Se trata de un protocolo para el estudio de las interacciones proteína-proteína intracelular basadas en el sistema de pull-down de biotina-avidina con la novedad de combinar secuencias de penetrar en la célula. La principal ventaja es que la secuencia de destino se incuba con las células vivas en lugar de lysates de la célula y por lo tanto las interacciones ocurrirán dentro del contexto celular.
Aquí presentamos un protocolo de estudio de las interacciones proteína-proteína intracelular que se basa en el ampliamente utilizado biotina-avidina desplegable sistema. La modificación presentada incluye la combinación de esta técnica con secuencias de penetrar en la célula. Proponemos diseñar cebos penetración celular que pueden incubarse con células vivas en lugar de lysates de la célula y por lo tanto los que ocurren en el contexto intracelular reflejará las interacciones encontradas. Connexin43 (Cx43), una proteína que forma canales de ensambladura de gap y hemichannels es regula en gliomas de alto grado. La región de Cx43 compuesto por aminoácidos 266-283 es responsable de la inhibición de la actividad oncogénica del c-Src en células de glioma. Aquí utilizamos TAT como la secuencia de penetración celular, biotina como la etiqueta desplegable y la región de Cx43 entre aminoácidos 266-283 como el objetivo de encontrar interacciones intracelulares en las células de glioma humano difícil de transfectar. Una de las limitaciones del método propuesto es que la molécula utilizada como cebo podría dejar de doblar correctamente y, en consecuencia, las interacciones encontradas no podrían ser asociadas con el efecto. Sin embargo, este método puede ser especialmente interesante para las interacciones involucradas en vías de transducción de señal porque generalmente se realizan por regiones intrínsecamente desordenadas y, por lo tanto, no necesitan un plegamiento ordenado. Además, una de las ventajas del método propuesto es que la relevancia de cada residuo de la interacción puede ser estudiada fácilmente. Este es un sistema modular; por lo tanto, pueden emplearse otras secuencias de penetración celular, otras etiquetas y otros objetivos intracelulares. Finalmente, el alcance de este protocolo es mucho más allá de la interacción de proteínas porque este sistema puede aplicarse a otras cargas bioactivas tales como secuencias de RNA, nanopartículas, virus o cualquier molécula que puede ser transduced secuencias de penetrar en la célula y fundido a las etiquetas desplegables para estudiar su mecanismo intracelular de acción.
Las interacciones proteína-proteína son esenciales para una gran variedad de procesos celulares. Para comprender estos procesos, se requieren métodos para la identificación de las interacciones de proteínas en el complejo entorno intracelular. Uno de los métodos más utilizados para identificar a socios de la interacción de una proteína es utilizar esa proteína o un péptido mimético de una parte de esa proteína como cebo en los experimentos de desplegable de afinidad seguidos de detección de proteínas. El sistema avidina-biotina se utiliza con frecuencia debido a la alta afinidad, especificidad e interacción estable entre avidina y la biotina de1,2. Generalmente, la biotina es covalentemente al cebo (proteína o péptido) y después de un período de incubación con los lysates de la célula para permitir el establecimiento de interacciones, el cebo biotinilado a sus socios intracelulares es derribado con avidina o avidina derivados conjugan con granos de apoyo. Entonces, se detectan las interacciones proteína cebo después de lavado y elución análisis desnaturalizando electroforesis seguida de Western blot. Uno de los problemas de esta técnica es que las interacciones entre la proteína de interés y sus socios intracelulares tienen lugar fuera del contexto celular. Esto es especialmente importante para las interacciones involucradas en vías de transducción de señal porque ocurren en lugares específicos intracelulares, son transitorios y típicamente son realizadas por proteínas no abundantes. Por lo tanto, dentro de los lysates de la célula estas interacciones se pueden enmascarar por otros más abundantes proteínas o por proteínas que generalmente no están en las inmediaciones.
Péptidos de penetración celular (CPPs) son péptidos cortos (≤ 40 aminoácidos), compuestas en su mayor parte por aminoácidos catiónicos que son capaces de transportar una amplia gama de moléculas en casi cualquier celular3. Cargas tales como proteínas, DNA plasmídico, siRNA, virus, agentes de imagen y diferentes nanopartículas han sido conjugadas a CPPs y eficientemente internalizada4,5. Debido a esta capacidad de transporte son también conocidos como dominios proteína de transducción de señales (PTDs), membrana translocan secuencias (MTSs) y péptidos troyanos. Entre la CPPs, el TAT péptido de la proteína del transactivator de VIH TAT6 ha sido uno de los más ampliamente estudiados 7,8,9. TAT es un nonapéptido que contiene 2 residuos de lisina y arginina 6 y por lo tanto es altamente catiónico. Sustitución de estudios ha demostrado que la carga positiva neta de TAT es necesaria por interacciones electrostáticas con las membranas del plasma de las células eucariotas y su posterior interiorización10. Semejantemente a otros CPPs, TAT cargado positivamente fuertemente se une electrostáticamente a las varias cargado negativamente especies presentes en la superficie extracelular de las membranas celulares, incluyendo los grupos cabeza del lípido, glicoproteínas y proteoglicanos3 , 10. la bioactivos de cargas transportadas por TAT ser inmediatamente libres en el citosol para llegar a sus socios intracelulares.
Aquí presentamos un método que combina el CPP TAT con biotina para el estudio de las interacciones intracelulares. El objetivo es diseñar cebos de penetrar en la célula mediante la fusión de la biomolécula blanco al TAT y a la biotina. La principal ventaja de esta propuesta es que las interacciones entre el cebo y sus socios llevará a cabo dentro de su contexto celular. Para demostrar la eficacia de este método que utiliza como cebo una pequeña secuencia de la proteína Cx43 que se ha reportado interacción intracelular con el proto-oncogene c-Src11,12,13. Cx43 es una proteína integral de membrana que se expresa ampliamente en astrocitos14regula en gliomas de alto grado, el tumor maligno más común del sistema nervioso central15,16,17 ,18. Ha sido demostrado previamente que la región de Cx43 que interactúa con el c-Src (aminoácidos 266-283 de Cx43 humana; PubMed: P17302) fundido a TAT (TAT-Cx43266-283) inhibe la actividad oncogénica del c-Srcin las células de glioma y células de glioma madre (GSCs)19,20,21. Para diseñar el cebo intracelular, Cx43266-283 ha fundido a TAT en el N-terminal (TAT-Cx43266-283) y a la biotina en la terminal C (TAT-Cx43266-283– B). Esta estrategia se ha utilizado con éxito en el glioma de rata C6 línea de celular para identificar c-Src, c-terminal Quinasa Src (CSK) y fosfatasa y tensina (PTEN) de homólogo como intracelulares asociados de esta región de Cx4320. Aquí, describimos este método probar su eficacia en humanos GSCs, que son muy relevantes para el tratamiento de glioma, pero mucho más difícil transfectar que las células de glioma de tallo no.
Hay muchos métodos para el estudio de las interacciones proteína-proteína. El método presentado en este estudio se basa en el sistema de desplegable de biotina-avidina ampliamente utilizado en el que un cebo biotinilado se incuba con lysates de la célula para permitir el establecimiento de interacciones. La modificación presentada en este estudio incluye la combinación de esta técnica con secuencias de penetrar en la célula. Proponemos diseñar cebos penetración celular que pueden incubarse con células vivas en lugar de lysates de la célula y por lo tanto las interacciones encontradas reflejará los ocurridos en el contexto celular.
Aquí utilizamos TAT como la secuencia de penetración celular, biotina como la etiqueta desplegable y la región de Cx43 entre aminoácidos 266-283 como el objetivo de encontrar interacciones intracelulares en GSCs humanas. La base estructural para la interacción de Cx43 y c-Src es conocida11,12. Se trata de una interacción importante porque inhibe la actividad oncogénica del c-Src en glioma células24,13. De hecho, CPPs que contiene esta región (TAT-Cx43266-283) mímico las características antioncogenic de Cx43 en células de glioma19,20,21. En células de C6 de glioma de rata, el mecanismo por el cual inhibe la Cx43 TAT266-283 c-Src incluye el reclutamiento de c-Src junto con sus inhibidores endógenos de la CSK y PTEN20. Cabe mencionar que GSCs son muy interesantes como un objetivo en el tratamiento del glioma, ya que constituyen una subpoblación que es resistente a los tratamientos convencionales y por lo tanto responsable de la recurrencia de este de tumores cerebrales malignos27. Además, son duros para transfectar las células y por lo tanto el estudio de las interacciones intracelulares se vuelve más difícil. CPPs se internalizan rápidamente y eficientemente en GSCs19 favoreciendo su uso para el estudio de las interacciones intracelulares. En este estudio, utilizando CPPs Unidas a biotina confirmamos la interacción de la secuencia de Cx43266-283 con c-Src junto con sus inhibidores endógenos CSK y PTEN en GSCs humanas.
Este método es muy potente para estudiar el mecanismo intracelular de compuestos bioactivos. Sin embargo, es muy importante confirmar que el efecto biológico del cebo penetrante biotinilado de la célula no es diferente de la que se obtiene con el no biotinilado uno. Este paso es necesario asociar las interacciones con el efecto de los compuestos bioactivos. Además, la estabilidad del compuesto, su posible degradación por proteasas, así como su posible toxicidad, debe ser probada cuidadosamente y tener en cuenta antes de planear el experimento. En el ejemplo presentado, el efecto anti-proliferativo de TAT-Cx43266-283 en G166 GSCs humanas ha sido previamente documentada20. En este estudio, nos confirman que el efecto anti-proliferativo de Cx43 TAT266-283– B y de TAT-Cx43266-283 es muy similar. Además, el análisis de la morfología celular reveló que α-tubulina y distribución de la F-actina es muy similar en G166 GSCs tratados con TAT Cx43266-283– B o con TAT Cx43266-283. En conjunto, estos resultados indican que la inclusión de la biotina en el c-término de Cx43 TAT266-283 no modificó los efectos de este compuesto en GSCs humanas. Sin embargo, si biotina modificar los efectos de la molécula bioactive, otras etiquetas para la purificación de la proteína pueden probarse, como la bandera octapéptido (DYKDDDDK)28, la etiqueta de derivados de hemaglutinina influenza humana HA (YPYDVPDYA) o glutatión S-transferasa (GST)29. Del mismo modo, si TAT destino la población de células de interés, otra célula secuencias penetrantes, como penetratin, MPG (para una revisión, véase30) o secuencias específicas de la célula pueden ser utilizado31.
Además de estudio de las proteínas que interaccionan específicamente con la secuencia de destino, idealmente, debería ser la presencia de proteínas que interactúan con el control y la secuencia de destino y las proteínas que no interactúan con ellos, como controles positivos y negativos, dirigida. En este sentido, encontramos Cav-1 en el control y tratamiento situación, sugiriendo que los caveolae han estado involucrados en el mecanismo de internalización, como se ha demostrado previamente26. Además, FAK, que interactúa con el c-Src pero no debe para interactuar con la terminal c de Cx43, estuvo ausente en el control y la situación tratada. Estos resultados refuerzan la especificidad de la interacción entre TAT Cx43266-283– B, c-Src, CSK y PTEN. Para confirmar los resultados obtenidos con este protocolo, la microscopia confocal puede utilizarse para visualizar la distribución de las proteínas obran recíprocamente y estudiar su colocalización. Así, encontramos TAT Cx43266-283– B y c-Src exhiben una distribución intracelular similar con algunos puntos de co-localización, confirmando los resultados obtenida con los experimentos de pull-down. De hecho, TAT-Cx43266-283– B se distribuye cerca de la membrana plasmática, sugiriendo que la carga, en este estudio de Cx43266-283, dirige a la molécula a sus socios intracelulares.
Una de las limitaciones del método propuesto es que la molécula utilizada como cebo podría dejar de doblar correctamente y los efectos esperados no se encontrarían. En esta situación, las interacciones encontradas no pueden estar asociadas al efecto. Sin embargo, este método puede ser especialmente interesante para las interacciones involucradas en vías de transducción de señal porque generalmente se realizan por regiones intrínsecamente desordenadas32 y por lo tanto no necesitan un plegamiento ordenado. Además, una de las ventajas del método propuesto es que puede seguirse el curso del tiempo de la interacción, que es especialmente importante para las interacciones transitorias. Además, se puede estudiar fácilmente la importancia de cada residuo de la interacción. De hecho, es posible estudiar la pertinencia de las modificaciones postraduccionales en la interacción de proteínas, por ejemplo, en phosphomimetic la sustitución de glutamato para la serina o treonina. Asimismo, sustitución de serina o treonina de alanina o tirosina por fenilalanina permite probar el efecto de no phosphorylatable serina, treonina o tirosina.Para imitar el fosfo-tirosina, la forma más precisa es la substitución de Tyr p-Tyr33.
Finalmente, el alcance de este protocolo es mucho más allá de la interacción de proteínas porque este sistema puede aplicarse a otras cargas bioactivas tales como secuencias de RNA, nanopartículas, virus u otras moléculas que pueden ser fusionados a la biotina y transduced con CPP para estudiar su mecanismo intracelular de acción.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a M. Morales y J. Bravo por su ayuda con el diseño de la CPPs y J.C. Arévalo por su ayuda con el protocolo de pull-down. Estamos agradecidos por la asistencia técnica de T. del Rey. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad, España; FEDER BFU2015-70040-R, Junta de Castilla y León, España; SA026U16 FEDER y la Fundación Ramón Areces. M. Rodríguez de Jaraíz y A. González Sánchez son los beneficiarios de una beca de la Junta de Castilla y León y Fondo Social Europeo.
G166 GSC line | BioRep | ||
RHB-A stem cell medium | Takara | Y40001 | |
Laminin Mouse Protein | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 23017-015 | 10 µg/ml |
B-27 Serum free Supplement (50X) | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 17504-044 | 2% |
N-2 Supplement (100x) | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 17502-048 | 1% |
Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 20 ng/ml |
Recombinant Human b-FGF | Peprotech | AF-100-18B | 20 ng/ml |
PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4 | |||
Accutase | Sigma | A6964 | |
Cryostor CS10 cryopreservation medium | StemCell Technologies | 7930 | |
TAT | GenScript | – | Custom made |
TAT-B | GenScript | – | Custom made |
TAT-Cx43266-283 | GenScript | – | Custom made |
TAT-Cx43266-283-B | GenScript | – | Custom made |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | A1275737 | 1/20 |
Monoclonal α-tubulin mouse antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | 1/500 |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 1.25 mg/ml | |
Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose | ThermoFisher Scientific | 29200 | |
Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA | |||
Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free | Calbiochem, Bionova | 539134 | 1/100 (v/v) |
Sodium Fluoride | PanReac AppliChem | 141675 | 1 mM |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | 1 mM |
Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | 0.1 mM |
Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . | 1X | ||
Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | WR0100 | |
NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | WG1402box | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | NP0001 | 1X |
NuPAGE Transfer Buffer 20x | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | NP0006 | 1X |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | IB23001 | |
iBlot 2 Dry Blotting System – Gel transfer device | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water | Sigma | P7170 | |
FAK polyclonal rabbit antibody | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | AHO0502 | 1/500 |
Src polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 2108S | 1/500 |
Csk polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 4980 | 1/500 |
PTEN polyclonal mouse antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 9552 | 1/500 |
Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody | Abcam | ab2910 | 1/1000 |
Goat anti-mouse IgG-HRP antibody | Quimigen, Santa Cruz Biotechnology | Sc-2005 | 1/5000 |
Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody | Quimigen, Santa Cruz Biotechnology | SC-2030 | 1/5000 |
Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 | |
Src polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 2108S | 1/500 |
Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide | |||
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | A11029 | 1/1000 |
Cy2-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-220-089 | 1/500 |
MicroChemi Luminescence system | DNA Bio-Imaging Systems | ||
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | V13241 | 1/500 |
SlowFade Gold antifade reagent | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | S36936 | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) | Honeywell | 41641-1L | |
Appliskan 2001 | Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific |