Dette er en protokoll for å studere intracellulær protein-protein interaksjoner basert på biotin-avidin rullegardinmenyen system med nyheten av kombinerer celle-gjennomtrengende sekvenser. Hovedfordelen er at målet sekvensen er ruges med levende celler i stedet for cellen lysates og derfor samspillet skjer innen mobilnettet sammenheng.
Her presenterer vi en protokoll for å studere intracellulær protein-protein interaksjoner som er basert på brukte biotin-avidin rullegardinmenyen systemet. Modifikasjonen presentert inkluderer kombinasjonen av denne teknikken med celle-gjennomtrengende sekvenser. Vi foreslår å designe celle-gjennomtrengende agn som kan være inkubert med levende celler i stedet for cellen lysates og derfor samhandlingene funnet gjenspeiler de som oppstår i intracellulær konteksten. Connexin43 (Cx43), et protein som danner gapet krysset kanaler og hemichannels er ned-regulert i høyverdig gliomas. Cx43 regionen bestående av aminosyrer 266-283 er ansvarlig for hemming av kreftfremkallende aktiviteten til c-Src i glioma celler. Her bruker vi TAT som cellen-gjennomtrengende sekvens, biotin rullegardin koden og regionen Cx43 består mellom aminosyrer 266-283 som mål å finne intracellulær interaksjoner i stamceller vanskelig å transfect human glioma. En av begrensningene i den foreslåtte metoden er at molekylet brukt som agn kan mislykkes å kaste riktig og følgelig, interaksjoner fant ikke kunne være knyttet til effekten. Men kan denne metoden være spesielt interessant for samhandlingene involvert i signaltransduksjon trasé fordi de er vanligvis utført av egentlig uordnede regioner og, derfor de ikke krever en bestilte folding. I tillegg er en av fordelene med den foreslåtte metoden at relevansen av hver rester på samspillet kan studeres lett. Dette er et modulært system; Derfor kan andre celle-gjennomtrengende sekvenser, andre koder og andre intracellulær mål anvendes. Til slutt, omfanget av denne protokollen er langt utover protein-protein samhandling fordi dette systemet kan brukes på andre bioaktive laster som RNA sekvenser, nanopartikler, virus eller et molekyl som kan være transduced med celle-gjennomtrengende sekvenser og smeltet på rullegardinmenyen koder å studere deres intracellulær virkningsmekanismen.
Protein-protein interaksjoner er avgjørende for et stort utvalg av cellulære prosesser. Å fullt ut forstå disse prosessene, er metoder for å identifisere protein interaksjoner i komplekse intracellulær miljøet nødvendig. En av de mest brukte metodene for å identifisere samhandling partnere av et protein er å bruke det proteinet eller et mimetic peptid av en del av at protein som agn affinitet rullegardin eksperimenter etterfulgt av gjenkjenning av bindende proteiner. Avidin-biotin systemet brukes ofte høy affinitet, spesifisitet og stabil interaksjon mellom avidin og biotin1,2. Vanligvis biotin er covalently bundet til agn (protein eller peptid) og etter en periode med inkubering med cellen lysates å tillate etablering av interaksjoner, biotinylated agn bundet til partnerne intracellulære trekkes med avidin eller avidin derivater konjugert med støtte perler. Deretter er agn-protein interaksjoner oppdaget etter vask, elueringsrør og analyse av denaturing geleelektroforese etterfulgt av Western blot. Et av problemene med denne teknikken er at samspillet mellom protein av interesse og intracellulær partnere tar sted enhetskontroll mobilnettet. Dette er spesielt viktig for samhandlinger som er involvert i signaltransduksjon trasé fordi de finner sted på bestemte intracellulær steder, de er forbigående og de er vanligvis utført av ikke rikelig proteiner. Derfor i celle lysates kan disse interaksjoner være maskert av andre mer rikelig proteiner eller proteiner som vanligvis ikke er i nærheten.
Celle-gjennomtrengende peptider (CPPs) er kort peptider (≤40 aminosyrer), består hovedsakelig av kationisk aminosyrer som er i stand til å transportere en rekke molekyler i nesten hvilken som helst celle3. Lastene som proteiner, plasmider DNA, siRNA, virus, tenkelig agenter og ulike nanopartikler har vært konjugert til CPPs og effektivt internalisert4,5. På grunn av denne transport evnen er de også kjent som protein signaltransduksjon domener (PTDs) og membran translocating sekvenser (MTSs) trojanske peptider. Blant CPPs, TAT peptid fra HIV transactivator protein TAT6 har vært en av de mest studerte 7,8,9. TAT er en nonapeptide som inneholder 6 arginine og 2 lysin rester og derfor er svært kationisk. Substitusjon studier har vist at netto positiv anklagen om TAT er nødvendig for elektrostatisk interaksjon med plasma membraner eukaryote celler og dens påfølgende internalisering10. Tilsvarende til andre CPPs binder positivt ladet TAT sterkt elektrostatisk til ulike negativt ladet arter tilstede på ekstracellulære overflaten av celle membraner, inkludert lipid hodet grupper, glykoproteiner og proteoglycans3 , 10. bioaktive lastene fraktet med TAT bli umiddelbart gratis i stoffer å nå sine intracellulær partnere.
Her presenterer vi en metode som kombinerer TAT CPP med biotin å studere intracellulær interaksjoner. Målet er å designe celle-gjennomtrengende agn kombinerer mål biomolecule TAT og biotin. Den største fordelen med dette forslaget er at samspillet mellom agnet og partnerne vil finne sted innen mobilnettet konteksten. Viser effekten av denne metoden vi brukt som agn en liten sekvens av protein Cx43 som har blitt rapportert å samhandle intracellulært med13c-Src11,12,proto-oncogene. Cx43 er en integrert membran protein som uttrykkes mye astrocyttene og14og er ned-regulert i høyverdig gliomas, den vanligste ondartet svulsten i sentralnervesystemet15,16,17 ,18. Det har vært tidligere vist at regionen Cx43 som samhandler med c-Src (aminosyrer 266-283 i menneskelig Cx43; PubMed: P17302) smeltet til TAT (TAT-Cx43266-283) hemmer kreftfremkallende aktiviteten til c-Srcin glioma celler og glioma stamceller (GSCs)19,20,21. Hvis du vil utforme intracellulær agn, Cx43266-283 har blitt smeltet TAT på N-terminus (TAT-Cx43266-283) og biotin på C-terminus (TAT-Cx43266-283– B). Denne strategien har blitt brukt i rotte glioma C6 celle linje for å identifisere c-Src, c-terminalen Src kinase (CSK) og fosfatase og tensin homolog (PTEN) som intracellulær partnere i dette området av Cx4320. Her beskriver vi denne metoden testing effekt i menneskelige GSCs, som er svært relevant for glioma behandling, men mye vanskeligere å transfect enn ikke-stammen glioma celler.
Det er mange metoder å studere protein-protein interaksjoner. Metoden presentert i denne studien er basert på brukte biotin-avidin rullegardinmenyen system der en biotinylated agn er ruges med cellen lysates tillate etableringen av samhandlinger. Endring i denne studien omfatter kombinasjonen av denne teknikken med celle-gjennomtrengende sekvenser. Vi foreslår å designe celle-gjennomtrengende agn som kan være inkubert med levende celler i stedet for cellen lysates og derfor samhandlingene funnet gjenspeiler de som skjedde i mobilnettet konteksten.
Her bruker vi TAT som cellen-gjennomtrengende sekvens, biotin rullegardin koden og regionen Cx43 består mellom aminosyrer 266-283 som mål å finne intracellulær interaksjoner i human GSCs. Strukturelle grunnlaget for samspillet mellom Cx43 og c-Src er kjente11,12. Dette er en viktig samhandling fordi den hemmer kreftfremkallende aktiviteten til c-Src i glioma celler24,13. Faktisk etterligne CPPs som inneholder denne regionen (TAT-Cx43266-283) antioncogenic egenskapene til Cx43 på glioma celler19,20,21. I rotte glioma C6 celler inkluderer mekanismen som hemmer TAT-Cx43266-283 c-Src rekruttering av c-Src med den endogene hemmere CSK og PTEN20. Det bør nevnes at GSCs er svært interessant som et mål i glioma terapi, fordi de utgjør en subpopulasjon som er motstandsdyktig mot konvensjonelle behandlinger og derfor ansvarlig for gjentakelse av denne ondartet hjernen svulster27. Videre, de er vanskelig å transfect celler og derfor studiet av intracellulær interaksjoner blir vanskeligere. CPPs er raskt og effektivt internalisert i GSCs19 favoriserer deres bruk for studiet av intracellulær interaksjoner. I denne studien, bruker CPPs smeltet til biotin bekrefter vi samspillet av Cx43266-283 sekvensen med c-Src sammen med sin endogene hemmere CSK og PTEN i menneskelig GSCs.
Denne metoden er veldig kraftig å studere intracellulær mekanismen av bioaktive forbindelser. Imidlertid er det svært viktig å bekrefte at den biologiske effekten av biotinylated celle gjennomtrengende agn ikke er forskjellig fra med ikke-biotinylated en. Dette trinnet er nødvendig for å knytte samhandlingene med effekten av bioaktive sammensatte. Stabiliteten av sammensatt, dens mulig nedbrytning av proteaser samt dens mulige toksisitet, bør i tillegg testes nøye og tatt i betraktning før du planlegger eksperimentet. I eksemplet presentert har anti-proliferativ effekten av TAT-Cx43266-283 på G166 menneskelige GSCs vært tidligere dokumenterte20. I denne studien vi bekrefte at anti-proliferativ effekten av TAT-Cx43266-283– B og TAT-Cx43266-283 er svært like. I tillegg analyse av mobilnettet morfologi avslørt at α-tubulin og F-utgangen distribusjon er svært like i G166 GSCs behandlet med TAT-Cx43266-283– B eller med TAT-Cx43266-283. Til sammen indikerer disse resultatene at inkludering av biotin på c-terminus av TAT-Cx43266-283 ikke endret effekten av dette sammensatte på menneskelige GSCs. Men hvis biotin ville endre effekten av bioaktive molekylet, kan andre koder for protein rensing testes, som det FLAGGET octapeptide (DYKDDDDK)28, menneskelig influensa hemagglutinin-avledet koden HA (YPYDVPDYA) eller glutation S-transferase (GST)29. Tilsvarende hvis TAT ikke mot befolkningen celle rundt, andre celle gjennomtrengende sekvenser, slik som penetratin, MPG (for en vurdering, se30) eller cellen bestemt sekvenser kan brukte31.
I tillegg til studien proteiner som spesielt samhandler med målet sekvensen, ideelt bør proteiner som samhandler med både kontrollen og målet sekvens og proteiner som ikke samarbeide med dem, som positive og negative kontroller, være adressert. I denne forstand, vi fant Cav-1 i kontrollen og behandlet situasjonen antyder at caveolae har vært involvert i mekanisme internalisering, som det har vært tidligere vist26. Videre FAK, som samhandler med c-Src, men skal ikke samhandle med Cx43 c-terminalen var fraværende i både kontroll og behandlet situasjonen. Disse resultatene forsterke spesifisiteten av samspillet mellom TAT-Cx43266-283– B, c-Src, CSK og PTEN. For å bekrefte resultatene med denne protokollen, kan AC confocal mikroskopi brukes å visualisere fordelingen av samspill proteiner og studere deres co lokalisering. Derfor fant vi at TAT-Cx43266-283– B og c-Src utstillingen en lignende intracellulær distribusjon med punkter av co lokalisering bekrefte resultatene oppnådd med rullegardin eksperimenter. Faktisk, TAT-Cx43266-283– B distribueres nær plasma membranen antyder at Last, i denne studien Cx43266-283, leder molekylet til partnerne intracellulær.
En av begrensningene i den foreslåtte metoden er at molekylet brukt som agn kan mislykkes å kaste riktig og forventede effekter ikke ville ble funnet. I denne situasjonen kan samhandlingene funnet ikke knyttes til effekten. Men kan denne metoden være spesielt interessant for samhandlingene involvert i signaltransduksjon trasé fordi de er vanligvis utført av egentlig uordnede regioner32 og derfor de ikke krever en bestilte folding. I tillegg er en av fordelene med den foreslåtte metoden at time course of samspillet kan følges, som er spesielt relevant for forbigående interaksjoner. Videre kan relevansen av hver rester på samspillet lett studeres. Det er faktisk mulig å studere relevansen av posttranslational modifikasjoner på protein-protein interaksjon, for eksempel ved phosphomimetic substitusjon av glutamat serine eller threonin. Tilsvarende kan substitusjon av serine eller threonin for alanin eller tyrosin for fenylalanin teste effekten av ikke-phosphorylatable serine, threonin eller tyrosin.Den mest nøyaktige måten er for å etterligne phospho-tyrosin, substitusjon av Tyr for p-Tyr33.
Til slutt, omfanget av denne protokollen er langt utover protein-protein samhandling fordi dette systemet kan brukes på andre bioaktive laster som RNA sekvenser, nanopartikler, virus eller andre molekyler som kan del biotin og transduced med CPP å studere deres intracellulær virkningsmekanismen.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker M. Morales og J. Bravo for deres hjelp med utforming av CPPs og JC Arévalo for hans hjelp med rullegardin-protokollen. Vi er takknemlige for teknisk assistanse av T. del Rey. Dette arbeidet ble støttet av Ministerio de Economía y Competitividad, Spania. FEDER BFU2015-70040-R, Junta de Castilla y León, Spania. Ble tildelt und SA026U16 og Fundación Ramón Areces. M. Jaraíz-Rodríguez og A. González-Sánchez er mottakere av et fellesskap fra Junta de Castilla y León og European Social Fund.
G166 GSC line | BioRep | ||
RHB-A stem cell medium | Takara | Y40001 | |
Laminin Mouse Protein | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 23017-015 | 10 µg/ml |
B-27 Serum free Supplement (50X) | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 17504-044 | 2% |
N-2 Supplement (100x) | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 17502-048 | 1% |
Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 20 ng/ml |
Recombinant Human b-FGF | Peprotech | AF-100-18B | 20 ng/ml |
PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4 | |||
Accutase | Sigma | A6964 | |
Cryostor CS10 cryopreservation medium | StemCell Technologies | 7930 | |
TAT | GenScript | – | Custom made |
TAT-B | GenScript | – | Custom made |
TAT-Cx43266-283 | GenScript | – | Custom made |
TAT-Cx43266-283-B | GenScript | – | Custom made |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | A1275737 | 1/20 |
Monoclonal α-tubulin mouse antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | 1/500 |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 1.25 mg/ml | |
Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose | ThermoFisher Scientific | 29200 | |
Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA | |||
Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free | Calbiochem, Bionova | 539134 | 1/100 (v/v) |
Sodium Fluoride | PanReac AppliChem | 141675 | 1 mM |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | 1 mM |
Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | 0.1 mM |
Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . | 1X | ||
Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | WR0100 | |
NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | WG1402box | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | NP0001 | 1X |
NuPAGE Transfer Buffer 20x | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | NP0006 | 1X |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | IB23001 | |
iBlot 2 Dry Blotting System – Gel transfer device | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water | Sigma | P7170 | |
FAK polyclonal rabbit antibody | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | AHO0502 | 1/500 |
Src polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 2108S | 1/500 |
Csk polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 4980 | 1/500 |
PTEN polyclonal mouse antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 9552 | 1/500 |
Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody | Abcam | ab2910 | 1/1000 |
Goat anti-mouse IgG-HRP antibody | Quimigen, Santa Cruz Biotechnology | Sc-2005 | 1/5000 |
Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody | Quimigen, Santa Cruz Biotechnology | SC-2030 | 1/5000 |
Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 | |
Src polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 2108S | 1/500 |
Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide | |||
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | A11029 | 1/1000 |
Cy2-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-220-089 | 1/500 |
MicroChemi Luminescence system | DNA Bio-Imaging Systems | ||
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | V13241 | 1/500 |
SlowFade Gold antifade reagent | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | S36936 | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) | Honeywell | 41641-1L | |
Appliskan 2001 | Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific |