Summary
Nous présentons un protocole pour utiliser la Madagascar blatte comme modèle animal non-mammifère alternatif pour mener la virulence bactérienne, pathogenèse, toxicité des médicaments, l’efficacité du médicament et études de la réponse immunitaire innée.
Abstract
Beaucoup d’aspects de l’immunité innée est conservées entre les mammifères et les insectes. Un insecte, le Madagascar blatte du genre Gromphadorhina, peut être utilisé comme un modèle alternatif d’animaux pour l’étude de la virulence, l’interaction hôte-pathogène, réponse immunitaire innée et l’efficacité du médicament. Détails pour l’élevage, soins et reproduction de la blatte sifflement sont fournis. Nous montrons aussi comment il peut être infecté par des bactéries telles que les pathogènes intracellulaires Burkholderia mallei, b. pseudomallei et b. thailandensis. L’utilisation de la blatte sifflement est peu coûteuse et surmonte les questions de réglementation concernant l’utilisation des mammifères dans la recherche. En outre, trouv & eacutes en utilisant le modèle de cafard sifflant est semblables à ceux obtenus à l’aide de modèles mammifères et reproductible. Ainsi, le cafard sifflant de Madagascar représente un hôte de remplacement attrayante qui devrait être étudié lors des études chez l’animal.
Introduction
L’utilisation d’insectes comme alternatives non-mammifère modèles animaux pour étudier la pathogenèse bactérienne et la défense de l’hôte innée a été gagne du terrain ces dernières années. Sur le plan logistique, c’est en raison de leur coût relativement peu élevé et la facilité à obtenir, manutention et à s’occuper des insectes par rapport aux mammifères. Il n’y a également aucune politique de réglementation régissant l’utilisation des insectes dans la recherche ; Il n’est pas soumis à la compétence ou les limitations imposées par un animal utilisent Comité ou un organisme gouvernemental. Insectes comme des modèles animaux de substitution se prêtent particulièrement à des études complètes pour les facteurs de virulence, interactions hôte-pathogène et les évaluations de l’efficacité des médicaments antimicrobiens. Leur utilisation peut réduire le nombre de mammifères utilisés pour la recherche ainsi surmonter certains des dilemmes éthiques inhérents à la conduite d’expérimentation animale 1,2.
Insectes peuvent servir d’hôtes substitut parce qu’il y a un haut degré de communité entre le système immunitaire inné des insectes et des mammifères 1,3. Les plasmatocytes insectes et mammifères macrophages phagocytent les microorganismes 4. La contrepartie insecte de la neutrophile est les hémocytes 5,6. Les voies de burst oxydatif intracellulaire dans les insectes et les cellules de mammifères sont similaires ; les espèces réactives de l’oxygène dans les deux sont produites par orthologues p47phox et p67phox protéines 5. Les cascades de signalisation en aval des récepteurs Toll dans les insectes et les récepteurs Toll-like et d’interleukine-1 chez les mammifères sont aussi remarquablement similaires ; tous deux entraîner la production de peptides antimicrobiens, tels que les défensines 7. Ainsi, les insectes peuvent être utilisés pour étudier des mécanismes immunitaires innées générales qui sont partagées par des métazoaires.
Un insecte appelé le Madagascar blatte du genre Gromphadorhina, est l’un de la plus grande espèce de cafard qui existe, typiquement atteignant 5 à 8 cm à maturité. Il est seulement originaire de l’île de Madagascar et se caractérise par le sifflement - rend un son qui se produit quand le cafard sifflant expulse l’air à travers les ouvertures respiratoires appelées spiracles 8. Le sifflement caractéristique sert comme une forme de communication sociale parmi les sifflements des cafards pour la parade nuptiale et agression 9 et peut être entendu quand un homme est dérangé dans son habitat. Le Madagascar blatte est un mouvement lent comparé à la blatte américaine et d’autres espèces de ravageurs urbain. Il est facile de prendre soin et de se reproduire ; un cafard sifflant enceinte peut produire des descendants de 20 à 30 à la fois. Un bébé sifflements cafard, appelé une nymphe, atteint sa maturité sexuelle à 5 mois après avoir soumis à 6 mues et peut vivre jusqu'à 5 ans dans la nature et en captivité, 8.
Nous avons utilisé le Madagascar blatte comme un hôte de remplacement pour l’infection par des pathogènes intracellulaires Burkholderia mallei, b. pseudomalleiet thailandensis b. 10,11. La virulence de ces agents pathogènes en sifflant des cafards a été comparée à leur virulence chez le modèle animal de référence pour Burkholderia, le hamster syrien. Nous avons trouvé que la dose létale 50 % (DL50) de b. pseudomallei et b. mallei était similaire dans les deux modèles 11. Fait intéressant, b. thailandensis, bien que non virulente dans le modèle de rongeur, est mortelle dans le sifflement de la blatte 11. Cette différence en ce qui concerne l’infection à b. thailandensis met en évidence l’utilité du modèle cafard sifflant ; B. thailandensis atténuant les mutants peuvent être résolues plus facilement chez la blatte sifflement que dans les modèles de rongeurs. En outre, comme b. thailandensis est souvent utilisé comme l’organisme modèle pour b. pseudomallei et mallei b. 10,12,13, identifier les mutations atténuantes il pourrait conduire à des cibles similaires dans ses cousines plus virulentes.
Malgré la différence dans la virulence de thailandensis b. chez la blatte sifflement versus le hamster syrien, facteurs de virulence critique, comme celles figurant dans le système de sécrétion de type 6-1 (T6SS-1), des mutations qui sont atténuant dans b. mallei et B. pseudomallei, sont de même atténuer pour thailandensis b. 11. Le modèle cafard sifflant est plus validé dans ce T6SS individuels mutants (T6SS-2 T6SS-6) en b. pseudomallei, qui n’ont aucune incidence sur la virulence chez les hamsters syriens, restent virulents dans le sifflement des cafards 11. Ainsi, le cafard sifflant est un modèle animal de substitution viable pour les trois espèces de Burkholderia . Récemment, nous avons utilisé le cafard sifflant comme un modèle animal de substitution pour évaluer l’efficacité de la chloroquine médicament antipaludique (CLQ) contre Burkholderia infection 10 et sa toxicité.
Nous décrivons ici l’élevage et les soins de Madagascar blatte et fournir des détails sur la façon d’infecter cet insecte avec trois espèces de Burkholderia . En outre, nous révèlent que le cafard sifflant est un modèle de substitution viable pour étudier la virulence et l’efficacité du médicament dans les infections de Burkholderia et qu’il probablement peut également servir un hôte de remplacement pour les autres bactéries pathogènes dans des études similaires.
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Protocol
1. les préparations pour le maintien d’une colonie de cafard sifflant
- Se préparer pour les cafards sifflement à vivre dans des cages. Appliquer une fine couche de gelée de pétrole, environ 20 à 30 mm de largeur, soit à la circonférence des parois vers le haut de la cage pour éviter les cafards sifflement de l’escalade de la cage et d’échapper.
NOTE : Sifflements cafards peut être logé dans une variété de conteneurs qui ont une grande surface, sont d’une hauteur suffisante et être munies de couvercles. Utiliser des cages de souris (~ 43 x 23 cm x 20 cm). Pour les cages destinées à 37 ° C, ne s’appliquent pas de gelée de pétrole. - Inclure un carton d’oeufs en carton placé à l’envers à l’intérieur de la cage pour offrir une cachette pour les insectes naturellement timides. Ne pas substituer le carton d’oeufs en carton avec celle faite en mousse de polystyrène afin d’éviter l’ingestion de plastique.
- Ne fournissent pas de litière pour le nettoyage plus facile et à accroître la visibilité des nymphes nouvellement écloses.
- Procurer de la nourriture sèche pour chiens qui contient une composition de ~ 20 % de protéines brutes. Grossièrement, broyer la nourriture pour chien avec un robot culinaire ou un mélangeur et conserver à 4 ° C.
- Obtenir plusieurs plats peu profonds et pierres aquarium ou une éponge pour l’alimentation et l’eau.
NOTE : boîtes de Pétri sont recommandées.
2. un sifflement cafard soins et reproduction
- Obtenir non-consanguines Madagascar sifflements cafards (~ 5 cm) d’un éleveur commercial. Les espèces utilisées dans le présent protocole sont Gromphadorhina laevigata. Déballez la boîte d’expédition contenant les cafards sifflement dès leur réception.
- Suivez les directives institutionnelles appropriées pour l’utilisation des équipements de protection individuelle dans le traitement des animaux.
Remarque : Utilisez des gants jetables épais pour le traitement des cafards car les griffes tarsiennes d’un cafard sifflant sont coupantes. - Transfert jusqu'à 75 grands cafards sifflement (> 3 cm) par grande cage. Transférer les larves nouvellement écloses et plus petites (< 3 cm) pour une cage séparée.
Remarque : Maintenir significativement plus de 75 grands sifflements cafards par cage souris pourraient conduire à la détérioration de la santé de la colonie et peuvent également entraîner de décès. - Gérer un cafard fraîchement muée, qui est blanc cassé en couleur, doucement et évitez les pressant. Vous pouvez également permettre l’exosquelette à assombrir et durcir avant du manipuler.
Remarque : Il n’est pas nécessaire d’enlever les acariens, Gromphadorholaelaps schaeferi, qui accompagnent souvent les cafards sifflement dès réception des éleveurs. Les acariens bénéfiques nettoyer les cafards sifflement et sont inoffensifs pour les humains. - Nourrir un sifflement cafards avec de la nourriture sèche pour chiens au sol dans un plat peu profond une ou deux fois par semaine. Fournir suffisamment de nourriture chien afin que les cafards sifflement aient suffisamment de nourriture jusqu'à la prochaine tétée. Jetez tout aliment qui est devenue humide et moisie.
- En plus de nourriture pour chiens, fournir découpé fruits et légumes, comme les pommes, pommes de terre ou laitue, dans un plat peu profond. Jetez les aliments moisi ou pourri.
- Fournir de l’eau potable une ou deux fois par semaine dans un plat peu profond, mais ne pas trop remplir le plat pour éviter toute fuite dans la cage. Placer les pierres de petit aquarium ou une éponge dans le plat de prévoir une aire d’atterrissage de petites nymphes. Utiliser de l’eau osmosée, si disponible.
- Garder un sifflement de cafards dans l’obscurité à une température variant de 21 ° C à 30 ° C. Garder les gros cafards sifflement destinés à l’expérimentation à une température plus basse (~ 21 ° C) pour environ 2 mois diminuer la reproduction et la grossesse. En revanche, garder des nymphes aux températures plus élevées (28 ° C à 30 ° C) pour accélérer la croissance.
NOTE : Gardez les cages à température ambiante (21 ° C) dans un endroit sombre du cabinet. - Obtenir l’humidité en incluant une casserole d’eau si le sifflement des cafards sont conservés dans un incubateur.
- Nettoyer la cage en écopant des excréments secs régulièrement ou en transférant un sifflement cafards à une cage propre par 2 ou 3 semaines. Garder le fond de la cage au sec. Nettoyer la cage immédiatement si l’excès d’eau est autorisé à s’accumuler et mélanger avec les excréments au fond de la cage.
3. cafard préparation d’expérimentation
- Transférer le nombre approprié de sifflement cafards dans une cage à un incubateur à 37 ° C humidifié avant une expérience de 1 à 3 semaines d’acclimatation. Inclure un groupe de contrôle pour l’injection. Cette période d’acclimatation est essentielle pour éviter les chocs de température au cours de l’expérimentation.
- Ne pas appliquer la vaseline aux cages destinées à 37 ° C car la température élevée fait fondre la gelée.
- Vérifier les cafards sifflement tous les 1 à 2 jours pour remplacer les aliments et l’eau et nettoyer la cage.
- Obtenir des contenants clairement jetables en plastique alimentaire avec couvercles pour regrouper les cafards sifflement pendant l’expérimentation. Pour la ventilation, percer des trous dans le couvercle ou le côté du récipient avec un clou et le marteau.
NOTE : Utiliser de récipients capuchon vissé sur snap cap conteneurs dans le cadre de niveau 3 de biosécurité. Conteneurs de Snap cap peuvent être renforcés avec du ruban adhésif, si nécessaire. - Le jour de l’injection, distribuer des cafards sifflement acclimatés de 6 à 12 en groupes par conteneur, assurer une répartition égale selon le sexe et la masse corporelle.
- Déterminer le sexe des cafards sifflement individuels. Déterminer le sexe de la proéminence de cornes sur les hommes et l’absence de celui-ci, sur les femmes.
- Peser les cafards sifflement individuels. Pour faciliter le pesage d’un cafard sifflant sur la balance, incluez-la dans deux bateaux de pesée qui ont été tarés.
Remarque : Par souci de cohérence entre les expériences, utilisez un sifflement cafards avec un poids de 4 à 8 g. Cependant, aucune différence de survie après l’infection n’ont été trouvés entre petit (1,5 à 2 g) et les grands (6 à 8 g) sifflement cafards. Pour études de médicaments, utiliser un sifflement cafards avec un poids d’environ 5 g pour obtenir une concentration de drogue plus cohérente par corps massive. - Au lieu d’un plat d’eau, incluent l’eau contenu fruits ou légumes, comme une tranche de pomme ou de pommes de terre. Jeter de la nourriture avariée. Ne fournissent pas d’eau pour garder le conteneur sec.
- Retourner un sifflement cafards à 37 ° C jusqu'à ce que les injections.
4. préparations et Culture bactérienne
NOTE : Les espèces bactériennes utilisées dans le présent protocole sont mallei b. pseudomallei b. et b. thailandensis. Toutes les manipulations avec mallei b. et b. pseudomallei doivent être effectuées dans la catégorie II ou enceintes de sécurité biologique de classe III situé à un niveau biosafety (BSL) laboratoire 3. Effectuer des manipulations avec b. thailandensis dans l’enceinte de sécurité biologique similaire armoires situées soit dans un laboratoire BSL2 ou BSL3. Suivez institutionnel mode opératoire normalisé pour travail BSL3. Suivez les lignes directrices pour l’utilisation des équipements de protection individuelle lors de la manipulation des bactéries.
- Préparer un plat principal de Burkholderia au moins 3 jours avant l’infection. Utilisez Luria-Bertani (Lennox) (LB) agar pour b. pseudomallei ou thailandensis b. et utilisation LB agar additionné de 4 % de glycérol pour b. mallei. Bactéries de strie d’un stock de glycérol de 25 % à-80 ° C.
NOTE : Toujours ensemencer le maître directement depuis le stock de glycérol congelés ; éviter la série passage des bactéries de plaque à plaque car cela pourrait causer la virulence réduite. - Inoculer le bouillon de 10 à 20 mL LB avec plusieurs colonies de b. pseudomallei ou thailandensis b. de la plaque de maître. De même, inoculer LB bouillon additionné de 4 % de glycérol pour b. mallei.
- Agiter le bouillon de culture à 175 à 250 tr/min à 37 ° C pendant environ 18 h.
- Centrifuger à 2 à 3 mL de culture à 5 000 x g pendant 10 min.
- Jeter le surnageant et Resuspendre le culot bactérien dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS, 137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4).
- Diluer la bactérie avec du PBS pour atteindre une densité optique (do) de 0,5, mesuré à une absorbance à 600 nm dans un spectrophotomètre.
- En série de diluer les bactéries dix fois en PBS de la do départ de 0,5. Utilisez ces suspensions pour l’infection.
- Déterminer la colonie formant des unités (UFC) de l’inoculum par dilution en série et de placage de 100 µL d’extraits sur milieu gélosé. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 à 48 h.
5. préparations médicamenteuses
- Déterminer la quantité appropriée de médicaments à donner par corps massive. Le dosage CLQ donné à la blatte sifflement était fondé sur la dose normale pour les mammifères, qui est de 50 mg/kg/jour.
- Remettre en suspension ou diluer le médicament d’intérêt dans le véhicule. Par exemple, diluer CLQ dans du PBS à une concentration de 12 mg/mL. Cette concentration offre 300 µg de drogue à un ~ 6 g sifflements injecté de cafard dans un 25 µL volume.
- Si nécessaire, stériliser la solution médicamenteuse en le faisant passer à travers un filtre de seringue 0,22 µm.
- Conserver la solution médicamenteuse à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. Chauffer la solution médicamenteuse au moins 21 ° C (température ambiante) avant les injections.
6. montage de l’injecteur
- Définir le pointeur jusqu’au volume souhaité (25 µL) en tournant la vis de réglage sur une pipette à répétition.
- Poussez le levier de déclenchement de la pipette répétitive et tirez le poussoir. La pipette à répétition est maintenant prête à accueillir une seringue chargée.
NOTE : Calibrer le volume éjecté par la pipette à répétition en mesurant la quantité d’eau éjectée sur une balance. - Remplissez une seringue de 1 mL avec suspension contenant une bactérie ou les drogues.
- Fixer la seringue à une stérile 26 ou 27 G x ½ pouce (ou plus courte) aiguille.
- Tapez sur la seringue pour flotter les bulles d’air vers le haut et expulser les bulles et une suspension dans un récipient rempli d’eau de Javel de 10 %.
- Prenez la seringue sur le clip de la seringue de la pipette à répétition avec le biseau de l’aiguille vers le haut.
- Tirez le levier de déclenchement, puis appuyez sur le bouton du distributeur fermement pour effectuer des injections vides dans un récipient rempli d’eau de Javel 10 % jusqu'à ce que le piston de la seringue est contre le pousseur.
- Effectuer 1 ou 2 injections de vides supplémentaires pour s’assurer que le liquide est éjecté hors de la seringue. La pipette à répétition est prête pour les injections.
7. cafard Injections
- Effectuer toutes les injections de cafard dans une armoire dans un BSL2 de sécurité biologique de classe II ou classe III ou BSL3 réglage à l’aide institutionnelle recommandé des équipements de protection individuelle.
- Nettoyer les surfaces de travail dans l’armoire de sécurité qui peuvent entrer en contact avec les cafards de sifflement. Utiliser 10 % eau de Javel suivie d’éthanol à 70 % pour enlever résidu de javellisant. Laisser la surface à l’air sec.
- D’une main, tenez le cafard sifflant à ses côtés. Immobiliser un cafard sifflant tel qu’il est incapable de recul pendant l’injection. Pliez légèrement le cafard sifflant afin que les membranes cutanées entre les tergites abdominaux sont exposés.
- Avec l’autre main, tenir la pipette répétitive telles que l’aiguille arrive à un 0° d’angle de 30° de la ligne médiane de dorso-ventral de la blatte un sifflement. Perforer la membrane cutanée adjacente à la 3rd, 4èmeou 5ème tergum de l’extrémité postérieure.
NOTE : L’entrée de l’aiguille dans le cafard sifflant à l’angle indiqué veille à ce que l’aiguille ne pas traverser et quitter le cafard sifflant. Le site d’injection garantit que la matière éjectée est contenue dans la cavité abdominale, remplie de l’hémolymphe. Pratique tenant les cafards sifflement et injection d’eau avant les injections de l’entreprise avec des bactéries vivantes ou de la drogue. - Pousser le bouton dispense fermement pour injecter le volume. Retirez doucement l’aiguille sous le même angle que celui utilisé pour l’entrée.
- Placez le cafard sifflant injecté dans un récipient séparé pour distinguer les cafards un sifflement qui n’ont pas encore été injectés. Essuyez toute l’hémolymphe qui peut ont suintait sur le site d’injection.
- Continuer à injecter les autres cafards sifflement au sein d’un groupe à l’aide de la seringue et l’aiguille même. Arrêter l’injection avant que le piston de la seringue n’atteigne le fond du baril afin d’éviter un dosage incomplètes dans la dernière injection.
- Pour les injections multiples dans un seul cafard sifflement, tels que ceux avec des bactéries et des drogues, injecter sur différentes côtés d’un tergum sur la face dorsale des cafards sifflement. Sinon, effectuer des injections multiples en injectant à terga différentes (3rd à 5ème).
- Veiller à ce que les couvercles des conteneurs sont fixées solidement. Renforcer les couvercles avec du ruban adhésif, si nécessaire.
- Incuber les sifflements des cafards dans un incubateur humidifié 37 ° C.
8. enregistrement sifflements cafard morbidité et mortalité
- Effectuer tous les examens de cafard sifflant sous une hotte avec institutionnelle de sécurité biologique de classe II ou classe III recommandé des équipements de protection individuelle. Nettoyer les surfaces dans l’armoire de sécurité avec 10 % de Javel suivie d’éthanol à 70 %. Laissez la zone de travail à l’air sec.
- Marquer un sifflement cafards une ou deux fois par jour sur une période de 1 à 2 semaines à l’aide de la morbidité marquant le tableau (tableau 1).
- Retirez les cafards morts un sifflement et noter le nombre de survivants.
- Transfert en restant vivants sifflements cafards à un récipient propre si l’excès d’humidité s’est accumulée au fond du récipient. Sinon, utiliser un essuie-tout jetable pour essuyer l’excès d’humidité.
- Remplacer la nourriture avariée quotidienne et retour sifflements cafards dans l’incubateur humidifié 37 ° C.
- À la fin de l’étude, placez les survivants restants dans un sac de biohazard et congeler à-80 ° C à euthanasier.
- Analyser statistiquement les données14 pour déterminer la DL50 et par analyse de Kaplan-Meier et Log-Rank pour sa survie. Comme avec tous les insectes expérimentation, certains décès peuvent survenir chez le groupe témoin. Ces décès sont attribués à la mortalité naturelle des insectes 15. Pour une discussion plus détaillée sur la façon de compte pour les décès dans le groupe témoin, consultez référence15.
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Representative Results
Cette section illustre les résultats obtenus lors de cafards sifflant de Madagascar ont été infectées par b. mallei, b. pseudomallei, ou thailandensis b.; les résultats montrent que cet insecte est un modèle animal docile pour différentes espèces de Burkholderia dans l’étude de virulence, la toxicité et l’efficacité du médicament contre les infections bactériennes. Plus de cafards sifflement a survécu dans les groupes qui ont été infectées par les mutants atténués (Δhcp1) que dans les groupes qui ont été infectés avec le type sauvage K96243 de b. pseudomallei , parental b. mallei SR1, ou b. thailandensis () DW503 La figure 1). À l’inverse, infection par des mutants virulentes (Δhcp2 ou Δhcp3) tué les cafards sifflement de la même façon pour le type sauvage b. pseudomallei (Figure 1). Infection avec les mammifères non virulente de Burkholderia thailandensis b. E264 et ses dérivés sensibles aux aminosides DW503, montrent que le modèle de cafard sifflant est particulièrement adapté pour élucider des mutations B. thailandensis qui conduisent à l’atténuation (Figure 2). Ainsi, c’est un modèle animal plus raccord thailandensis b. études que les modèles de rongeurs. Augmentation des concentrations ou des injections multiples de CLQ n’a pas tuer les cafards sifflement ; Cela illustre que toxicité des médicaments peut également être testée dans le modèle de cafard sifflant (Figure 3). En outre, l’efficacité du CLQ contre l’infection à b. thailandensis est illustrée Figure 4. Aspects importants des sifflements soins de cafard et de l’infection sont indiquées à la Figure 5. Tableau 1 peut être utilisé pour marquer la morbidité du sifflement des cafards au cours d’expériences.
Figure 1 : Sifflement de survie cafard après injection avec virulent et atténué Burkholderia . Huit des cafards sifflement par groupe ont été injectés avec 25 µL de la suspension bactérienne. Un sifflement de cafards ont été vérifiés pour la survie une fois par jour pendant 5 jours. (A) sifflement cafards ont été injectés avec parental b. mallei SR1 (place ouverte) ou le mutant dehcp1 Δ (fermé carré) à 100 UFC. (B) sifflement cafards ont été injectés avec wild type K96243 b. pseudomallei (place ouverte), Δhcp1 (fermé carré), Δhcp2 (triangle ouvert), ou Δhcp3 (cercle ouvert) mutant à 10 UFC. (C) sifflement cafards ont été injectés avec parental thailandensis b. DW503 (place ouverte) ou Δhcp1 mutant (fermé carré) à 100 UFC. Figure paru référence 11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Sifflements survie cafard après l’injection de doses croissantes de B. thailandensis pour LD50 détermination. Huit des cafards sifflement par groupe des injections de type sauvage E264 thailandensis b. (A) ou le dérivé sensibles aux aminosides DW503 (B) et la survie a été inscrit pendant 7 jours. La DL50 est 3 UFC pour E264 et 6 UFC pour DW503. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Sifflements survie cafard après injection à la chloroquine. Cinq des cafards sifflement par groupe ont reçu une injection une fois (A) ou deux fois sur deux jours consécutifs (B) avec 250 (diamant), (carré), 500 ou 1 000 µg (triangle) CLQ ou PBS (cercle) et la survie a été marqué pour 7 jours. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Sifflement de survie cafard après infection par le B. thailandensis et traitement par la chloroquine. cafards sifflement de 10 à 12 par groupe ont été infectées par b. thailandensis DW503 traitement (carré), infectées par b. thailandensis DW503 et non traitement avec CLQ ( triangle), traités avec CLQ seul (diamant), ou étaient non infectées et non traitées (cercle). La survie a été enregistrée pendant 7 jours. La courbe de survie, un composite de 4 expériences distinctes, est exprimée comme un pourcentage égal au nombre total des survivants divisé par le nombre total de cafards sifflement pour chaque traitement les jours indiqués. L’inoculum UFC donnés variaient entre 10 et 20 DL50. Figure paru référence 10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Images liées au modèle cafard sifflant. (A) A femelle de sifflements cafard manque saillies sur sa tête. (B) un mâle cafard sifflant peut être identifié par la présence de cornes. (C) un cafard sifflant doit muer hors de son exosquelette de croître. L’insecte émergent est de couleur blanche, mais s’assombrit progressivement comme le nouvel exosquelette durcit. (D) sifflement cafards peut-être être hébergé dans un contenant de plastique bouchon snap avec trous de ventilation pendant une expérience. (E) sous BSL3 conditions, sifflement des cafards sont logées dans la vis bouchon contenants en plastique. (F), une cage de grande souris est utilisée pour abriter une colonie de cafard sifflant. Il devrait contenir des aliments, l’eau et une boîte d’oeufs en carton pour se cacher. (G) sifflement cafards sont injectés avec une seringue de 1 mL attachée à une pipette à répétition. (H) A un sifflement cafard est inoculé par injection à travers la membrane cutanée entre les tergites abdominaux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| 1 | Live, Normal | -activement mobile -capable de saisir et de tenir les doigts en cafard sifflant est ramassé |
| 2 | Vivre, léthargique | -immobile mais les analyses lorsque poussé |
| 3 | Vivre, moribond | -immobile avec jambes rempliés dans -ne bouge pas lorsque poussé -antennes et / ou des jambes se déplacent lorsque poussé |
| 4 | Morte | -immobile avec jambes rempliés dans -antennes ne se déplacent pas lorsque poussé -jambes ne bougent pas lorsque poussé |
Tableau 1 : sifflements morbidité cafard, système de notation. Le score global pour un groupe de blattes sifflement est basé sur le cafard sifflant avec le score le plus élevé dans le groupe.
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Discussion
Les conditions expérimentales optimales commencent par une colonie de cafard sifflant sain, qui exige un minimum mais engagement chronologique cohérente. Bien que les sifflements de cafards peut aller pour une période relativement longue (~ semaines) sans nourriture ni eau, entretien hebdomadaire ou bi-hebdomadaire cage doit être fournie. Cela inclut vérifier la nourriture et l’approvisionnement en eau et d’assurer que la cage soit sèche. Maintien des conditions de vie sec est particulièrement important pendant l’acclimatation et l’incubation à une température plus élevée ; Nous constatons que plus un sifflement cafards meurent et à un rythme plus rapide à des températures plus élevées lorsque les conteneurs n’étaient pas nettoyées tous les jours.
La clé de dosage conforme ou l’inoculation de la blatte sifflement est d’appuyer sur le bouton du distributeur sur la pipette à répétition fermement. Nous vous recommandons de pratiquer cette technique, chargement de la seringue sur la pipette à répétition et la réalisation des injections vides. La plus longue étape de la procédure pour un opérateur de nouveau à la technique est tenue ou immobiliser le cafard sifflant pendant l’injection. Par conséquent, nous recommandons aussi fortement pratiquer la technique de retenir et d’injecter plusieurs cafards sifflement avant de s’attaquer à un projet plus ambitieux. Ceci peut être réalisé en maintenant un petit groupe de cafards un sifflement qui est utilisé exclusivement pour les pratiques d’injection. Bien que nous avons trouvé que l’injection peut être effectuée rapidement lorsque vous tenez le cafard sifflant sur son côtés, d’autres techniques pour les blattes sifflement (p. ex. immobiliser un cafard sifflant sur une surface courbe lisse ; se percher le sifflement de la holding cafard sur le doigt du milieu tandis que l’index et le pouce immobiliser) peut être préférable et devrait être exploré par différents opérateurs.
L’utilisation du modèle cafard sifflant offre plusieurs avantages par rapport aux autres modèles insectes (p. ex. les larves de ver de cire Galleria mellonella et la drosophile Drosophila melanogaster) qui ont été précédemment utilisés comme modèles animaux avec Burkholderia infection 16,17,18. Par exemple, la fenêtre expérimentale pour un cafard sifflant varie entre mois années permettant une flexibilité aux chercheurs, tandis que pour une larve de ver de cire est seulement cinq jours 19,20. Pour une larve de ver de cire, la période de cinq jours coïncide également avec housse cocon ; suppression des cocons est un processus demande beaucoup de travail qui peuvent provoquer des traumatismes physiques aux larves 20. Plus important encore, un mutant thailandensis b. T6SS-1 qui est atténué dans les deux le hamster syrien et le sifflement de la blatte 11, était virulent chez Galleria, suggérant que la Galleria n’est pas un bon modèle pour l’étude des certains mutants comme T6SS dans b. thailandensis (données non présentées).
L’utilisation de la blatte sifflement présente plusieurs avantages par rapport à la mouche à fruit. La blatte sifflement est vaste et d’une masse considérable avec un exosquelette dur qui lui permet d’être facilement manipulés lors des injections. En revanche, la mouche à fruit est petite et a besoin d’équipement spécialisé pour l’inoculation. En outre, tandis que le cafard sifflant naturellement vit dans des températures qui sont similaires à ou dépasse la température du corps humain, la température optimale pour la drosophile est entre 22 et 28 ° C. Ce qui rend les mouches des fruits d’une utilité limitée dans le cadre de l’étude des processus qui dépendent de la température du corps humain (tels que la formation de cellules géantes multi nucléées Burkholderia 10).
Il existe quelques inconvénients à l’usage des sifflements de cafards. La génétique de la blatte sifflement n’est pas étudiée ainsi que ceux de la drosophile ou même Galleria. La blatte sifflement a aussi une substantielle « ick » ou facteur de brut. Toutefois, la blatte sifflement reste un hôte de remplacement viable et attrayante pour Burkholderia en fournissant des avantages évidents pour son utilisation dans la recherche qui sont propres à l’espèce. Comme nous avons montre que le Madagascar sifflements cafard est un hôte de remplacement tractable pour Burkholderia, il est très probable peut servir aussi comme un hôte de remplacement pour les autres bactéries pathogènes et nous utilisons actuellement il dans de telles études.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
J. Chua, N.A. Fisher, D. DeShazer et a.m. Friedlander conçu les procédures décrites dans le manuscrit. J. Chua, N.A. Fisher, S.D. Falcinelli et D. DeShazer effectué les expériences. J. Chua a écrit le manuscrit.
Les auteurs remercient Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, Nicholas R. Carter et Steven A. Tobery pour l’assistance technique excellente et David P. Fetterer et Steven J. Kern pour l’analyse statistique.
Le travaux ont été subventionnés par l’Agence de réduction proposition de défense menace #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F et #CBS. MEDBIO.02.10.rd.034 à D.D.
Opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations sont celles des auteurs et ne sont pas nécessairement endossées par l’armée américaine.
Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les vues ou les politiques du ministère de la défense, ni mentionne des noms commerciaux, des produits commerciaux, ou organisations impliquent l’approbation par le gouvernement américain.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Madagascar hissing cockroach |
Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits, any flavor | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Snap on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Screw on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series repetitive pipette | Dymax Corporation www.dymax.com |
T15469 | |
| Syringe (1 mL) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 or 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Chloroquine diphosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
References
- Sifri, C. D., Ausubel, F. M. Cellular Microbiology. Boquet, P., Cossart, P., Normark, S., Rappuoli, R. , ASM Press. 543-563 (2004).
- Silcock, S. Is your experiment really necessary? New Sci. 134 (1817), 32-34 (1992).
- Muller, U., Vogel, P., Alber, G., Schaub, G. A. The innate immune system of mammals and insects. Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect Immun. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Mulder, P. G., Shufran, A. Madagascar hissing cockroaches, information and care. Oklahoma Cooperative Extension Service Leaflet L-278. , Oklahoma State University. 4 (2016).
- Nelson, M. C., Fraser, J. Sound production in the cockroach, Gromphadorhina portentosa: Evidence for communication by hissing. Behav Ecol Sociobiol. 6 (4), 305-314 (1980).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infect Immun. 85 (1), e0058616 (2017).
- Fisher, N. A., Ribot, W. J., Applefeld, W., DeShazer, D. The Madagascar hissing cockroach as a novel surrogate host for Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis. BMC Microbiol. 12, 117 (2012).
- Haraga, A., West, T. E., Brittnacher, M. J., Skerrett, S. J., Miller, S. I. Burkholderia thailandensis as a model system for the study of the virulence-associated type III secretion system of Burkholderia pseudomallei. Infect Immun. 76 (11), 5402-5411 (2008).
- West, T. E., Frevert, C. W., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonia in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 102 Suppl 1, S119-S126 (2008).
- Finney, D. J. Probit Analysis. , University Press. Cambridge. (1971).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J Am Mosq Control Assoc. 3 (2), 302-303 (1987).
- Schell, M. A., Lipscomb, L., DeShazer, D. Comparative genomics and an insect model rapidly identify novel virulence genes of Burkholderia mallei. J Bacteriol. 190 (7), 2306-2313 (2008).
- Wand, M. E., Muller, C. M., Titball, R. W., Michell, S. L. Macrophage and Galleria mellonella infection models reflect the virulence of naturally occurring isolates of B. pseudomallei, B. thailandensis and B. oklahomensis. BMC Microbiol. 11 (1), 11 (2011).
- Pilatova, M., Dionne, M. S. Burkholderia thailandensis is virulent in Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (11), e49745 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. J Vis Exp. (70), e4392 (2012).
- Eklund, B. E., et al. The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis. PeerJ Preprints. 4, e1524v1522 (2016).
