יצירת מודלים העכבר עבור וירוס Zika-induced הפרעות נוירולוגיות באמצעות הזרקת גרם אסטרטגיות: עובריים Neonatal, למבוגרים
Summary
כאן נתאר שיטת יצירת מודל של Zika הנוצרות על-ידי וירוס microcephaly עכבר. פרוטוקול זה כולל שיטות חיסון גרם עובריים neonatal, מבוגר-שלב של הנגיף Zika.
Abstract
הווירוס Zika (ZIKV) הוא flavivirus כיום אנדמית ב צפון, מרכז, דרום אמריקה. עכשיו זה נקבע כי ZIKV יכול לגרום microcephaly חריגות המוח נוספים. עם זאת, המנגנון שבבסיס בפתוגנזה של ZIKV במוח המתפתח עדיין לא ברור. שיטות הניתוח גרם משמשים לעתים קרובות במחקר מדעי המוח על שאלות על התפתחות המוח תקינה ולא תקינה ותפקוד המוח. פרוטוקול זה מנצל טכניקות ניתוחיות קלאסית, מתאר שיטות שבהן אפשר אחד דגם ZIKV-הקשורים האנושי מחלה נוירולוגית במערכת העצבים העכבר. בזמן חיסון מוח ישירה דגם לא נורמלי ההידבקות וירוס, השיטה מאפשרת חוקרים כדי לשאול שאלות יישוב הנוגעות התוצאה לאחר זיהום ZIKV של המוח המתפתח. פרוטוקול זה מתאר בשלבים עובריים neonatal, למבוגרים של חיסון ע של ZIKV. לאחר mastered, שיטה זו יכולה להפוך טכניקה פשוטה, לשחזור לוקח רק כמה שעות לביצוע.
Introduction
Microcephaly היא מצב הנובע התפתחות המוח פגומה מאופיין קטן יותר גודל ראש ממוצע ילודים. ילדים עם microcephaly מוצג מגוון של תסמינים אשר יכולות לכלול עיכוב התפתחותי, פרכוס, מוגבלות, אובדן שמיעה, בעיות ראייה ובעיות עם תנועה ואיזון, בין היתר, בהתאם לחומרת המחלה, לגרום1,2,3. מצב זה הוא multifactorial בטבע, עם סוכן זיהומיות גנטיים, גורמים סביבתיים קשורים וגרם microcephaly4,5,6,7,8, 9. לפני תחילת 2015-2016 ZIKV, 8 ילדים מתוך 10,000 לידות אובחנו עם microcephaly בארצות הברית על פי ה-CDC10. ב-1 בפברוארst של 2016 ארגון הבריאות העולמי הכריז הווירוס Zika בריאות הציבור חירום של הבינלאומי דאגה לנוכח העלייה מדאיג אבחנות microcephaly המשויך ZIKV זיהום אמהות11, 12. מחקר שנערך לאחרונה מהמרכז לבקרת מחלות על מקרים ZIKV בארצות הברית עולה כי התוצאות זיהום ZIKV האימהי סיכון מוגבר 20-fold לילד לפתח microcephaly לעומת אנשים נגוע, ו 4% מהאמהות ZIKV נגוע מארצות הברית גרמו ילדים עם microcephaly11. הקצב microcephaly-הקשורים למומים מולדים במהלך ההריון מזיהום ZIKV בברזיל דווחו משפיע עד 17% של תינוקות: האמהות נגועים, המציין כי גורמים אחרים באמריקה הלטינית עשוי להיות תורם סיכון מוגבר 13. בזמן שאנו יודעים כי ZIKV יכול לגרום microcephaly ו פתוגנזה ב קדמון עצבית תא (NPC) האוכלוסייה7,8,14, מלאה בפתוגנזה של ZIKV בפיתוח המוח נשאר קשה להבנה. חשוב לפתח מודלים בעלי חיים להמשיך לחקור את מנגנוני המחלה הבסיסית של חריגות המוח הקשורים עם זיהום ZIKV.
ללמוד ישירות את ההשפעה ZIKV על התפתחות המוח, לראשונה פיתחנו מודל העכבר באמצעות חיסון גרם של המוח (E14.5) 14.5 יום עובריים ZIKV7. בשלב זה נבחר כפי שהוא נחשב נציג של סוף השליש הראשון ההיריון האנושי14. הגורים יכולים לשרוד עד יום כמחנכת 5 (P5) בשיטה זו זריקה גרם עובריים (~ 1 µL של 1.7 x 106 תרביות רקמה זיהומיות מינון (TCID50/mL)). לאחר הלידה הגורים להפגין מגוון פנוטיפים באופן דומה נצפתה אצל תינוקות בני אדם נגועים כולל החדרים מוגדלים, אובדן עצביים, עצב rarefaction, astrogliosis, microglial הפעלה12,15. מוח העכבר היילוד הוא יחסית לא בוגר, דומה השלב ההתפתחותי של המוח האנושי בגיל אמצע ההיריון16, התפתחות המוח העכבר כולל מרכיב מרכזי כמחנכת. ללמוד זיהומים בשלב מאוחר יותר של ההיריון, מתואר גם שיטה של זיהום לאחר הלידה. Neonates נגוע ZIKV ב P1 מסוגלים לשרוד 13 ימים שלאחר ההזרקה. זיהום דם-נולד הבמה למבוגרים שתיארנו העכבר בעבר17 אך מחייב השימוש שעתוק גורם רגולטורי (IRF) אינטרפרון (IFN) גורמים IRF-3,-5, נוקאאוט טריפל-7 זן. פרוטוקול זה מתאר שיטה מזריקים ZIKV intraventricularly לעקוף את השבתת התגובה אנטי ויראליים של המודל מאתר אצל אדם בוגר. בזמן זה עוקף את המערכת החיסונית מאתר, המסלול של הזרקת לא ישירות לחקות את המסלול טיפוסי של זיהום. כדי לטפל אי-התאמה זו ישירות, הנסיין ניתן לבצע זיהום תוך רחמי של ZIKV במקום תוואי תוך-גולגולתי. לאימוץ מבית בעבודה הקודמת18, בקצרה תארנו טכניקה זו בפרוטוקול זה זיהום מתחלקים.
זני וירוס Zika מיושם עם טכניקה זו כוללים את בידוד מקסיקני7,MEX1-4419 ולבודד אפריקה ב 194720מר-766. Zika MEX1-44 היתה מבודדת במקסיקו, צ’יאפס בינואר 2016 מ נגוע Aedes aegypti יתושים. . השגנו את הוירוס הזה עם אישור באמצעות הסניף הרפואה באוניברסיטת טקסס בגלבסטון (UTMB). בנוסף, serotype וירוס דנגה 2 (DENV2) היה מחוסן בעזרת טכניקה זו במחקר השוואה. DENV2, זן S16803 (רצף GenBank GU289914), היה מבודד מדגם החולה מתאילנד בשנת 1974, passaged בתאים C6/36. הווירוס היה passaged פעמיים בתאים Vero על ידי המרכז התייחסות העולם מתעוררים וירוסים, Arboviruses (WRCEVA) לפני זריקות העכבר. זה מדגים כי טכניקה זו פועלת באותה מידה גם עבור זנים שונים של ZIKV ושל אחרים flaviviruses שעשויה להיות לו השפעה על התפתחות המוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
המתוארים כאן היא שיטת חיסון גרם של ZIKV בשלבים עובריים neonatal, למבוגרים עבור החקירה של ZIKV-induced נזקים בהתפתחות המוח. אמנם פשוטה, ישנם מספר שיקולים חוקרים שעליך לבצע כדי לוודא את איכות העבודה ואת הבטיחות של המעורבים.
DENV קשורה קשר הדוק ZIKV של הסוג flavivirus. DENV לא סיבתי חובר הפרעות מוח בי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר את ד ר Benraiss אללטיף ב אוניברסיטת רוצ’סטר עבור ההדרכה שלו ודיונים רלוונטיים למידה למבוגרים כירורגי וטכניקות neonate. המחברים גם רוצה להכיר ד ר ג’יימס לודרדייל-עוגה עבור השימוש שלו ציוד stereotaxic ודיונים הקשורים הגדרת את המתודולוגיה של טכניקה זו, ולקידום עבור מדענים המכללה מחקר (קשתות) הרישמי שלהם התמיכה והתמיכה שלנו NIH (NINDS מעניקה R01NS096176-02, R01NS097231-01, & F99NS105187-01).
Materials
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | – | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
| Mineral Oil | VWR | – | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
