Summary
Vi præsenterer en protokol for at udnytte Madagaskar hvæsende kakerlak som en alternativ ikke-pattedyr dyremodel til at gennemføre bakteriel virulens, patogenese, lægemiddeltoksicitet, drug effektivitet og medfødte immunrespons undersøgelser.
Abstract
Mange aspekter af medfødt immunitet er bevaret mellem pattedyr og insekter. Et insekt, Madagaskar hvæsende kakerlak fra slægten Gromphadorhina, kan udnyttes som en alternativ dyr model for studiet af virulens, vært-patogen interaktion, medfødte immunforsvar og narkotika virkning. Detaljer for opdræt, pleje og opdræt af hvæsende kakerlak leveres. Vi har også illustrere, hvordan det kan være inficeret med bakterier såsom de intracellulære patogener Burkholderia mallei, B. pseudomallei og B. thailandensis. Brug af hvæsende kakerlak er billig og overvinder lovgivningsmæssige spørgsmål beskæftiger sig med brug af pattedyr i forskning. Derudover er resultater fundet ved hjælp af hvæsende kakerlak model reproducerbare og svarende til dem, der opnås ved hjælp af pattedyr modeller. Madagaskar hvæsende kakerlak udgør således, en attraktiv surrogat vært, der skal udforskes, når animalske undersøgelser.
Introduction
Brugen af insekter som alternative ikke-pattedyr dyremodeller at studere bakteriel patogenese og medfødte vært forsvar har været vinder momentum i de seneste år. Logistisk, er dette på grund af deres relativt billige pris og lethed i at opnå, håndtering og pleje af insekter i forhold til pattedyr. Der er også ingen lovgivningsmæssige politik for anvendelse af insekter i forskning; Det er ikke underlagt hører eller begrænsninger fastsat af dyr bruger Udvalget eller regering agentur. Insekter som surrogat dyremodeller er særligt åbne over for omfattende screening undersøgelser for virulens faktorer, vært-patogen interaktioner og vurderinger af anti-mikrobiel stof effektivitet. Deres anvendelse kan reducere antallet af pattedyr anvendes til forskning, således at overvinde nogle af de etiske dilemmaer forbundet med udførelsen af dyreforsøg 1,2.
Insekter kan tjene som surrogat værter, fordi der er en høj grad af ensartethed mellem de medfødte immunforsvar af insekter og pattedyr 1,3. Både insekt plasmatocytes og pattedyr makrofager phagocytosis mikroorganismer 4. Insekt modstykket til neutrofile er hemocyte 5,6. Intracellulære oxidative burst veje i insekt og pattedyrsceller er ens; reaktive ilt arter i begge er produceret af orthologous p47phox og p67phox proteiner 5. De signaling cascades nedstrøms vejafgift receptorer i insekter og Toll-lignende receptorer og Interleukin-1 i pattedyr er også bemærkelsesværdigt ens; begge resultere i produktion af antimikrobielle peptider, som defensins 7. Insekter kan således udnyttes til at studere almindelige medfødte immun mekanismer, der deles af metazoans.
Et insekt kaldet Madagaskar hvæsende kakerlak fra slægten Gromphadorhina, er en af de største kakerlak arter, der findes, typisk nå 5 til 8 cm på modenhed. Det er hjemmehørende kun til øen Madagaskar og er kendetegnet ved den hvislende lyd, det giver - en lyd, der er produceret, når den hvæsende kakerlak ekskluderer luft gennem luftvejene åbninger kaldet Spirakler 8. Den karakteristiske hiss fungerer som en form for social kommunikation blandt hvæsende kakerlakker for frieri og aggression 9 og kan blive hørt, når en mand er forstyrret i sit vækststed. Madagaskar hvæsende kakerlak er langsom bevægelse i forhold til den amerikanske kakerlak og andre bymæssige skadedyr arter. Det er nemt at pleje og opdrætte; en gravid hvæsende kakerlak kan producere 20 til 30 afkom på et tidspunkt. En baby hvæsende kakerlak, kaldet en nymfe, bliver kønsmoden i 5 måneder efter gennemgår 6 molts og kan leve til 5 år, både i naturen og i fangenskab 8.
Vi har udnyttet Madagaskar hvæsende kakerlak som en surrogat vært for infektion med de intracellulære patogener Burkholderia mallei, B. pseudomalleiog B. thailandensis 10,11. Virulens af disse patogener i hvæsende kakerlakker blev sammenlignet med deres virulens i benchmark-dyremodel for Burkholderia, den syriske hamster. Vi fandt, at 50% dødelig dosis (LD50) af B. pseudomallei og B. mallei var ens i begge modeller 11. Interessant, er B. thailandensis, selvom Avirulente i modellen gnavere dødelig i den hvæsende kakerlak 11. Denne forskel med hensyn til B. thailandensis infektion understreger nytten af den hvæsende kakerlak model; B. thailandensis formildende mutanter kan løses mere let i den hvæsende kakerlak end i gnavere modeller. Desuden, som B. thailandensis bruges ofte som model organisme til B. pseudomallei og B. mallei 10,12,13, identificere formildende mutationer i det kunne føre til lignende mål i sine mere virulente slægtninge.
Trods forskellen i virulens i B. thailandensis i den hvæsende kakerlak versus den syriske hamster, mutationer i kritiske virulens faktorer, som dem i type 6 sekretion system-1 (T6SS-1), som formildende i B. mallei og B. pseudomallei, er ligeledes formildende for B. thailandensis 11. Modellens hvæsende kakerlak er yderligere godkendt i den enkelte T6SS mutanter (T6SS-2 T6SS-6) i B. pseudomallei, som ikke har nogen betydning på virulens i syriske hamstere, forbliver virulente i den hvæsende kakerlakker 11. Hvæsende kakerlak er således en levedygtig surrogat dyremodel for de tre Burkholderia arter. Vi for nylig udnyttet den hvæsende kakerlak som en surrogat dyremodel til at undersøge effekten af anti-malaria medicin chloroquin (CLQ) mod Burkholderia infektion 10 og dets giftighed.
Her beskriver vi opdræt og pleje af Madagaskar hvæsende kakerlak og give oplysninger om, hvordan at inficere dette insekt med tre Burkholderia arter. Desuden illustrere vi det hvæsende kakerlak er en levedygtig surrogat model til at studere virulens og medicin effektivitet i Burkholderia infektioner og at det sandsynligvis også kan tjene som en surrogat vært for andre bakterielle patogener i lignende undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. præparater for at opretholde en hvæsende kakerlak koloni
- Forberede bure for de hvæsende kakerlakker at leve. Påfør et tyndt lag vaseline, ca 20-30 mm i bredden, at omkredsen af de indre vægge nær toppen af buret til at forhindre de hvæsende kakerlakker fra klatring ud af buret og undslippe.
Bemærk: Hvæsende kakerlakker kan være anbragt i en række forskellige containere, der har et stort gulvareal, er af tilstrækkelig højde, og har låg. Bruge musen bure (~ 43 cm x 23 cm x 20 cm). For bure til 37 ° C, gælde ikke vaseline. - Omfatte en pap æggebakke placeret hovedet inde i buret til at give et skjulested for de naturligt genert insekter. Ikke erstatte pap æg karton med en lavet af polystyrenskum at undgå indtagelse af plast.
- Give ikke sengetøj, lettere oprydning og at øge synligheden af nyklækkede nymfer.
- Få tør hundemad, der indeholder en sammensætning af ~ 20% råprotein. Groft slibe hundemad med en foodprocessor eller blender og opbevares ved 4 ° C.
- Få flere lavvandede retter og akvariet sten eller en svamp til mad og vand.
Bemærk: petriskåle er anbefalet.
2. hvæsende kakerlak pleje og opdragelse
- Få outbred Madagaskar hvæsende kakerlakker (~ 5 cm) fra en kommerciel avlsdyr. De arter, der anvendes i denne protokol er Gromphadorhina laevigata. Pak forsendelseskassen indeholdende de hvæsende kakerlakker straks ved modtagelsen.
- Følg passende institutionelle retningslinjer for brug af personlige værnemidler i håndtering af dyr.
Bemærk: Brug tykke engangshandsker til håndtering kakerlakker som tarsal kløer af en hvæsende kakerlak er skarpe. - Overføre op til 75 store hvæsende kakerlakker (> 3 cm) pr. stort bur. Overfør de nyligt udklækkede og mindre nymfer (< 3 cm) til en separate bur.
Bemærk: At holde betydeligt mere end 75 store hvæsende kakerlakker pr. mus bur kan føre til forringet helbred af kolonien og vil desuden kunne resultere i dødsfald. - Håndtere en nyligt molted kakerlak, som er off-white farve, blidt og undgå at klemme den. Alternativt, tillade exoskeleton mørkere og hærde før håndtering.
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at fjerne mider, Gromphadorholaelaps schaeferi, der ofte ledsager hvæsende kakerlakker efter modtagelse fra opdrættere. De gavnlige mider holde de hvæsende kakerlakker ren og uskadelige for mennesker. - Feed hvæsende kakerlakker med jorden tør hundemad i en dyb tallerken en gang eller to gange om ugen. Give nok hundemad for at de hvæsende kakerlakker få nok mad indtil den næste fodring. Kassér alle fødevarer, der er blevet vådt og muggent.
- Ud over hundemad, give cut-up frugter og grøntsager såsom æbler, kartofler eller salat, i en dyb tallerken. Kassér mugne eller rådne mad.
- Levere drikkevand en gang eller to gange om ugen i en dyb tallerken, men fyld ikke for meget fad for at forhindre spild i buret. Sted enten lille akvarium sten eller en svamp i fadet at give en landing pad for små nymfer. Bruge omvendt osmosevand, hvis den er tilgængelig.
- Holde hvæsende kakerlakker i mørke ved temperaturer fra 21 ° C til 30 ° C. Holde store hvæsende kakerlakker bestemt til eksperimenter ved en lavere temperatur (~ 21 ° C) til ~ 2 måneder at nedsætte avl og graviditet. Derimod holde nymfer ved højere temperaturer (28 ° C til 30 ° C) for at fremskynde væksten.
Bemærk: Hold bure ved stuetemperatur (21 ° C) i en mørk kabinet. - Give fugtighed ved at inkludere en separat gryde med vand, hvis hvæsende kakerlakker holdes i en inkubator.
- Ren buret ved øse ud tør afføring regelmæssigt eller ved at overføre hvæsende kakerlakker til en ren buret hver 2-3 uger. Holde bunden af buret tørt. Ren buret straks, hvis overskydende vand er tilladt at akkumulere og bland med ekskrementer på bunden af buret.
3. kakerlak forberedelse for eksperimenter
- Overføre det passende antal hvæsende kakerlakker i et bur til en 37 ° C befugtet kuvøse 1 til 3 uger før et eksperiment til akklimatisering. Omfatte en kontrolgruppe til injektion. Denne akklimatisering periode er afgørende for at undgå temperatur chok under eksperimenter.
- Gælde ikke vaseline til bure bestemt til 37 ° C, fordi den højere temperatur smelter gelé.
- Tjek de hvæsende kakerlakker hver 1 til 2 dage for at erstatte mad og vand og rengør buret.
- Få klar engangs plast mad containere med låg til at gruppere de hvæsende kakerlakker under eksperimenter. For ventilation, punch huller i låget eller på siden af beholderen med et søm og hammer.
Bemærk: Brug skruelåg containere over snap cap containere i biosikkerhed niveau 3 indstilling. Snap cap containere kan styrkes med tape, hvis nødvendigt. - På dagen for injektion, distribuere 6 til 12 akklimatiserede hvæsende kakerlakker i grupper pr. beholder, sikre ligelig fordeling af sex og kropsmasse.
- Bestemme kønnet på individuelle hvæsende kakerlakker. Fastslå køn ved fremtrædende horn fandt på hanner og manglende heraf på hunner.
- Veje de enkelte hvæsende kakerlakker. For at lette vejning af en hvæsende kakerlak på balancen, skal du vedlægge det i to veje både, der har været tareret.
Bemærk: For sammenhængen mellem eksperimenter, bruge hvæsende kakerlakker med en vægt på 4-8 g. Dog ingen forskel i overlevelse efter infektion er fundet mellem små (1,5 til 2 g) og store (6-8 g) hvæsende kakerlakker. For drug undersøgelser, bruge hvæsende kakerlakker med en vægt på ~ 5 g for at opnå en mere ensartet drug koncentration pr. organ masse. - I stedet for en vand parabol, omfatte høj vand indhold frugt eller grøntsager, såsom en skive æble eller kartoffel. Kassér rådne mad. Give ikke ekstra vand for at holde beholderen tør.
- Tilbagevenden hvæsende kakerlakker til 37 ° C indtil injektioner.
4. Bakteriers kultur og præparater
Bemærk: De bakterielle arter, der anvendes i denne protokol er B. mallei, B. pseudomallei og B. thailandensis. Alle manipulationer med B. mallei og B. pseudomallei skal udføres i klasse II eller klasse III biologiske sikkerhed kabinetter placeret i en biosikkerhed niveau (BSL) 3 laboratorium. Udføre manipulationer med B. thailandensis i lignende biologiske sikkerhed kabinetter beliggende enten i et BSL2 eller BSL3 laboratorium. Følg institutionelle standardprocedure for BSL3 arbejde. Følg institutionelle retningslinjerne for brug af personlige værnemidler, når du håndterer bakterier.
- Forberede en master plade af Burkholderia mindst 3 dage før infektionen. Bruge Luria-Bertani (Lennox) (LB) agar for B. pseudomallei og B. thailandensis og brug LB agar suppleret med 4% glycerol til B. mallei. Streak bakterier fra en 25% glycerol bestand opbevares ved-80 ° C.
Bemærk: Altid streak master pladen direkte fra det frosne glycerol materiel; undgå seriel passage af bakterier fra plade til plade som dette kan medføre reduceret virulens. - Podes 10-20 mL LB bouillon med adskillige kolonier af B. pseudomallei og B. thailandensis fra master pladen. Tilsvarende podes LB bouillon suppleret med 4% glycerol til B. mallei.
- Ryst bouillon kultur på 175-250 rpm ved 37 ° C i ~ 18 h.
- Der centrifugeres 2 til 3 mL af kultur på 5.000 x g i 10 min.
- Supernatanten og resuspenderes bakteriel i sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4).
- Fortynd bakterier med PBS til at opnå en optisk densitet (OD) på 0,5, målt på en absorbans på 600 nm i et spektrofotometer.
- Seriefremstillede fortyndes bakterier billeddetaljerne i PBS fra start OD af 0,5. Brug disse suspensioner for infektion.
- Bestemme koloni danner enheder (CFU) af inokulat ved seriel fortynding og overfladebelægning af 100 µL delprøver på agar medier. Inkuber plader ved 37 ° C i 24-48 timer.
5. medicin præparater
- Bestemme den passende mængde stof gives pr. organ masse. CLQ dosis gives til den hvæsende kakerlak var baseret på den standard dosis for pattedyr, der er 50 mg/kg/dag.
- Resuspend eller fortyndes stof af interesse i køretøjet. For eksempel, fortyndes CLQ i PBS ved en koncentration på 12 mg/mL. Denne koncentration giver 300 µg af stof til en ~ 6 g hvæsende kakerlak i en 25 µL injiceres volumen.
- Hvis det er nødvendigt, at sterilisere drug løsning ved, at det gennem et 0,22 µm sprøjte filter.
- Gemme drug løsning ved 4 ° C indtil brug. Varm drug løsning på mindst 21 ° C (stuetemperatur) før injektioner.
6. montering af injektoren
- Sæt markøren til den ønskede mængde (25 µL) ved at dreje justeringsskrue på gentagne pipette.
- Skubbe baren frigivelse af de gentagne pipette indad og trække pusher udad. De gentagne pipette er nu klar til at rumme en fyldt sprøjte.
Bemærk: Kalibrere volumen bortvist af de gentagne pipette ved at måle mængden af vand skubbet ud på en balance. - Fyld en 1 mL sprøjte med suspension indeholder enten bakterier eller stof.
- Fastgør sprøjte til en steril 26 eller 27 G x ½ tomme (eller kortere) nål.
- Tryk på sprøjten for at flyde luftbobler til toppen og udvise boblerne og nogle suspension i en container fyldt med 10% blegemiddel.
- Fastgør sprøjte på sprøjten klip af den gentagne pipette med nål facet opad.
- Trække linjen release udad og tryk på knappen dispenser fast til at udføre Tom injektioner i en container fyldt med 10% blegemiddel, indtil sprøjten stemplet er imod pusher.
- Udføre 1 eller 2 ekstra blank injektioner at sikre væske skubbes ud af sprøjten. De gentagne pipette er klar til injektioner.
7. kakerlak injektioner
- Udføre alle kakerlak injektioner i en klasse II eller klasse III biologiske sikkerhed kabinet i et BSL2 eller BSL3 indstilling ved hjælp af institutionelle anbefalet personlige værnemidler.
- Ren arbejde overflader i sikkerhed kabinet, der kan komme i kontakt med de hvæsende kakerlakker. Bruge 10% blegemiddel efterfulgt af 70% ethanol til at fjerne resterende blegemiddel. Tillad overflade til luft tørre.
- Med den ene hånd, greb den hvæsende kakerlak ved sin side. Immobilisere en hvæsende kakerlak, således at det ikke er i stand til rekyl under injektion. Bøj den hvæsende kakerlak lidt, så de kutane membraner mellem de abdominale terga udsættes.
- Med anden hånden, holde den gentagne pipette sådan, at nålen er på en 0° 30° vinkel fra dorso-ventrale midterlinjen af hvæsende kakerlak. Punktere den kutane membran støder op til de 3rd, 4thog 5th tergum fra den bageste ende.
Bemærk: Posten af nålen ind i den hvæsende kakerlak på vinklen angivet sikrer, at nålen ikke gå igennem og afslutte den hvæsende kakerlak. Injektionsstedet sikrer, at de skubbes ud materiale er indeholdt i bughulen fyldt med hemolymph. Praksis holder de hvæsende kakerlakker og indsprøjtning med vand før virksomheden injektioner med levende bakterier eller stof. - Tryk på dispensere for fast at injicere volumen. Forsigtigt trække nålen i den samme vinkel som bruges for posten.
- Placer den injicerede hvæsende kakerlak i en separat beholder at skelne det fra de hvæsende kakerlakker, der endnu ikke er blevet injiceret. Aftørre en hemolymph, der kan have sivede ud fra injektionsstedet.
- Fortsat indsprøjtning andre hvæsende kakerlakker inden for en gruppe ved hjælp af samme sprøjte og kanyle. Stop indsprøjte før sprøjte stemplet når bunden af tønde til at forebygge ufuldstændige dosering i den sidste injektion.
- For flere injektioner i en enkelt hvæsende kakerlak, såsom dem med bakterier og narkotika, injiceres på forskellige sider af en tergum på den dorsale side af de hvæsende kakerlakker. Alternativt kan du udføre flere injektioner ved at indsprøjte på forskellige terga (3rd til 5th).
- Sikre, at lågene af containerne er sikkert fastgjort. Styrke låg med tape, hvis nødvendigt.
- Inkuber hvæsende kakerlakker i en fugtig 37 ° C inkubator.
8. optagelse hvæsende kakerlak sygelighed og dødelighed
- Udføre alle hvæsende kakerlak undersøgelser i en klasse II eller klasse III biologiske sikkerhed kabinet med institutionelle anbefalet personlige værnemidler. Rengøre overflader i sikkerhed kabinet med 10% blegemiddel efterfulgt af 70% ethanol. Tillad arbejdsområde til luft tørre.
- Score hvæsende kakerlakker én eller to gange dagligt over en periode på 1 til 2 uger ved hjælp af sygelighed scoring tabel (tabel 1).
- Fjerne døde hvæsende kakerlakker fra beholderen og registrerer antallet af overlevende.
- Overføre, resterende live hvæsende kakerlakker til en ren beholder, hvis overskydende fugt har akkumuleret i bunden af beholderen. Alternativt kan du bruge engangs papirhåndklæder til at aftørre overskydende fugt.
- Erstatte rådne mad dagligt og retur hvæsende kakerlakker at befugtet 37 ° C inkubator.
- I slutningen af undersøgelse, læg overlevende i en biohazard pose og fryse ved-80 ° C til at aflive.
- Statistisk analysere data14 Bestem LD50 og af Kaplan-Meier og Log-Rank analyse for overlevelse. Som med alle insekt eksperimenter, kan nogle dødsfald forekomme i kontrolgruppen. Disse dødsfald er tilskrevet den naturlige dødelighed af insekter 15. For en mere detaljeret diskussion om hvordan man konto for dødsfald i kontrolgruppen, se reference15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit illustrerer de resultater, der blev indhentet når Madagaskar hvæsende kakerlakker var smittet med B. mallei, B. pseudomallei, eller B. thailandensis; resultaterne viser, at dette insekt er en tractable dyremodel for forskellige arter af Burkholderia i at studere virulens, lægemiddeltoksicitet og narkotika virkning mod bakteriel infektion. Flere hvæsende kakerlakker overlevede i grupper, der var smittet med de svækkede mutanter (Δhcp1) end i grupper, der var smittet med vildtype B. pseudomallei K96243, forældrenes B. mallei SR1 eller B. thailandensis () DW503 Figur 1). Omvendt, infektion med ondskabsfulde mutanter (Δhcp2 eller Δhcp3) dræbt de hvæsende kakerlakker ligeledes til vildtype B. pseudomallei (figur 1). Infektion med den Avirulente Burkholderia pattedyrarter, B. thailandensis E264 og dens aminoglycosid følsomme afledte DW503, viser, at den hvæsende kakerlak model er særligt egnede til at belyse mutationer i B. thailandensis der fører til dæmpning (figur 2). Det er således en mere montering-dyremodel for B. thailandensis undersøgelser end gnavere modeller. Stigende koncentrationer eller flere injektioner af CLQ dræbe ikke de hvæsende kakerlakker; Dette illustrerer, at lægemiddeltoksicitet kan også blive testet i den hvæsende kakerlak model (figur 3). Yderligere, effektiviteten af CLQ mod B. thailandensis infektion er vist i figur 4. Vigtige aspekter af hvæsende kakerlak pleje og infektion er vist i figur 5. Tabel 1 kan bruges til at score morbiditet hvæsende kakerlakker under eksperimenter.
Figur 1: Hvæsende kakerlak overlevelse efter injektion med virulente og svækkede Burkholderia . Otte hvæsende kakerlakker pr. gruppe blev sprøjtet med 25 µL af bakteriel suspension. Hissing cockroaches blev kontrolleret for overlevelse en gang om dagen i 5 dage. (A) Hissing cockroaches blev sprøjtet med forældrenes B. mallei SR1 (åben firkant) eller Δhcp1 mutant (lukket firkantet) på 100 CFUs. (B) Hissing cockroaches blev sprøjtet med vildtype B. pseudomallei K96243 (åben square), Δhcp1 (lukket kvadrat), Δhcp2 (åben trekant), eller Δhcp3 (åben kreds) mutant på 10 CFUs. (C) Hissing cockroaches blev sprøjtet med forældrenes B. thailandensis DW503 (åben firkant) eller Δhcp1 mutant (lukket firkantet) på 100 CFUs. Figur oprindeligt udgivet i reference 11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Hvæsende kakerlak overlevelse efter injektion af stigende koncentrationer af B. thailandensis for LD50 bestemmelse. Otte hvæsende kakerlakker pr. gruppe blev sprøjtet med vildtype B. thailandensis E264 (A) eller den aminoglycosid følsomme afledte DW503 (B) og overlevelse blev scoret til 7 dage. LD-50 er 3 CFUs for E264 og 6 CFUs for DW503. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Hvæsende kakerlak overlevelse efter injektion med Klorokin. Fem hvæsende kakerlakker pr. gruppe var injiceres en gang (A) eller to gange på to på hinanden følgende dage (B) med 250 (diamant), 500 (firkantet), eller 1000 µg (trekant) CLQ eller PBS (cirkel) og overlevelse blev scoret til 7 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Hvæsende kakerlak overlevelse efter infektion med B. thailandensis og behandling med Klorokin. 10 til 12 hvæsende kakerlakker pr. gruppe var smittet med B. thailandensis DW503 og ikke behandlet (kvadratisk), inficeret med B. thailandensis DW503 og behandlet med CLQ ( trekant), behandles med CLQ alene (diamant), eller var inficerede og ubehandlet (cirkel). Overlevelse blev optaget i 7 dage. Overlevelse kurven, sammensat af 4 separate eksperimenter, er udtrykt som en procentdel svarende til det samlede antal overlevende divideret med det samlede antal hvæsende kakerlakker for hver behandling på dagene er angivet. CFU inokulum givet varierede fra 10 til 20 LD50. Figur oprindeligt udgivet i reference 10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Billeder relateret til modellens hvæsende kakerlak. (A) A kvinde hvæsende kakerlak mangler fremspring på hovedet. (B) en mandlig hvæsende kakerlak kan identificeres ved tilstedeværelsen af horn. (C) en hvæsende kakerlak skal molt ud af sin exoskeleton til at vokse. Den nye insekt er hvide i farve, men mørkere gradvist som den nye exoskeleton hærder. (D) hvæsende kakerlakker kan være anbragt i en snap hætten plastikbeholder med ventilationshuller under et eksperiment. (E) Under BSL3 betingelser, hvæsende kakerlakker er opstaldet i skrue cap plastbeholdere. (F) A store mus bur er brugt til at huse en hvæsende kakerlak koloni. Det bør indeholde mad, vand og en pap æggebakke til Skjul. (G) Hissing cockroaches er indsprøjtet med en 1 mL sprøjte knyttet til gentagne pipette. (H) A hvæsende kakerlak er podet ved injektion gennem kutane membranen mellem de abdominale terga. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 1 | Live, Normal | -aktivt mobile -kunne forstå og holde fast i fingrene når hvæsende kakerlak er afhentet |
| 2 | Live, sløv | -immobile men kravler når prodded |
| 3 | Live, døende | -immobile med ben gemt -bevæger sig ikke når prodded -antenner og / eller ben flytte når prodded |
| 4 | Døde | -immobile med ben gemt -antenner ikke flytte når prodded -ben ikke bevæger sig når prodded |
Tabel 1: hvæsende kakerlak sygelighed pointsystem. Den samlede score for en gruppe af hvæsende kakerlakker er baseret på den hvæsende kakerlak med den højeste score i gruppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimal forsøgsbetingelser begynde med en sund hvæsende kakerlak koloni, som kræver en minimal, men sammenhængende tid engagement. Selvom hvæsende kakerlakker kan gå til en relativt lang periode (~ uger) uden mad og vand, ugentlige eller bi-ugentlige bur vedligeholdelse skal oplyses. Dette omfatter kontrol af fødevarer og vandforsyning og sikre, at buret er tør. Opretholde tør levevilkår er især vigtigt i akklimatisering og inkubation ved højere temperaturer; Vi finder, at mere hvæsende kakerlakker dør og hurtigere ved højere temperaturer når beholdere ikke var rengøres dagligt.
Nøglen til sammenhængende dosering eller podning af hvæsende kakerlak er at trykke på knappen dispenser på den gentagne pipette fast. Vi anbefaler praktiserer denne teknik, påfyldning af sprøjten på den gentagne pipette og udførelse af Tom injektioner. Den mest tidskrævende trin i proceduren for luftfartsforetagendet nye til teknik bedrift eller immobilisere den hvæsende kakerlak under injektion. Derfor, vi også varmt anbefale øver teknik til holding og tilføre flere hvæsende kakerlakker før håndtering af et mere ambitiøst projekt. Dette kan opnås ved at fastholde en lille gruppe af hvæsende kakerlakker, der bruges udelukkende til injektion praksis. Selv om vi har fundet, at injektion kan udføres hurtigt, når bedriften den hvæsende kakerlak på sin side, andre teknikker til bedriften hvæsende kakerlakker (f.eks. immobilisere en hvæsende kakerlak på en glat buet overflade; siddende den hvislende kakerlak på den midterste finger mens pegefinger og tommelfinger immobilisere det) kan være foretrukne og bør undersøges af forskellige operatører.
Brugen af den hvæsende kakerlak model giver flere fordele sammenlignet med andre insekt modeller (fx voks orm larve barciak og bananfluen Drosophila melanogaster), der tidligere har været brugt som dyremodeller med Burkholderia infektion 16,17,18. Eksempelvis spænder vinduet eksperimentelle for en hvæsende kakerlak fra måneder til år giver mulighed for fleksibilitet for forskerne, der for en voks orm larve er kun fem dage 19,20. For en voks orm larve, fem dages periode falder også sammen med cocoon encasement; fjernelse af kokoner, der er en arbejdsintensive proces, der kan forårsage fysiske traumer til larver 20. Endnu vigtigere, en B. thailandensis T6SS-1-mutant, der er svækket i både den syriske hamster og de hvæsende kakerlak 11, var virulente i Galleria, tyder på, at Galleria ikke er en god model for studiet af nogle mutanter som T6SS i B. thailandensis (data ikke vist).
Brugen af hvæsende kakerlak præsenterer flere fordele i forhold til bananfluen. Hvæsende kakerlak er store og af en betydelig kropsmasse med en hård exoskeleton, der gør det muligt at være let håndteres under injektioner. I modsætning hertil frugt flue er små og kræver specialudstyr til podning. Også, mens den hvæsende kakerlak naturligvis bor i temperaturer, der svarer til eller overstiger menneskelige kropstemperatur, den optimale temperatur for bananfluen er mellem 22 til 28 ° C. Dette gør bananfluen for begrænsede anvendelse i forbindelse med at studere processer, der er afhængige af menneskers kropstemperatur (såsom multi nucleated kæmpe celle dannelse i Burkholderia 10).
Nogle ulemper til brugen af hvæsende kakerlakker eksisterer. Genetik af hvæsende kakerlak er ikke så godt undersøgt som Drosophila eller endda Galleria. Hvæsende kakerlak har også en betydelig "ick" eller brutto-faktor. Hvæsende kakerlak er imidlertid fortsat et attraktivt og levedygtigt surrogat vært for Burkholderia ved at give klare fordele dets anvendelse i forskning, der er unikke for arten. Som vi har illustreret, med Madagaskar hvæsende kakerlak er en tractable surrogat vært for Burkholderia, kan det meget sandsynligt også tjene som en surrogat vært for andre bakterielle patogener og i øjeblikket bruger vi det i sådanne undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
J. Chua, N.A. Fisher, D. DeShazer og A.M. Friedlander designet procedurerne i håndskriftet. J. Chua, N.A. Fisher, S.D. Falcinelli og D. DeShazer udført eksperimenter. J. Chua skrev manuskriptet.
Forfatterne takke Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, Nicholas R. Carter og Steven A. Tobery for fremragende teknisk bistand og David P. Fetterer og Steven J. Kern for statistisk analyse.
Arbejdet var støttet af Defense trussel reduktion agenturet forslag #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F og #CBS. MEDBIO.02.10.Rd.034 til D.D.
Meninger, fortolkninger, konklusioner og anbefalinger er dem af forfatterne og nødvendigvis godkendt ikke af den amerikanske hær.
Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis synspunkter eller politikker af Department of Defense, og heller ikke nævner af firmanavne, kommercielle produkter, eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Madagascar hissing cockroach |
Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits, any flavor | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Snap on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Screw on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series repetitive pipette | Dymax Corporation www.dymax.com |
T15469 | |
| Syringe (1 mL) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 or 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Chloroquine diphosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
References
- Sifri, C. D., Ausubel, F. M. Cellular Microbiology. Boquet, P., Cossart, P., Normark, S., Rappuoli, R. , ASM Press. 543-563 (2004).
- Silcock, S. Is your experiment really necessary? New Sci. 134 (1817), 32-34 (1992).
- Muller, U., Vogel, P., Alber, G., Schaub, G. A. The innate immune system of mammals and insects. Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect Immun. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Mulder, P. G., Shufran, A. Madagascar hissing cockroaches, information and care. Oklahoma Cooperative Extension Service Leaflet L-278. , Oklahoma State University. 4 (2016).
- Nelson, M. C., Fraser, J. Sound production in the cockroach, Gromphadorhina portentosa: Evidence for communication by hissing. Behav Ecol Sociobiol. 6 (4), 305-314 (1980).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infect Immun. 85 (1), e0058616 (2017).
- Fisher, N. A., Ribot, W. J., Applefeld, W., DeShazer, D. The Madagascar hissing cockroach as a novel surrogate host for Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis. BMC Microbiol. 12, 117 (2012).
- Haraga, A., West, T. E., Brittnacher, M. J., Skerrett, S. J., Miller, S. I. Burkholderia thailandensis as a model system for the study of the virulence-associated type III secretion system of Burkholderia pseudomallei. Infect Immun. 76 (11), 5402-5411 (2008).
- West, T. E., Frevert, C. W., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonia in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 102 Suppl 1, S119-S126 (2008).
- Finney, D. J. Probit Analysis. , University Press. Cambridge. (1971).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J Am Mosq Control Assoc. 3 (2), 302-303 (1987).
- Schell, M. A., Lipscomb, L., DeShazer, D. Comparative genomics and an insect model rapidly identify novel virulence genes of Burkholderia mallei. J Bacteriol. 190 (7), 2306-2313 (2008).
- Wand, M. E., Muller, C. M., Titball, R. W., Michell, S. L. Macrophage and Galleria mellonella infection models reflect the virulence of naturally occurring isolates of B. pseudomallei, B. thailandensis and B. oklahomensis. BMC Microbiol. 11 (1), 11 (2011).
- Pilatova, M., Dionne, M. S. Burkholderia thailandensis is virulent in Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (11), e49745 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. J Vis Exp. (70), e4392 (2012).
- Eklund, B. E., et al. The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis. PeerJ Preprints. 4, e1524v1522 (2016).
