Madagaskar hvæsende kakerlak som en alternativ ikke-pattedyr dyremodel til at undersøge virulens, patogenese og narkotika virkning
Summary
Vi præsenterer en protokol for at udnytte Madagaskar hvæsende kakerlak som en alternativ ikke-pattedyr dyremodel til at gennemføre bakteriel virulens, patogenese, lægemiddeltoksicitet, drug effektivitet og medfødte immunrespons undersøgelser.
Abstract
Mange aspekter af medfødt immunitet er bevaret mellem pattedyr og insekter. Et insekt, Madagaskar hvæsende kakerlak fra slægten Gromphadorhina, kan udnyttes som en alternativ dyr model for studiet af virulens, vært-patogen interaktion, medfødte immunforsvar og narkotika virkning. Detaljer for opdræt, pleje og opdræt af hvæsende kakerlak leveres. Vi har også illustrere, hvordan det kan være inficeret med bakterier såsom de intracellulære patogener Burkholderia mallei, B. pseudomallei og B. thailandensis. Brug af hvæsende kakerlak er billig og overvinder lovgivningsmæssige spørgsmål beskæftiger sig med brug af pattedyr i forskning. Derudover er resultater fundet ved hjælp af hvæsende kakerlak model reproducerbare og svarende til dem, der opnås ved hjælp af pattedyr modeller. Madagaskar hvæsende kakerlak udgør således, en attraktiv surrogat vært, der skal udforskes, når animalske undersøgelser.
Introduction
Brugen af insekter som alternative ikke-pattedyr dyremodeller at studere bakteriel patogenese og medfødte vært forsvar har været vinder momentum i de seneste år. Logistisk, er dette på grund af deres relativt billige pris og lethed i at opnå, håndtering og pleje af insekter i forhold til pattedyr. Der er også ingen lovgivningsmæssige politik for anvendelse af insekter i forskning; Det er ikke underlagt hører eller begrænsninger fastsat af dyr bruger Udvalget eller regering agentur. Insekter som surrogat dyremodeller er særligt åbne over for omfattende screening undersøgelser for virulens faktorer, vært-patogen interaktioner og vurderinger af anti-mikrobiel stof effektivitet. Deres anvendelse kan reducere antallet af pattedyr anvendes til forskning, således at overvinde nogle af de etiske dilemmaer forbundet med udførelsen af dyreforsøg 1,2.
Insekter kan tjene som surrogat værter, fordi der er en høj grad af ensartethed mellem de medfødte immunforsvar af insekter og pattedyr 1,3. Både insekt plasmatocytes og pattedyr makrofager phagocytosis mikroorganismer 4. Insekt modstykket til neutrofile er hemocyte 5,6. Intracellulære oxidative burst veje i insekt og pattedyrsceller er ens; reaktive ilt arter i begge er produceret af orthologous p47phox og p67phox proteiner 5. De signaling cascades nedstrøms vejafgift receptorer i insekter og Toll-lignende receptorer og Interleukin-1 i pattedyr er også bemærkelsesværdigt ens; begge resultere i produktion af antimikrobielle peptider, som defensins 7. Insekter kan således udnyttes til at studere almindelige medfødte immun mekanismer, der deles af metazoans.
Et insekt kaldet Madagaskar hvæsende kakerlak fra slægten Gromphadorhina, er en af de største kakerlak arter, der findes, typisk nå 5 til 8 cm på modenhed. Det er hjemmehørende kun til øen Madagaskar og er kendetegnet ved den hvislende lyd, det giver – en lyd, der er produceret, når den hvæsende kakerlak ekskluderer luft gennem luftvejene åbninger kaldet Spirakler 8. Den karakteristiske hiss fungerer som en form for social kommunikation blandt hvæsende kakerlakker for frieri og aggression 9 og kan blive hørt, når en mand er forstyrret i sit vækststed. Madagaskar hvæsende kakerlak er langsom bevægelse i forhold til den amerikanske kakerlak og andre bymæssige skadedyr arter. Det er nemt at pleje og opdrætte; en gravid hvæsende kakerlak kan producere 20 til 30 afkom på et tidspunkt. En baby hvæsende kakerlak, kaldet en nymfe, bliver kønsmoden i 5 måneder efter gennemgår 6 molts og kan leve til 5 år, både i naturen og i fangenskab 8.
Vi har udnyttet Madagaskar hvæsende kakerlak som en surrogat vært for infektion med de intracellulære patogener Burkholderia mallei, B. pseudomalleiog B. thailandensis 10,11. Virulens af disse patogener i hvæsende kakerlakker blev sammenlignet med deres virulens i benchmark-dyremodel for Burkholderia, den syriske hamster. Vi fandt, at 50% dødelig dosis (LD50) af B. pseudomallei og B. mallei var ens i begge modeller 11. Interessant, er B. thailandensis, selvom Avirulente i modellen gnavere dødelig i den hvæsende kakerlak 11. Denne forskel med hensyn til B. thailandensis infektion understreger nytten af den hvæsende kakerlak model; B. thailandensis formildende mutanter kan løses mere let i den hvæsende kakerlak end i gnavere modeller. Desuden, som B. thailandensis bruges ofte som model organisme til B. pseudomallei og B. mallei 10,12,13, identificere formildende mutationer i det kunne føre til lignende mål i sine mere virulente slægtninge.
Trods forskellen i virulens i B. thailandensis i den hvæsende kakerlak versus den syriske hamster, mutationer i kritiske virulens faktorer, som dem i type 6 sekretion system-1 (T6SS-1), som formildende i B. mallei og B. pseudomallei, er ligeledes formildende for B. thailandensis 11. Modellens hvæsende kakerlak er yderligere godkendt i den enkelte T6SS mutanter (T6SS-2 T6SS-6) i B. pseudomallei, som ikke har nogen betydning på virulens i syriske hamstere, forbliver virulente i den hvæsende kakerlakker 11. Hvæsende kakerlak er således en levedygtig surrogat dyremodel for de tre Burkholderia arter. Vi for nylig udnyttet den hvæsende kakerlak som en surrogat dyremodel til at undersøge effekten af anti-malaria medicin chloroquin (CLQ) mod Burkholderia infektion 10 og dets giftighed.
Her beskriver vi opdræt og pleje af Madagaskar hvæsende kakerlak og give oplysninger om, hvordan at inficere dette insekt med tre Burkholderia arter. Desuden illustrere vi det hvæsende kakerlak er en levedygtig surrogat model til at studere virulens og medicin effektivitet i Burkholderia infektioner og at det sandsynligvis også kan tjene som en surrogat vært for andre bakterielle patogener i lignende undersøgelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optimal forsøgsbetingelser begynde med en sund hvæsende kakerlak koloni, som kræver en minimal, men sammenhængende tid engagement. Selvom hvæsende kakerlakker kan gå til en relativt lang periode (~ uger) uden mad og vand, ugentlige eller bi-ugentlige bur vedligeholdelse skal oplyses. Dette omfatter kontrol af fødevarer og vandforsyning og sikre, at buret er tør. Opretholde tør levevilkår er især vigtigt i akklimatisering og inkubation ved højere temperaturer; Vi finder, at mere hvæsende kakerlakker dør og h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Chua, N.A. Fisher, D. DeShazer og A.M. Friedlander designet procedurerne i håndskriftet. J. Chua, N.A. Fisher, S.D. Falcinelli og D. DeShazer udført eksperimenter. J. Chua skrev manuskriptet.
Forfatterne takke Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, Nicholas R. Carter og Steven A. Tobery for fremragende teknisk bistand og David P. Fetterer og Steven J. Kern for statistisk analyse.
Arbejdet var støttet af Defense trussel reduktion agenturet forslag #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F og #CBS. MEDBIO.02.10.Rd.034 til D.D.
Meninger, fortolkninger, konklusioner og anbefalinger er dem af forfatterne og nødvendigvis godkendt ikke af den amerikanske hær.
Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis synspunkter eller politikker af Department of Defense, og heller ikke nævner af firmanavne, kommercielle produkter, eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering.
Materials
| Madagascar hissing cockroach |
Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits, any flavor | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Snap on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Screw on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series repetitive pipette | Dymax Corporation www.dymax.com |
T15469 | |
| Syringe (1 mL) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 or 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Chloroquine diphosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
References
- Sifri, C. D., Ausubel, F. M., Boquet, P., Cossart, P., Normark, S., Rappuoli, R. . Cellular Microbiology. , 543-563 (2004).
- Silcock, S. Is your experiment really necessary?. New Sci. 134 (1817), 32-34 (1992).
- Muller, U., Vogel, P., Alber, G., Schaub, G. A. The innate immune system of mammals and insects. Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect Immun. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Mulder, P. G., Shufran, A. Madagascar hissing cockroaches, information and care. Oklahoma Cooperative Extension Service Leaflet L-278. , 4 (2016).
- Nelson, M. C., Fraser, J. Sound production in the cockroach, Gromphadorhina portentosa: Evidence for communication by hissing. Behav Ecol Sociobiol. 6 (4), 305-314 (1980).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infect Immun. 85 (1), e0058616 (2017).
- Fisher, N. A., Ribot, W. J., Applefeld, W., DeShazer, D. The Madagascar hissing cockroach as a novel surrogate host for Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis. BMC Microbiol. 12, 117 (2012).
- Haraga, A., West, T. E., Brittnacher, M. J., Skerrett, S. J., Miller, S. I. Burkholderia thailandensis as a model system for the study of the virulence-associated type III secretion system of Burkholderia pseudomallei. Infect Immun. 76 (11), 5402-5411 (2008).
- West, T. E., Frevert, C. W., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonia in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 102 Suppl 1, S119-S126 (2008).
- Finney, D. J. . Probit Analysis. , (1971).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J Am Mosq Control Assoc. 3 (2), 302-303 (1987).
- Schell, M. A., Lipscomb, L., DeShazer, D. Comparative genomics and an insect model rapidly identify novel virulence genes of Burkholderia mallei. J Bacteriol. 190 (7), 2306-2313 (2008).
- Wand, M. E., Muller, C. M., Titball, R. W., Michell, S. L. Macrophage and Galleria mellonella infection models reflect the virulence of naturally occurring isolates of B. pseudomallei, B. thailandensis and B. oklahomensis. BMC Microbiol. 11 (1), 11 (2011).
- Pilatova, M., Dionne, M. S. Burkholderia thailandensis is virulent in Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (11), e49745 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. J Vis Exp. (70), e4392 (2012).
- Eklund, B. E., et al. The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis. PeerJ Preprints. 4, e1524v1522 (2016).
