מ2 היטב כדי למנוע ניתוק התא.
  3. כדי להשיג את התא lysate, להוסיף 3 מ"ל של פירוק מאגר לכל 150 ס מ2 , ביסודיות לגרד את פני השטח באמצעות המגרד של התא. הטיית הצלחת/שתייה צידניות כדי כ-45 מעלות יקל לאסוף את lysates תא לתוך הצינורות המתאימים שלהם.
  4. יוצקים 1 מ"ל של הטלפון הסלולרי lysate למחזור שלושה צינורות 1.5 mL. צינורות אלה יסומנו עם התנאי, של שכפול כפי שמצוין בשלב 3.1.

7. נפתחים

  1. Centrifuge צינורות 1.5 mL ב 11,000 x g 10 דקות ב 4 º C.
  2. להעביר את supernatants צינורות חדשים (א).
  3. קח את aliquot של זו תגובת שיקוע לכל תנאי צינורות שונים (B), דהיינו 50 µL למחזור. להוסיף מאגר x Laemmli 4 (16.6 µL עבור 50 µL של lysate) ומקפיאים ב-20 ° C. Lysates אלה ישמש כרגיל תספיג דגימות.
  4. Homogenize היטב את NeutrAvidin Agarose על ידי טלטול עדין. חותכים את הקצוות של הקצוות פיפטה כדי להגדיל את הקוטר שלהם ולשפר את pipetting של החרוזים.
להוסיף 50 µL של NeutrAvidin Agarose לכל מיליליטר תא lysate את החצוצרות שלה (א).
  • דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם טלטול עדין מאוד כדי לאפשר NeutrAvidin לקיים אינטראקציה עם BCPPs קשור זוגם תאיים.
  • צנטריפוגה ב 3000 x g עבור 1 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את המתחם של NeutrAvidin עם חלבונים.
  • בזהירות להסיר את supernatants ומעבירים אותם אל צינורות נקיים (C). למנוע מהם להשתמש בהם במקרה נפתחים אינו מוצלח.
  • שטיפת מדרגות: להוסיף מאגר פירוק טריים כדורי (צינורות A), resuspend על-ידי היפוך, חזור על השלבים 7.6) ו- 7.7) עבור 5 פעמים יותר. כל supernatants האלה יכולים להיות מושלך.
  • להסיר את supernatants ומוסיפים 2 x Laemmli מאגר האחסון הסופי הרצוי (40 µL למחזור 1.5 mL עבור כדורי המתקבל 150 ס"מ2 בקבוקונים של תאים confluent).
  • Elute ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות מביצועם של אינטראקציות בין חלבונים צנטריפוגה ב-30 s ב x 8,200 g כדי הצניפה NeutrAvidin חרוזים.
  • קח את supernatants, המכיל את החלבונים dissociated, עם טיפים נימי צינורות חדשים (D). ניתן לשמור את החרוזים למקרה לחזור על השלבים • תנאי נדרש.
    הערה: supernatants (צינורות D) אתה מוכן להיות טעון ב תספיג או להקפיא ב-20 ° C.

    • 8. תספיג חלבון

    הערה: סופג המערבית בוצעה כפי שתואר לעיל24.

    1. לטעון את נפח המקבילה של כל מדגם לכל ליין ב- Bis-טריס (4-12%) midigels מערכת אלקטרופורזה Midi-Cell.
    2. חלבונים Transblot באמצעות מערכת blotting יבש לתוך ערימה ניטרוצלולוזה רגיל.
    3. כתם הקרום עם 10% צבע מאכל פונסו למשך 10 דקות.
    4. לשטוף את הקרומים 3 x 5 דקות עם 5 מ של TTBS.
    5. לחסום את הקרומים עם חלב 7% ב- TTBS עבור 1 h עם טלטול עדין צינורות או קופסאות קטנות. ודא שאמצעי האחסון המשמש מספיק כדי לכסות את הקרומים כי הם לא לייבש, כלומר 40 מ"ל לכל midi כל ממברנה.
    6. רחץ 3 x 5 דקות עם 5 מ של TTBS.
    7. דגירה בין לילה ב 4 ° C עם נוגדן ראשוני נגד החלבון עניין ברעידות עדין.
    8. רחץ 3 x 5 דקות עם 5 מ של TTBS.
    9. דגירה הקרום בטמפרטורת החדר עם כתב מצומדת peroxidase משני הנוגדן ב- TTBS לשעה.
    10. רחץ 3 x 5 דקות עם 5 מ של TTBS.
    11. לפתח עם מצע chemiluminescent במערכת chemiluminescence.

    9. ופתרון בעיות.

    1. אם לאחר פיתוח המערב למחוק כל הדגימות הראה שאין אותות בכלל עבור חלבונים, בדוק את צבע מאכל פונסו.
      הערה: הקרום, צבע מאכל פונסו צריך להראות לא מוגדר ונטענת להקות רבות לאורך המסלולים. אם הרצועות אינן מורגש מאוד, בכמות החלבונים טעון לא בטוח שיהיה מספיק או אולי נעלם העברה שגוי. שקול חוזר את תספיג חלבון.
    2. אם הכתם אין בכלל בתוך הקרומית צבע מאכל פונסו במסלול כלשהו, חזור על כל התהליך מהשלב 7.4 את החצוצרות שלה (C).
    3. אם לאחר לפתח את תספיג חלבון אות חלש מאוד, אך צבע מאכל פונסו הראה חלבונים, תקופת דגירה שוב הקרום עם נוגדן ראשוני של זמן רב יותר. אם האות עדיין די חלשה, דגירה שוב בטמפרטורת החדר.

    10. אחרים בשימוש בטכניקות במאמר זה

    1. Immunocytochemistry של BCPPs
      1. לתקן תאים paraformaldehyde 4% (0.2 מ"ל לכל ס מ2) במשך 20 דקות.
      2. רחץ 3 x 5 דקות עם PBS (0.2 מ"ל לכל ס מ2).
      3. להחיל את הנוגדן המתאים (לפחות 0.15 מ"ל לכל ס מ2) מדולל בפתרון נוגדן-ריכוז המצוין של היצרן נגד חלבון שלך עניין בן לילה ב 4 º C.
      4. דגירה עם fluorophore מצומדת משני נוגדנים (0.15 מ"ל לכל ס מ2) עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
      5. חזור על צעדים 10.1.2-10.1.4 עם אחרים נוגדנים נגד החלבונים את עניין. יש להיזהר שלא להשתמש מאותו זן שונה נוגדנים הראשי או fluorophores באותו אורך גל של נוגדנים משניים.
      6. הר התאים באמצעות הכימית antifade (0.005 מ"ל לכל ס מ2).
      7. לנתח על מיקרוסקופ פלורסצנטיות מחובר מצלמה דיגיטלית.
    2. MTT assay
      1. התרבות התאים ב- 37 מעלות צלזיוס. ובכן 24 צלחות.
      2. דגירה התאים בחושך למשך 75 דקות 0.15 מ של תרבות בינוני לכל ס מ2 המכילה 0.5 מ"ג/מ"ל MTT.
      3. האחות של המדיום, דגירה התאים 10 דקות בחושך עם דימתיל סולפוקסיד (0.25 mL לכל ס מ2) ברעידות מתון.
      4. למדוד את ספיגת באורך-גל של 570 nm באמצעות קורא microplate.

    Representative Results

    לפני השימוש BCPPs ללמוד אינטראקציה תאיים, חיוני כדי להשוות את ההשפעות של BCPP לעומת CPP כדי לאמת את התוצאות המתקבלות עם BCPP. כתוצאה מכך, ללמוד אם ההכללה של ביוטין משנה את הפעילות של הרצף היעד, תחילה ניתחנו את השפעת טאט-Cx43266-283- B לעומת טאט-Cx43266-283 -מורפולוגיה G166 GSCs. כדי לעשות זאת, ביצענו כמה ניתוחים immunofluorescence של שני חלבונים cytoskeletal, F-אקטין וα-טובולין לאחר 24 שעות של טיפול. איור 1 מראה כי G166 GSCs בנוכחות TAT-Cx43 50 מיקרומטר266-283 או בלשכת המידע לתיירים-Cx43266-283- B לרכוש צורה מעוגלת יותר בהשוואה מוארך ומורחבת prolongations הסלולר שמוצג הפקדים (TAT או בלשכת המידע לתיירים-B). למעשה, איור 1b מראה כי אקטין חוטים הם בעיקר התאספו כרשתות אקטין כאשר התאים שטופלו טאט-Cx43266-283 או בלשכת המידע לתיירים-Cx43266-283- B ואילו הם יוצרים עוד חבילות אקטין בתאים שליטה (שטופלו בלשכת המידע לתיירים או TAT-B)25. לעומת זאת, α-טובולין ההפצה אינה משתנה בין התנאים שונים. התוצאות הראו כי הנוכחות של ביוטין לא לשנות את ההשפעה של רצף המטרה על המורפולוגיה של G166 GSCs. ב20,הקודם מחקרים21, הראינו כי טאט-Cx43266-283 צמצם התפשטות G166 GSCs. במחקר זה, חקרנו אם טאט-Cx43266-283- B מפעילה אותם אפקטים בבית הגידול כמו TAT-Cx43266-283. כדי לעשות זאת, ניתחנו התפשטות G166 GSCs על ידי MTT assay לאחר 72 שעות של טיפול. וזמינותו MTT הוא ערכי צבע מוחלטים assay להערכת פעילות חילוף החומרים של התא. MTT עובר מטבוליזם על ידי אנזימים oxidoreductase NAD (P) H בתוך המיטוכונדריה המשקף את מספר התאים קיימא הנוכחי. איור 2 מציג כי הקטנת הכדאיות תא G166 GSCs אינה שונה באופן משמעותי כאשר תאים שטופלו 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283 או 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283- בי אכן, שניהם פחתה באופן משמעותי G166 GSCs התפשטות לעומת הפקד, TAT או בלשכת המידע לתיירים-בי

    ברגע לנו אישר כי ההשפעה של רצף המטרה שלנו ב G166 GSCs (TAT-Cx43266-283) לא שונה על ידי הכללת ביוטין-קצה קרבוקסילי (TAT-Cx43266-283- B), חקרנו השותפים תאיים של הרצף הזה בעקבות הפרוטוקול המתוארים במחקר זה (איור 3). כי caveolae היה מעורב המנגנון של תאת הפנמה26, ניתחנו את הנוכחות של caveolin-1 (קו-1) ב- pull-דאונס. תספיג חלבון ניתוח (איור 4) הראה את תאת-B ו- TAT-Cx43266-283- B אינטראקציה עם קו-1. עם זאת, היכולת של טאט-Cx43266-283- B לגייס c-Src, PTEN ו צסק א הוא חזק יותר מאשר עם TAT-בי מוקד אדהזיה קינאז (המשיכו) הוא מצע של c-Src זה לא הוכח לקיים אינטראקציה עם Cx43. אכן, המשיכו לא הראה כל אינטראקציה משמעותית עם TAT-B או בלשכת המידע לתיירים-Cx43266-283- בי

    כדי לאשר את האינטראקציה בין טאט-Cx43266-283- B ו- c-Src, G166 GSCs היו מודגרות עם 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283- B במשך 30 דקות ולוקליזציה שלהם היה ואחריו עם פלורסנט streptavidin קונפוקלית (איור 5 ). התוצאות שלנו הראה כי ההתפלגות תאיים של טאט-Cx43266-283- B נמצא קרום פלזמה (מוצג על-ידי phosphatidylserine מכתים), תואמת של c-Src. למעשה, ניתוח ושיתוף לוקליזציה חשף כמה נקודות של שיתוף לוקליזציה (לבן) בין טאט-Cx43266-283- B ו- c-Src בתמונה מיזוג. כתוצאה מכך, מיקרוסקופיה קונפוקלית מחקרים מאשרים את התוצאות שהושגו עם פרוטוקול נפתחים BCPP המתוארים במחקר זה.

    Figure 1
    איור 1: ההשפעה של BCPP ו- CPP-GSC מורפולוגיה.
    G166 GSCs מצופים-צפיפות נמוכה (2 x 104 תאים / ס מ2) לאחר 24 שעות הם היו מתפשט באמצעות מיקרומטר 50 שליטה CPP (TAT), לשלוט BCPP (TAT-B), טיפול CPP (TAT-Cx43266-283) או טיפול BCPP (TAT-Cx43266-283- B) . a) F-אקטין (אדום), α-טובולין (ירוק), ממוזג + דאפי immunostaining של השדה באותו מראה מורפולוגיה G166 GSCs. ברים = 50 מיקרומטר. b) F-אקטין immunostaining מציג את חלוקה שונה של F-אקטין ב- G166 GSCs לאחר דגירה במשך 24 שעות ביממה עם 50 מיקרומטר לשלוט CPP (TAT) או לשלוט BCPP (TAT-B) לעומת טיפול 50 מיקרומטר CPP (TAT-Cx43266-283) או BCPP (TAT-Cx43 266-283-B). הסורגים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 2
    איור 2: ההשפעה של BCPP ו- CPP-GSC הכדאיות.
    G166 GSCs היו מצופים-תאים/cm 55002 ב- 24-multiwell צלחות, מודגרות עם פפטידים שליטה מיקרומטר 50, CPP (TAT) או BCPP (TAT-B), או פפטידים לטיפול מיקרומטר 50, CPP (TAT-Cx43266-283) או BCPP (TAT-Cx43266-283- B). הכדאיות תא נותחו באמצעות assay MTT לאחר 72 h. התוצאות מבוטא MTT absorbances ויש s.e.m. זאת אומרת ± לפחות 3 ניסויים (+ + p˂0.01 לעומת שליטה. * * p˂0.01, * * * p˂0.001 vs בלשכת המידע לתיירים או בלשכת המידע לתיירים-B; חד-כיווני אנובה withTukey שלאחר מבחן). שימו לב כי אין הבדלים משמעותיים בין השפעת CPPs vs BCPPs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 3
    איור 3: פרוטוקול דיאגרמה.
    תיאור גרפי שלב אחר שלב של ההליך כמתואר בסעיף "פרוטוקול" מ הדגירה BCPPs עד BCPPs eluted וחלבונים שמעצבת שלהם היו obtained.1) דגירה התרבות תאים עם BCPPs על הריכוז הרצויה עבור הזמן הנדרש. 2) במהלך הדגירה, הם הפנימו את BCPPs, הם לקיים אינטראקציה עם שותפיהם תאיים. 3) לשטוף את התאים שלוש פעמים על הקרח עם PBS קר כקרח. 4) lyse התאים כדי לחלץ חלבונים. 5) העברת תא lysates צינורות.6) ספין-x 11000 g עבור 10 דקות ב 4 º C. 7) להעביר supernatants כדי צינורות חדשים (א) ושמור aliquot קטנים של lysates כדי התהליך כמו מערבי רגיל כתם דוגמאות צינור (B). 8) resuspend את החרוזים NeutrAvidin Agarose ולהוסיף 50 µL כל שפופרת באמצעות טיפ פיפטה לחתוך. 9) דגירה ברעידות בעדינות במשך 12 שעות ב 4 ° C כדי לאפשר את החרוזים agarose NeutrAvidin לקיים אינטראקציה עם BCPPs ובת זוגו. 10) ספין בשביל 1 דקות ב 3000 x g כדי הצניפה החרוזים עם biotinylated פיתיונות, חלבונים שמעצבת שלהם קשורות אליהם. 11) להעביר את supernatants אל צינורות חדשים (ג) ולשמור אותם לשימוש במקרה נפתחים צריך לחזור. 12) לשטוף בגדר חמש פעמים עם מאגר פירוק טריים, resuspend על-ידי היפוך, ספין בשביל 1 דקות ב 3000 x g וזורקים את תגובת שיקוע. 13) להסיר את כל תגובת שיקוע בקפידה. 14) להוסיף האחסון הרצוי של 4 x מאגר Laemmli, elute את החלבונים ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דק 15) ספין-x 8200 g עבור 30 s כדי הצניפה החרוזים. 16) להעביר את החלבונים eluted למצוא את תגובת שיקוע עם טיפים נימי צינורות חדשים (D). 17) להעמיס על ג'לים לניתוח תספיג חלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 4
    איור 4: לימוד של אינטראקציות תאיים של טאט-Cx43266-283- B ב- G166 GSCs על ידי נפתחים ואחריו תספיג חלבון.
    G166 GSCs היו מודגרות עם 50 מיקרומטר טאט-B או בלשכת המידע לתיירים-Cx43266-283- בי לאחר lysed את התאים היו 30 דקות ו TAT-B או טאט-Cx43266-283- B קשור זוגם תאיים משכו עם חרוזים NeutrAvidin. החלבונים eluted היו טעונים, נותחו על ידי תספיג ללמוד את רמות המשיכו, c-Src, צסק א, PTEN וקו-1. שים לב כי קו-1 אינטראקציה עם שני טאט-B ולתקשר טאט-Cx43266-283- B, c-Src, PTEN ו צסק א מעדיפים עם TAT-Cx43266-283- B ו המשיכו לא הראה אינטראקציה כלשהי עם TAT-B או בלשכת המידע לתיירים-Cx43266-283-B. בבקשה לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 5
    איור 5: אישור טאט-Cx43266-283- B תאיים האינטראקציות G166 GSCs על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
    G166 GSCs היו מודגרות עם 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283- בי לאחר 30 דקות, היו תאים קבוע, עיבוד כדי להתאים לשפה טאט-Cx43266-283- B עם Cy2-Streptavidin (ירוק), c-Src מאת immunofluorescence (אדום) ו- phosphatidylserine עם annexin V (כחול). שימו לב כמה נקודות של שיתוף לוקליזציה (לבן) בין טאט-Cx43266-283- B ו- c-Src קרוב קרום פלזמה של מיזוג תמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Discussion

    ישנן שיטות רבות ללמוד אינטראקציות חלבון חלבון. השיטה שהוצגו במחקר זה מבוסס על מערכת נפתחים ביוטין-אבידין בשימוש נרחב שבו מודגרת פיתיון biotinylated עם תא lysates כדי לאפשר הקמת אינטראקציות. השינוי הציגה מחקר זה כולל השילוב של טכניקה זו עם רצפי חודר לתא. אנו מציעים עיצוב פיתיונות חודר לתא יכול להיות מודגרות עם תאים חיים במקום תא lysates, ולכן האינטראקציות נמצאו ישקף אלו שהתרחשו בתוך ההקשר הסלולר.

    כאן נשתמש TAT כמו רצף חודר לתא, ביוטין התג נפתחים, האזור של Cx43 מורכבת בין חומצות אמינו 266-283 היעד נמצא אינטראקציות תאיים GSCs האנושית. הבסיס המבני של האינטראקציה בין Cx43 לבין c-Src הוא ידוע11,12. הסיבה לכך היא אינטראקציה חשוב זה מעכב את הפעילות oncogenic של c-Src glioma תאים24,13. למעשה, CPPs המכיל אזור זה (TAT-Cx43266-283) לחקות את המאפיינים antioncogenic של Cx43 על glioma תאים19,20,21. בתאים C6 glioma עכברוש, המנגנון שבאמצעותו טאט-Cx43266-283 מעכב c-Src כולל הגיוס של c-Src יחד עם מעכבי אנדוגני צסק א שלה PTEN20. יצוין, כי GSCs הם מאוד מעניין כמטרה בטיפול glioma, כי הם מהווים subpopulation עמידים לטיפולים קונבנציונליים, ולכן אחראי הישנות זה גידולים ממאירים במוח27. יתר על כן, הם תאים קשה-עד-transfect, ולכן חקר אינטראקציות תאיים הופך קשה יותר. CPPs הם במהירות וביעילות הפנימו GSCs19 להעדיף את השימוש בהם לצורך המחקר של אינטראקציות תאיים. זה לומדים, באמצעות CPPs דבוקה ביוטין נאשר את האינטראקציה של הרצף266-283 Cx43 עם c-Src יחד עם מעכבי אנדוגני שלה צסק א ו PTEN ב GSCs האנושית.

    שיטה זו היא רבת עוצמה כדי לחקור את המנגנון תאיים של תרכובות ביו. עם זאת, חשוב מאוד לוודא כי ההשפעה הביולוגית של הפיתיון חדירה של תאים biotinylated אינה שונה מזה שהושג עם הלא-biotinylated אחד. צעד זה נדרש כדי לשייך את האינטראקציות נמצאו עם האפקט של המתחם ביו. בנוסף, היציבות של המתחם, והשפלות שלו אפשרי על ידי פרוטאזות, כמו גם שלה רעילות אפשרי, צריך להיות בזהירות נבדקה והוכחה לקחת בחשבון לפני תכנון הניסוי. בדוגמה שהוצגו, כבר השפעת אנטי-proliferative טאט-Cx43266-283 על G166 GSCs האנושית תועדו בעבר20. במחקר זה, נוכל לאמת את זה אפקט אנטי-המקדימות של טאט-Cx43266-283- B של טאט-Cx43266-283 הוא מאוד דומה. בנוסף, ניתוח הנתונים הסלולרית מורפולוגיה של גילה את α-טובולין, התפלגות F-אקטין דומה מאוד GSCs G166 שטופלו טאט-Cx43266-283- B או עם קעקוע-Cx43266-283. בסך הכל, תוצאות אלה מצביעות על ההכללה של ביוטין-c-הסופית של טאט-Cx43266-283 לא לשנות את ההשפעות של מתחם זה על האדם GSCs. עם זאת, אם ביוטין לשנות את ההשפעות של המולקולה ביו, תגים נוספים לטיהור חלבון יכול להיבדק, כגון הדגל octapeptide (DYKDDDDK)28, שפעת אנושית נגזר hemagglutinin התג HA (YPYDVPDYA) או גלוטתיון S-טרנספראז (GST)29. באופן דומה, אם TAT כיעד האוכלוסייה תא עניין, השני תא רצפים חודר, כגון penetratin, MPG (לסקירה, ראה30) או רצפים ספציפיים התא יכול להיות בשימוש31.

    בנוסף חלבונים לימוד המקיימים אינטראקציה באופן ספציפי עם הרצף היעד, באופן אידיאלי, נוכחותם של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם הפקד והן היעד רצף וחלבונים המקיימים אינטראקציה לא איתם, כפקדי חיוביים ושליליים, צריך להיות התייחס. במובן זה, אנו נמצא קו-1 בפקד, התייחס למצב, רומז כי היה מעורב caveolae המנגנון של הפנמה, כמו בעבר הוכח26. יתר על כן, המשיכו, אשר מקיים אינטראקציה עם c-Src אבל אמורה לא להיות במגע עם c-הטרמינל Cx43, נעדר הן השליטה והן המצב שטופלו. תוצאות אלו מחזקות יחודיות של האינטראקציה בין טאט-Cx43266-283- B, c-Src, צסק א ו PTEN. כדי לאשר את התוצאות שהושגו עם פרוטוקול זה, מיקרוסקופיה קונפוקלית ניתן להמחיש את ההפצה של החלבונים שמעצבת וכדי ללמוד לוקליזציה משותפת שלהם. לפיכך, מצאנו טאט-Cx43266-283- B ו- c-Src שהתערוכה הזו התפלגות תאיים דומה עם כמה נקודות של שיתוף לוקליזציה המאשרת את התוצאות שהושגו עם הניסויים נפתחים. למעשה, TAT-Cx43266-283- B מופץ קרוב קרום פלזמה רומז כי המטען, במחקר זה Cx43266-283, מנחה את המולקולה לעמיתיו תאיים.

    אחת המגבלות של השיטה המוצעת היא כי המולקולה לשמש פיתיון עלול לגרום לכשל לקפל כמו שצריך ואת ההשפעות הצפויות לא יימצאו. במצב זה, האינטראקציות נמצאו אין אפשרות לשייך על אפקט. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מעניין במיוחד עבור האינטראקציות מעורב האות התמרה חושית מסלולים כי הם מתבצעים בדרך כלל על-ידי אזורים ממהותם המתוסבכים32 , ולכן הם אינם דורשים של קיפול מסודרות. בנוסף, אחד היתרונות של השיטה המוצעת היא כי מסלול הזמן של האינטראקציה ניתן בעקבות, אשר רלוונטי במיוחד עבור אינטראקציות ארעית. יתר על כן, הרלוונטיות של כל השאריות על האינטראקציה שניתן בקלות ללמוד. אכן, זה אפשרי ללמוד את הרלוונטיות של שינויים posttranslational על אינטראקציית חלבון-חלבון, למשל, על ידי החלפת phosphomimetic גלוטמט על סרין או תריאונין ברצף. באופן דומה, החלפה של סרין או תראונין עבור אלנין או טירוזין ל פנילאלנין מאפשר בדיקת ההשפעה של סרין phosphorylatable, תראונין או טירוזין.כדי לחקות פוספו-טירוזין, הדרך המדויקת ביותר היא ההחלפה של טיר עבור p-טיר33.

    לבסוף, הטווח של פרוטוקול זה הוא הרבה מעבר אינטראקציית חלבון כי מערכת זו ניתן להחיל על מטענים ביואקטיביות אחרים כגון ה-RNA רצפים, חלקיקים, וירוסים או מולקולות אחרות אשר יכול להיות דבוקה ביוטין, transduced עם CPP ללמוד מנגנון תאיים שלהם הפעולה.

    Disclosures

    המחברים אין לחשוף.

    Acknowledgments

    אנו מודים מ מוראלס ובראבו ג'יי על עזרתם עם העיצוב של CPPs, ג'יי Arévalo על עזרתו עם פרוטוקול נפתחים. . אנחנו אסירי תודה על הסיוע הטכני של טי del Rey. עבודה זו נתמכה על ידי y Ministerio de Economía Competitividad, ספרד; פדר BFU2015-70040-R, דה חונטה Castilla y לאון, ספרד; SA026U16 פדר, Fundación רמון Areces. מ Jaraíz-רודריגס א גונזלס-Sánchez מקבלי מלגת, דה חונטה Castilla y León ו הקרן החברתית האירופאית בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    G166 GSC line BioRep
    RHB-A stem cell medium Takara Y40001
    Laminin Mouse Protein Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 23017-015 10 µg/ml
    B-27 Serum free Supplement (50X) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17504-044 2%
    N-2 Supplement (100x) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17502-048 1%
    Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15 20 ng/ml
    Recombinant Human b-FGF Peprotech AF-100-18B 20 ng/ml
    PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4
    Accutase Sigma A6964
    Cryostor CS10 cryopreservation medium StemCell Technologies 7930
    TAT GenScript - Custom made
    TAT-B GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283 GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283-B GenScript - Custom made
    Alexa Fluor 594 Phalloidin Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A1275737 1/20
    Monoclonal α-tubulin mouse antibody Sigma-Aldrich T9026 1/500
    4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 1.25 mg/ml
    Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose ThermoFisher Scientific 29200
    Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA
    Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free Calbiochem, Bionova 539134 1/100 (v/v)
    Sodium Fluoride PanReac AppliChem 141675 1 mM
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 1 mM
    Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 0.1 mM
    Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . 1X
    Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System Life Technologies, ThermoFisher Scientific WR0100
    NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% Life Technologies, ThermoFisher Scientific WG1402box
    NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0001 1X
    NuPAGE Transfer Buffer 20x Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0006 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
    iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB23001
    iBlot 2 Dry Blotting System - Gel transfer device Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB21001
    10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water Sigma P7170
    FAK polyclonal rabbit antibody Life Technologies, ThermoFisher Scientific AHO0502 1/500
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Csk polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 4980 1/500
    PTEN polyclonal mouse antibody Cell Signalling (WERFEN) 9552 1/500
    Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody Abcam ab2910 1/1000
    Goat anti-mouse IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology Sc-2005 1/5000
    Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology SC-2030 1/5000
    Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotechnology SC-2048
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide
    Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A11029 1/1000
    Cy2-conjugated streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-220-089 1/500
    MicroChemi Luminescence system DNA Bio-Imaging Systems
    Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific V13241 1/500
    SlowFade Gold antifade reagent Life Technologies, ThermoFisher Scientific S36936
    Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma-Aldrich M2128
    Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) Honeywell 41641-1L
    Appliskan 2001 Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem J. 89, 599-609 (1963).
    2. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of avidin-biotin technology: literature survey. Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).
    3. Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules. J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).
    4. Ramsey, J. D., Flynn, N. H. Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells. Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).
    5. Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications. Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).
    6. Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).
    7. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).
    8. Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics. Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).
    9. Cuesto, G., et al. Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons. J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).
    10. Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. Arginine-rich cell-penetrating peptides. FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).
    11. Sorgen, P. L., et al. Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1. J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).
    12. Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication. J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).
    13. Tabernero, A., Gangoso, E., Jaraíz-Rodríguez, M., Medina, J. M. The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle. Neuroscience. 323, 183-194 (2016).
    14. Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions. Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).
    15. Shinoura, N., et al. Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy. J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).
    16. Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas. Glia. 33, 107-117 (2001).
    17. Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors. Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).
    18. Crespin, S., et al. Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights. Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).
    19. Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype. Cell Death & Disease. 5, (2014).
    20. Gonzalez-Sanchez, A., et al. Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes. Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).
    21. Jaraíz-Rodríguez, M., et al. A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK. Stem Cell Reports. , In press (2017).
    22. Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
    23. Yu, T., et al. In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA. J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).
    24. Herrero-Gonzalez, S., et al. Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells. Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).
    25. Cooper, G. M. The Cell: A Molecular Approach. , 2nd ed, Sinauer Associates. (2000).
    26. Fittipaldi, A., et al. Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins. J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).
    27. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).
    28. Hopp, T. P., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).
    29. Benard, V., Bokoch, G. M. Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods. Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).
    30. Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics. Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).
    31. Hu, Q., et al. Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel. Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).
    32. Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. Intrinsically disordered proteins: regulation and disease. Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).
    33. Anthis, N. J., et al. Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation. J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).

    Tags

    ביוכימיה גיליון 130 TAT ביוטין-אבידין חודר לתא פפטידים נפתחים Intracellular אינטראקציות אינטראקציות חלבון-חלבון תספיג חלבון
    חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Jaraíz-Rodríguez, M.,… More

    Jaraíz-Rodríguez, M., González-Sánchez, A., García-Vicente, L., Medina, J. M., Tabernero, A. Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (130), e56457, doi:10.3791/56457 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter