Dette er en protokol til at studere intracellulær protein-protein interaktioner baseret på biotin-begærlighed pull-down system med nyhed om at kombinere celle-gennemtrængende sekvenser. Den største fordel er, at målet sekvens er inkuberes med levende celler i stedet for cellelysater og derfor interaktioner vil opstå inden for den trådløse forbindelse.
Her præsenterer vi en protokol for at studere intracellulær protein-protein interaktioner, der er baseret på den udbredte biotin-begærlighed pull-down system. Ændringen forelægges omfatter kombinationen af denne teknik med celle-gennemtrængende sekvenser. Vi foreslår at designe celle-gennemtrængende lokkemad, der kan sættes i varmeskab med levende celler i stedet for cellelysater og derfor interaktioner fundet vil afspejle dem, der opstår i den intracellulære kontekst. Connexin43 (Cx43), et protein, der danner gap junction kanaler og hemichannels er nedreguleret i high-grade gliomer. Regionen Cx43 bestående af aminosyrer 266-283 er ansvarlig for hæmning af det muterede aktivitet af c-Src i gliom celler. Her bruger vi TAT som celle-gennemtrængende sekvens, biotin som pull-down tag og regionen i Cx43 består mellem aminosyrer 266-283 som mål at finde intracellulære interaktioner i de svære at transfect menneskelige gliom stamceller. En af begrænsningerne i den foreslåede metode er, at molekylet brugt som agn kunne undlade at folde ordentligt, og derfor, interaktioner findes ikke kunne være forbundet med virkningen. Men denne metode kan være særligt interessant for de interaktioner, der er involveret i signaltransduktionsveje fordi de normalt er som uløseligt uordnede regioner og, derfor, de ikke kræver en bestilt foldning. En af fordelene ved den foreslåede metode er desuden, at relevansen af hver rester på samspillet kan studeres nemt. Dette er et modulopbygget system; Derfor kan andre celle-gennemtrængende sekvenser, andre tags og andre intracellulære mål være ansat. Endelig, anvendelsesområdet for denne protokol er langt ud over protein-protein interaktion, fordi dette system kan anvendes til andre bioaktive laster såsom RNA sekvenser, nanopartikler, vira eller ethvert molekyle, der kan være transduced med celle-gennemtrængende sekvenser og smeltet til pull-down tags at studere deres intracellulære virkningsmekanisme.
Protein-protein interaktioner er afgørende for en lang række cellulære processer. Fuldt ud at forstå disse processer, er metoder til at identificere protein interaktioner i de komplekse intracellulære miljø påkrævet. En af de mest anvendte metoder til at identificere interaktion partnere et protein er at bruge dette protein eller en mimetiske peptid af en del af dette protein som agn i affinitet pull-down eksperimenter efterfulgt af påvisning af bindende proteiner. Avidin-biotin system bruges ofte på grund af høj affinitet, specificitet og stabil interaktion mellem begærlighed og biotin1,2. Normalt, biotin er kovalent bundet til agn (protein eller peptid) og efter en periode med inkubering med cellelysater at tillade oprettelsen af interaktioner, biotinylated agn bundet til sin intracellulære partnere er trukket med begærlighed eller begærlighed derivater konjugeret med støtte perler. Derefter, agn-protein interaktioner er opdaget efter vask, eluering og analyse af denatureringen elektroforese efterfulgt af vestlige skamplet. Et af problemerne med denne teknik er, at interaktioner mellem protein af interesse og dens intracellulære partnere finder sted uden for den trådløse forbindelse. Dette er især vigtigt for de interaktioner, der er involveret i signaltransduktionsveje fordi de finder sted i specifikke intracellulære steder, de er forbigående og de er typisk udført af ikke rigelige proteiner. Derfor, inden for cellelysater disse interaktioner kan være maskeret af andre mere rigelige proteiner eller af proteiner, der normalt ikke er tæt på.
Celle-gennemtrængende peptider (CPPs) er korte peptider (≤40 aminosyrer), sammensat primært af kationiske aminosyrer, der er i stand til at transportere en bred vifte af molekyler i næsten enhver celle3. Laster såsom proteiner, plasmid DNA, siRNA, vira, imaging agenter og forskellige nanopartikler har været konjugeret med CPPs og effektivt internaliseret4,5. På grund af denne transport af evne er de også kendt som protein transduktion domæner (PTDs), membran translocating sekvenser (MTSs) og Trojan peptider. Blandt CPPs studerede TAT peptid fra HIV transaktivatoren protein TAT6 har været en af de mest udbredte 7,8,9. TAT er en nonapeptide, der indeholder 6 arginin og 2 lysin restkoncentrationer og er derfor yderst kationiske. Substitution undersøgelser har vist, at den netto positiv ladning af TAT er nødvendige for elektrostatiske interaktion med plasma membraner af eukaryote celler og dens efterfølgende internalisering10. På samme måde til andre CPPs binder positivt ladede TAT kraftigt elektrostatisk til de forskellige negativt ladede arter til stede i den ekstracellulære overflade af cellemembraner, herunder lipid hoved grupper, glykoproteiner og proteoglycaner3 , 10. de bioaktive ladninger transporteres af TAT bliver straks gratis i cytosol at nå deres intracellulære partnere.
Her præsenterer vi en metode, der kombinerer TAT CPP med biotin at studere intracellulære interaktioner. Målet er at designe celle-gennemtrængende lokkemad ved at fusionere target biomolekyle TAT og biotin. Den største fordel ved dette forslag er, at samspillet mellem agn og dens partnere vil finde sted inden for den trådløse forbindelse. For at vise effektiviteten af denne metode brugt vi som agn en lille sekvens af protein Cx43, der er blevet rapporteret at interagere intracellulært med proto-oncogene c-Src11,12,13. Cx43 er en integreret membran protein, der er meget til udtryk i astrocytter14og er nedreguleret i high-grade gliomer, den mest almindelige ondartet svulst af det centrale nervesystem15,16,17 ,18. Det er tidligere vist, at regionen Cx43, der interagerer med c-Src (aminosyrer 266-283 i menneskelig Cx43; PubMed: P17302) smeltet til TAT (TAT-Cx43266-283) hæmmer de muterede aktivitet af c-Srcin gliom celler og gliom stilk celler (GSCs)19,20,21. Cx43266-283 for at designe den intracellulære agn, har været smeltet TAT på N-terminus (TAT-Cx43266-283) og biotin på C-terminus (TAT-Cx43266-283– B). Denne strategi er brugt med succes i rotte gliom C6 cellelinie for at identificere c-Src, c-terminale Src kinase (CSK) og fosfatase og tensin homolog (PT) som intracellulære partnere i denne region af Cx4320. Her beskriver vi denne metode teste dens effektivitet i menneskelig GSCs, som er meget relevante for gliom terapi men meget sværere at transfect end ikke-stamceller gliom celler.
Der er mange metoder til at undersøge protein-protein interaktioner. Metoden i denne undersøgelse er baseret på den udbredte biotin-begærlighed pull-down system, hvor en biotinylated agn er inkuberes med cellelysater at tillade oprettelsen af interaktioner. Ændringen i denne undersøgelse omfatter kombinationen af denne teknik med celle-gennemtrængende sekvenser. Vi foreslår at designe celle-gennemtrængende lokkemad, der kan sættes i varmeskab med levende celler i stedet for cellelysater og derfor interaktioner fundet vil afspejle dem, der opstod inden for den trådløse forbindelse.
Her bruger vi TAT som celle-gennemtrængende sekvens, biotin som pull-down tag og regionen i Cx43 består mellem aminosyrer 266-283 som mål at finde intracellulære interaktioner i menneskelige GSCs. Det strukturelle grundlag for samspillet mellem Cx43 og c-Src er velkendt11,12. Dette er et vigtigt samspil, fordi det hæmmer den muterede aktivitet af c-Src i gliom celler24,13. Faktisk, efterligne CPPs, der indeholder denne regionen (TAT-Cx43266-283) de antioncogenic egenskaber af Cx43 gliom celler19,20,21. I rotte gliom C6 celler omfatter den mekanisme, hvormed TAT-Cx43266-283 hæmmer c-Src ansættelse af c-Src sammen med sin endogene hæmmere CSK og PT20. Det bør nævnes, at GSCs er meget interessant som et mål i gliom terapi, fordi de udgør en delpopulation, der er resistente over for konventionelle behandlinger og derfor ansvarlig for en gentagelse af denne ondartede hjerne tumorer27. Endvidere, de er skrap til at transfect celler og derfor undersøgelse af intracellulære samspillet bliver vanskeligere. CPPs er hurtigt og effektivt internaliseret i GSCs19 begunstige deres brug for studiet af intracellulære interaktioner. I denne undersøgelse, ved hjælp af CPPs sammenvoksede til biotin vi bekræfte samspillet mellem Cx43266-283 sekvens med c-Src sammen med sin endogene hæmmere CSK og PT i menneskelige GSCs.
Denne metode er meget effektive til at studere den intracellulære mekanisme af bioaktive stoffer. Det er dog meget vigtigt at bekræfte, at de biologiske virkninger af biotinylated celle gennemtrængende agn ikke er anderledes end der opnås med den ikke-biotinylated, en. Dette trin er forpligtet til at knytte de interaktioner, der er fundet med virkning af de bioaktive foderblandinger. Derudover bør stabiliteten af sammensat, samt dens mulige nedbrydning af proteaser som dets mulige giftighed, nøje testet og tages i betragtning før planlægningen eksperimentet. I eksemplet præsenteres, har TAT-Cx43266-283 anti-proliferativ påvirkning G166 menneskelige GSCs været tidligere dokumenteret20. I denne undersøgelse, vi bekræfte, at den anti-proliferative effekt af TAT-Cx43266-283– B og af TAT-Cx43266-283 er meget ens. Derudover analyse af cellulære morfologi viste, at α-tubulin og F-actin distribution er meget ens i G166 GSCs behandlet med TAT-Cx43266-283– B eller med TAT-Cx43266-283. Helt, disse resultater viser, at optagelsen af biotin på c-terminus af TAT-Cx43266-283 ikke ændre virkningerne af dette stof på menneskers GSCs. Men hvis biotin ville ændre virkningerne af de bioaktive molekyle, andre tags for protein oprensning kan testes, såsom FLAG octapeptide (DYKDDDDK)28, menneskelige influenza hemagglutinin-afledte tag HA (YPYDVPDYA) eller glutathion S-transferase (GST)29. Tilsvarende, hvis TAT ikke er rettet mod befolkningens celle af interesse, anden celle gennemtrængende sekvenser, såsom penetratin, MPG (for en anmeldelse, se30) eller celle specifikke sekvenser kan være brugt31.
Ud over undersøgelsen proteiner, der specifikt interagerer med target sekvens, ideelt, bør tilstedeværelsen af proteiner, der interagerer med både kontrolelementet og target sekvens og proteiner, der ikke arbejder sammen med dem, som positive og negative kontroller, være adresseret. I denne forstand, vi fandt Cav-1 i kontrolelementet og behandlet situation, hvilket tyder på at caveolae har været involveret i mekanismen af internalisering, som det har tidligere været vist26. Derudover FAK, som interagerer med c-Src men formodes ikke for at interagere med Cx43 c-terminal, var fraværende i både kontrol- og behandlede situationen. Disse resultater styrke specificiteten af samspillet mellem TAT-Cx43266-283– B, c-Src, CSK og pt. For at bekræfte de opnåede resultater med denne protokol, kan Konfokal mikroskopi bruges til at visualisere fordelingen af de interagerende proteiner og studere deres Co lokalisering. Vi fandt således, at TAT-Cx43266-283– B og c-Src udstille en lignende intracellulære distribution med nogle punkter af co lokalisering bekræfter resultaterne opnået med pull-down eksperimenter. I virkeligheden, TAT-Cx43266-283– B skal fordeles tæt ved plasma membran tyder på, at lasten, i denne undersøgelse Cx43266-283, dirigerer molekyle for sine intracellulære partnere.
En af begrænsningerne i den foreslåede metode er, at molekylet brugt som agn kunne undlade at folde ordentligt og de forventede virkninger ikke ville findes. I denne situation kunne interaktioner findes ikke forbindes til effekten. Men denne metode kan være særligt interessant for de interaktioner, der er involveret i signaltransduktionsveje fordi de som regel er som uløseligt uordnede regioner32 og derfor de ikke kræver en bestilt foldning. Desuden er en af fordelene ved den foreslåede metode at tidsforløb af samspillet kan følges, som er særligt relevante for forbigående interaktioner. Derudover kan relevansen af hver rester på samspillet studeres nemt. Det er muligt at undersøge relevansen af posttranslationelle modifikationer på protein-protein interaktion, for eksempel ved phosphomimetic substitution af glutamat for Serin og Threonin. På samme måde, substitution af Serin og Threonin for alanin eller tyrosin for phenylalanin tillader test effekt af ikke-phosphorylatable Serin, threonin eller tyrosin.For at efterligne phospho-tyrosin, er den mest nøjagtige måde substitution af Tyr til p-Tyr33.
Endelig, anvendelsesområdet for denne protokol er langt ud over protein-protein interaktion, fordi dette system kan anvendes til andre bioaktive laster såsom RNA sekvenser, nanopartikler, vira eller andre molekyler, der kan være smeltet til biotin og transduced med CPP at studere deres intracellulære virkningsmekanisme.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker M. Morales og J. Bravo for deres hjælp med design af CPPs og J.C. Arévalo for hans hjælp med pull-down-protokollen. Vi er taknemmelige for den tekniske bistand fra T. del Rey. Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien; FEDER BFU2015-70040-Rasmussen, Junta de Castilla y León, Spanien; FEDER SA026U16 og Fundación Ramón Areces. M. Jaraíz-Rodríguez og A. González-Sánchez er modtagere af et stipendium fra Junta de Castilla y León og den Europæiske Socialfond.
G166 GSC line | BioRep | ||
RHB-A stem cell medium | Takara | Y40001 | |
Laminin Mouse Protein | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 23017-015 | 10 µg/ml |
B-27 Serum free Supplement (50X) | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 17504-044 | 2% |
N-2 Supplement (100x) | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 17502-048 | 1% |
Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 20 ng/ml |
Recombinant Human b-FGF | Peprotech | AF-100-18B | 20 ng/ml |
PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4 | |||
Accutase | Sigma | A6964 | |
Cryostor CS10 cryopreservation medium | StemCell Technologies | 7930 | |
TAT | GenScript | – | Custom made |
TAT-B | GenScript | – | Custom made |
TAT-Cx43266-283 | GenScript | – | Custom made |
TAT-Cx43266-283-B | GenScript | – | Custom made |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | A1275737 | 1/20 |
Monoclonal α-tubulin mouse antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | 1/500 |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 1.25 mg/ml | |
Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose | ThermoFisher Scientific | 29200 | |
Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA | |||
Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free | Calbiochem, Bionova | 539134 | 1/100 (v/v) |
Sodium Fluoride | PanReac AppliChem | 141675 | 1 mM |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | 1 mM |
Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | 0.1 mM |
Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . | 1X | ||
Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | WR0100 | |
NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | WG1402box | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | NP0001 | 1X |
NuPAGE Transfer Buffer 20x | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | NP0006 | 1X |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | IB23001 | |
iBlot 2 Dry Blotting System – Gel transfer device | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water | Sigma | P7170 | |
FAK polyclonal rabbit antibody | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | AHO0502 | 1/500 |
Src polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 2108S | 1/500 |
Csk polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 4980 | 1/500 |
PTEN polyclonal mouse antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 9552 | 1/500 |
Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody | Abcam | ab2910 | 1/1000 |
Goat anti-mouse IgG-HRP antibody | Quimigen, Santa Cruz Biotechnology | Sc-2005 | 1/5000 |
Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody | Quimigen, Santa Cruz Biotechnology | SC-2030 | 1/5000 |
Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 | |
Src polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 2108S | 1/500 |
Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide | |||
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | A11029 | 1/1000 |
Cy2-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-220-089 | 1/500 |
MicroChemi Luminescence system | DNA Bio-Imaging Systems | ||
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | V13241 | 1/500 |
SlowFade Gold antifade reagent | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | S36936 | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) | Honeywell | 41641-1L | |
Appliskan 2001 | Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific |