이것은 세포내 단백질 단백질 상호 작용 세포 관통 시퀀스 결합의 참신과 함께 biotin avidin 풀 다운 시스템에 기초를 공부 하는 프로토콜 이다. 주요 장점은 세포 lysates 대신 살아있는 세포와 대상 시퀀스를 incubated 하 고 따라서 상호 작용 세포 컨텍스트 내에서 발생 합니다.
여기 우리는 널리 biotin avidin 풀 다운 시스템을 기반으로 하는 세포내 단백질-단백질 상호 작용 연구 프로토콜을 제시. 제시 하는 수정이이 기술은 세포 관통 시퀀스의 조합을 포함 합니다. 우리는 세포 lysates 대신 살아있는 세포와 알을 품 수 세포 관통 미끼 디자인을 제안 하 고 따라서 상호 작용 발견 됩니다 반영 세포내 컨텍스트 내에서 발생 하는. Connexin43 (Cx43), 갭 정션 채널 및 hemichannels를 형성 하는 단백질은 고급 gliomas에서 아래로 통제. 구성 아미노산 266-283 Cx43 지역 c-Src glioma 세포에서의 종양 활동의 억제에 대 한 책임 이다. 여기 우리 풀 다운 태그와 아미노산 266-283 transfect 하드 인간의 glioma 줄기 세포에서 세포 상호 작용을 찾을 대상으로 사이 구성 하는 Cx43의 지역으로 세포 관통 시퀀스, biotin 문신 사용 합니다. 제안된 된 방법의 한계 중 하나는 분자 사용 미끼는 제대로 하 고, 결과적으로 접어 하는 데 실패할 수 있습니다, 발견 하는 상호 작용 수 없습니다 효과와 관련입니다. 그러나 그들은 일반적으로 본질적으로 무질서 지역에 의해 실시 하 고, 따라서, 그들은 정렬 된 접는 필요 하지 않습니다 때문에,이 방법은 특히 신호 전달 경로에 관련 된 상호 작용에 대 한 흥미로운 수 있습니다. 또한, 제안된 된 방법의 장점 중 하나입니다 상호 작용에 각 잔류물의 관련성 쉽게 공부 될 수 있다. 이것은 모듈식 시스템; 따라서, 다른 세포 관통 시퀀스, 다른 태그와 다른 세포내 표적을 사용할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜의 범위는 단백질 단백질 상호 작용 보다 훨씬 RNA 시퀀스, 나노 입자, 바이러스 또는 세포 관통 시퀀스 불리고 수 있는 어떤 분자 같은 다른 생리 활성 화물에이 시스템을 적용할 수 있습니다 때문에 고 활동의 그들의 세포내 기계 장치를 공부 하기 풀 다운 태그에 융합.
단백질 단백질 상호 작용 다양 한 세포질 과정을 위해 필수적입니다. 완벽 하 게 이해 하려면 이러한 프로세스, 환경 내에서 복잡 한 세포내 단백질 상호 작용을 식별 하기 위한 방법이 제시해 주셔야 합니다. 단백질의 상호 작용 협동자를 식별 하기 위해 가장 많이 사용 된 방법 중 하나는 단백질 또는 그 단백질으로 선호도 풀 다운 실험 뒤에 바인딩 단백질의 검출에에서 미끼의 일부의 모방 펩 티 드를 사용 하는. Avidin 비타민 b 복합체 시스템은 높은 선호도, 특이성 및 avidin 비타민 b 복합체1,2간의 안정적인 상호 작용 때문에 자주 사용 됩니다. 일반적으로, 비오 틴 (단백질 또는 펩 티 드) 미끼에 바인딩되어 covalently 및 상호 작용의 설립을 허용 하는 세포 lysates 가진 외피의 기간 후 세포내 파트너에 바인딩된 biotinylated 미끼 avidin 또는 avidin 내려 오게 됩니다. 파생 상품 활용 지원 구슬. 다음, 미끼-단백질 상호 작용은 서쪽 오 점 순이 전기 이동 법을 변성 시키기 의해 세척, 차입, 및 분석 후 검색 됩니다. 이 기술은의 문제 중 하나는 관심사의 단백질 및 세포내 파트너 간의 상호 작용 세포 컨텍스트 외부 자리 하고있다입니다. 이 때문에 그들은 특정 세포내 위치에서 그들은 과도 하 고 그들은 일반적으로 풍부 하지 단백질에 의해 실행 신호 변환 통로에 관련 된 상호 작용에 대 한 특히 중요 하다. 따라서, 세포 lysates 내에서 이러한 상호 작용 수 수 마스크 다른 더 풍부한 단백질 또는 단백질 일반적으로 가까이 하지 않습니다.
세포 관통 펩 티 드 (CPPs) 짧은 펩 티 드 (≤40 아미노산), 거의 모든 셀3에 다양 한 분자를 수송 할 수 있다 양이온 아미노산에 의해 주로 구성 되어 있습니다. 단백질, 플라스 미드 DNA, siRNA, 바이러스, 이미징 에이전트, 다양 한 나노 입자 같은 화물 CPPs을 효율적으로 내 면된4,5활용 되어 있다. 이 수송 능력 때문에 그들은 또한로 알려져 있습니다 단백질 변환 도메인 (PTDs), 막 translocating 시퀀스 (MTSs), 그리고 트로이 펩 티 드. CPPs, 중 문신6 중 하나 되었습니다 가장 널리 HIV transactivator 단백질에서 문신 펩타이드 7,,89공부. 문신은 6 아르기닌과 2 리 진 잔류물을 포함 하 고 결과적으로 높은 양이온은 nonapeptide 이다.입니다. 대체 연구 문신의 순수한 양 전은 진 핵 세포와 그 이후의 국제화10의 플라즈마 멤브레인과 정전기 상호 작용에 필요한 증명 하고있다. 마찬가지로 다른 CPPs에 긍정적으로 위탁 문신 강하게 결속 정전 다양 한 부정 청구 종 세포 외 표면에 세포 막 지질 머리 그룹, proteoglycans3 , glycoproteins 등의 , 10. 생리 화물 문신에 의해 수송 될 그들의 세포내 파트너에 도달 cytosol에서 즉시 무료.
여기 선물이 biotin 세포내 상호 작용을 공부 하는 문신 CPP를 결합 하는 방법. 목표 대상 biomolecule 문신 biotin을 융합 하 여 세포 관통 미끼를 디자인 하는. 이 제안서의 주요 장점은 미끼와 파트너 간의 상호 작용 세포의 컨텍스트 내에서 자리를 차지할 것 이다입니다. 이 방법의 효능 표시 하려면 우리가 사용 미끼 proto-oncogene c-Src11,,1213침 작용할 것으로 보고 되었습니다 Cx43 단백질의 작은 순서. Cx43는 완전 한 막 단백질 이다 이다14널리 표현 하 고 고급 gliomas 아래로 통제 되는 중앙 신 경계15,16,17의 가장 일반적인 악성 종양 ,18. 그것은 되었습니다 이전 c-Src (266-283에에서 아미노산 인간 Cx43;와 상호 작용 하는 Cx43 지역 표시 Pubmed: P17302) 문신 (문신-Cx43266-283)을 융합 c Srcin glioma 세포의 종양 활동을 억제 및 glioma 줄기 세포 (GSCs)19,,2021. 세포내 미끼 디자인, Cx43266-283 는 되었습니다 융합 C-말단에 biotin을 N-말단 (문신-Cx43266-283)에서 문신 (문신-Cx43266-283-B). 이 전략은 성공적으로 사용 되었습니다 쥐 glioma C6 셀 라인에에서 c-Src, c 터미널 Src 키 (CSK)와 인산 가수분해 효소 및 Cx4320의이 지역의 세포내 파트너로 체 (PTEN) tensin 식별 하. 여기, 우리는 매우 관련 된 glioma 치료 하지만 훨씬 더 비 줄기 glioma 셀 보다 transfect에 인간 GSCs에 그 효능을 테스트 하는이 메서드를 설명 합니다.
단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 많은 방법이 있다. 이 연구에서 제시 하는 방법 biotinylated 미끼와 상호 작용의 설립을 허용 하도록 세포 lysates incubated 널리 biotin avidin 풀 다운 시스템을 기반으로 합니다. 이 연구에서 제시 하는 수정이이 기술은 세포 관통 시퀀스의 조합을 포함 합니다. 우리는 세포 lysates 대신 살아있는 세포와 알을 품 수 세포 관통 미끼 디자인을 제안 하 고 따라서 발견 상호 작용 세포 컨텍스트 내에서 발생 하는 그 반영 됩니다.
여기 우리 풀 다운 태그와 인간 GSCs에 세포 상호 작용을 찾을 대상으로 아미노산 266-283 사이 구성 하는 Cx43의 지역으로 세포 관통 시퀀스, biotin 문신 사용 합니다. Cx43와 c-Src 간의 상호 작용에 대 한 구조적으로 잘 알려진11,12입니다. 이것은 중요 한 상호 작용 그것은 c-Src glioma 셀24,13의 종양 활동을 억제 하기 때문에. 사실, 포함 하는이 지역 (문신-Cx43266-283) CPPs glioma 셀19,,2021에 Cx43의 antioncogenic 속성 모방. 쥐 glioma C6 셀에는 문신-Cx43266-283 c Src 억제 메커니즘 생 억제제 CSK와 PTEN20c-Src의 채용을 포함 한다. 그것은 GSCs 그들은 기존의 치료에 저항 하 고 그러므로27이 악성 뇌 종양 재발에 대 한 책임 부분 모집단을 구성 하기 때문에 매우 흥미로운 glioma 치료에서 대상으로는 언급 한다. 또한, 그들은 하드 transfect 세포 그리고 그러므로 세포 상호 작용의 연구 더 어려워집니다. CPPs는 신속 하 고 효율적으로 내 면 GSCs19 세포내 상호 작용의 학문을 위한 그들의 사용을 선호. 이에 연구, 우리 Cx43266-283 시퀀스의 c-Src의 내 생 억제제 CSK 및 인간 GSCs에 PTEN 함께 상호 작용을 확인 CPPs biotin에 융합을 사용 하 여.
이 메서드는 매우 강력한 생리 활성 화합물의 세포내 기계 장치를 공부 하. 그러나, biotinylated 세포 관통 미끼의 생물학적 효과 비-biotinylated 하나 얻은 다른는 것인지 매우 중요 하다. 이 단계는 생리 활성 화합물의 효과 함께 발견 하는 상호 작용을 연결 해야 합니다. 더하여, 프로 테아 제에 의해 그것의 가능한 저하 뿐만 아니라 그것의 가능한 독성 화합물의 안정성 해야 될 신중 하 게 테스트 및 실험을 계획 하기 전에 고려. 예에서 제시 G166 인간 GSCs에 문신-Cx43266-283 의 안티 증식 효과 이전 문서화20되었습니다. 이 연구에서 우리가 확인 문신 Cx43266-283의 안티 증식 효과-B 이며 문신-Cx43의266-283 매우 유사. 또한, 세포 형태학의 분석을 α-tubulin 밝혀 및 문신 Cx43266-283치료 G166 GSCs F 걸 배포 매우 비슷합니다.-B 또는 문신 Cx43266-283. 이러한 결과 문신-Cx43266-283 의 c-말단에 biotin의 포함 인간 GSCs에이 화합물의 효과 수정 하지 않은 나타냅니다. 그러나, biotin bioactive 분자의 효과 수정 것 이다 단백질 정화에 대 한 다른 태그 시험 될 수 있다, 플래그 octapeptide (DYKDDDDK)28, 인간의 인플루엔자 조류 파생 태그 하 (YPYDVPDYA) 또는 티 등 S-전이 효소 (GST)29 마찬가지로, 문신의 셀 인구 대상 하지 않는, 다른 penetratin, MPG (검토,30참조)에 대 한 같은 관통 시퀀스 셀 또는 셀 특정 시퀀스 사용된31일 수 있다.
구체적으로 대상 시퀀스와 상호 작용 하는 연구 단백질 이외에, 모두 컨트롤 및 대상 시퀀스와 상호 작용 하는 단백질 및 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, 그들 상호 작용 하지 않는 단백질의 존재 해야 합니다. 해결. 이런이 의미에서 우리가 컨트롤에 기갑 부 대-1를 발견 하 고 같이 그것은 되었습니다 이전26는 caveolae 국제화의 메커니즘에 관여 제안 처리 상황. 또한, 팍, c-Src와 상호 작용 하지만 하지 Cx43 c 단자와 상호 작용 하도록 되어, 결 석 했다 제어 및 치료 상황에. 이러한 결과 문신-Cx43266-283-B, c-Src, CSK와 PTEN 사이 상호 작용의 특이성을 강화합니다. 이 프로토콜으로 얻은 결과 확인 하려면 상호 작용 단백질의 분포를 시각화 하 고 그들의 공동 지역화 연구 confocal 현미경 검사 법을 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리는 그 문신 Cx43266-283-B와 c-Src 전시 풀 다운 실험으로 얻은 결과 확인 하는 공동 지역화의 몇 가지 포인트와 유사한 세포내 분포를 발견. 사실, 문신-Cx43266-283-B는 화물,이 연구 Cx43266-283, 지시 분자 세포내 파트너를 제안 하는 원형질 막 가까이 배포 됩니다.
제안된 된 방법의 한계 중 하나는 미끼 제대로 접어 하는 데 실패할 수 있습니다 사용 하는 분자와 예상된 효과 것입니다 찾을 수 없습니다입니다. 이 상황에서 발견 하는 상호 작용 수 없습니다 효과에 연결. 그러나,이 방법 때문에 그들은 일반적으로 본질적으로 무질서 지역32 에 의해 실행, 따라서 필요 없습니다 주문 접는 특히 신호 전달 경로에 관련 된 상호 작용에 대 한 흥미로운 수 있습니다. 또한, 제안된 된 방법의 장점 중 하나는 상호 작용의 시간 과정 지켜질 수 있다,이 특히 과도 상호 작용에 대 한 관련입니다. 또한, 상호 작용에 각 잔류물의 관련성은 쉽게 공부 될 수 있다. 실제로, 그것은 떠들고 또는 트레오닌 조미료의 phosphomimetic 대체 하 여 단백질 단백질 상호 작용, 예를 들어,에 posttranslational 수정의 관련성을 연구 수 있습니다. 마찬가지로, 떠들고 또는 알라닌에는 트레오닌, 페닐알라닌을 위한 티로신의 대체 비 phosphorylatable 떠들고, 트레오닌 또는 티로신. 의 효과 테스트를 수합니다인 티로신을 모방 하는 가장 정확한 방법은 p Tyr33Tyr의 대체입니다.
마지막으로,이 프로토콜의 범위는 단백질 단백질 상호 작용 보다 훨씬이 시스템 RNA 시퀀스, 나노 입자, 바이러스 또는 biotin을 융합 하 고 공부 하는 CPP로 불리고 수 있는 다른 분자 같은 다른 생리 활성 화물에 적용 될 수 있기 때문에 세포내 메커니즘에 대 한 그들의 행동의.
The authors have nothing to disclose.
우리가 그들의 자신의 풀 다운 프로토콜에 대 한 CPPs 및 제 아리 발로의 디자인에 대 한 M. 모 랄 레 스와 제이 브라 보 감사합니다. 우리는 토니 델 레이의 기술 지원에 대 한 감사입니다. 이 작품은 정부의 드 Economía y Competitividad, 스페인;에 의해 지원 되었다 페더 BFU2015-70040-R, 군부 de Castilla y León, 스페인; 페더 SA026U16와 Fundación 라몬 Areces입니다. M. Jaraíz-로드리게스와 A. 곤살레스-산체스는 군부 de Castilla y León에서에서 친목과 유럽 사회 기금 받는 사람.
G166 GSC line | BioRep | ||
RHB-A stem cell medium | Takara | Y40001 | |
Laminin Mouse Protein | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 23017-015 | 10 µg/ml |
B-27 Serum free Supplement (50X) | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 17504-044 | 2% |
N-2 Supplement (100x) | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 17502-048 | 1% |
Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 20 ng/ml |
Recombinant Human b-FGF | Peprotech | AF-100-18B | 20 ng/ml |
PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4 | |||
Accutase | Sigma | A6964 | |
Cryostor CS10 cryopreservation medium | StemCell Technologies | 7930 | |
TAT | GenScript | – | Custom made |
TAT-B | GenScript | – | Custom made |
TAT-Cx43266-283 | GenScript | – | Custom made |
TAT-Cx43266-283-B | GenScript | – | Custom made |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | A1275737 | 1/20 |
Monoclonal α-tubulin mouse antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | 1/500 |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 1.25 mg/ml | |
Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose | ThermoFisher Scientific | 29200 | |
Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA | |||
Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free | Calbiochem, Bionova | 539134 | 1/100 (v/v) |
Sodium Fluoride | PanReac AppliChem | 141675 | 1 mM |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | 1 mM |
Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | 0.1 mM |
Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . | 1X | ||
Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | WR0100 | |
NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | WG1402box | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | NP0001 | 1X |
NuPAGE Transfer Buffer 20x | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | NP0006 | 1X |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | IB23001 | |
iBlot 2 Dry Blotting System – Gel transfer device | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water | Sigma | P7170 | |
FAK polyclonal rabbit antibody | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | AHO0502 | 1/500 |
Src polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 2108S | 1/500 |
Csk polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 4980 | 1/500 |
PTEN polyclonal mouse antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 9552 | 1/500 |
Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody | Abcam | ab2910 | 1/1000 |
Goat anti-mouse IgG-HRP antibody | Quimigen, Santa Cruz Biotechnology | Sc-2005 | 1/5000 |
Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody | Quimigen, Santa Cruz Biotechnology | SC-2030 | 1/5000 |
Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 | |
Src polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 2108S | 1/500 |
Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide | |||
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | A11029 | 1/1000 |
Cy2-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-220-089 | 1/500 |
MicroChemi Luminescence system | DNA Bio-Imaging Systems | ||
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | V13241 | 1/500 |
SlowFade Gold antifade reagent | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | S36936 | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) | Honeywell | 41641-1L | |
Appliskan 2001 | Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific |