שיטות ניתוח ההשפעות של אורניום טבעי על במבחנה Osteoclastogenesis

Summary

אורניום ידוע להשפיע על מטבוליזם העצם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמטרתו לחקור את ההשפעה של חשיפה אורניום טבעי על הכדאיות את הבידול, את הפונקציה של osteoclasts, התאים האחראי על ספיגת עצם.

Abstract

אורניום הוכח להתערב עם עצם פיזיולוגיה, היא מבוססת היטב כי המתכת שמצטבר העצם. עם זאת, מעט מאוד ידוע על ההשפעה של אורניום טבעי על ההתנהגות של תאי עצם. בפרט, ההשפעה של אורניום על osteoclasts, האחראי ספיגת המטריקס העצם, התאים לא מתועדים. לחקור בנושא, הקמנו פרוטוקול חדש באמצעות uranyl אצטט כמו מקור של אורניום טבעי לבין הקו תא 264.7 גלם מאתר כמודל של אוסטאוקלסט סימנים מקדימים. במסמך זה, אנחנו מפורט כל מבחני נדרש לבחון את האורניום cytotoxicity על סימנים מקדימים אוסטאוקלסט וכדי להעריך את ההשפעה שלו על osteoclastogenesis ועל הפונקציה resorbing של osteoclasts בוגרת. התנאים פיתחנו, בפרט עבור הכנת המכילות uranyl תרבות המדיה, זריעה של RAW 264.7 תאים לאפשר להשיג תוצאות הרבייה מאוד ואמין. יתר על כן, לנו יש אופטימיזציה השימוש של כלי תוכנה כדי להקל על הניתוח של פרמטרים שונים כגון הגודל של osteoclasts או האחוז של מטריקס resorbed.

Introduction

אורניום הוא יסוד רדיואקטיבי טבעי נוכח קרקעות, אוויר ומים; ככזה, בבעלי חיים ובבני אדם חשופים אורניום טבעי בדיאטה שלהם. בנוסף למקורות טבעיים, אורניום מקורו של פעילויות אנתרופוגניים, אשר יגבירו את השפע שלה בסביבה. אורניום מהווה סיכונים כימיים והן רדיולוגית. עם זאת, מכיוון אורניום טבעי (אשר הוא איזוטרופי תערובת המכילה 99.27% ²³⁸U, 0.72% ²³⁵U, ו 0.006% ²³⁴U) יש פעילות ספציפית נמוכה (25.10³ Bq.g^-1), שלה השפעות על בריאות מיוחסות שלה כמות רעילה.

מה תוואי כניסה (שאיפה, בליעה או חשיפה עורי), רובם של אורניום הנכנסים לגוף חוסלה עם צואה ומגיע רק חלק קטן של מחזור מערכתי. כ- 67% אורניום בדם בתורו מסוננת על-ידי הכליות, עוזבת את הגוף בשתן בתוך 24 שעות¹. השארית מופקד בעיקר כליות, עצמות, את שני איברי המטרה העיקרית של אורניום רעילות^2,3,4. כי השלד זוהה כאתר העיקרי של אורניום לטווח ארוך שמירה^2,3,4,5,6, מספר מחקרים נערכו על מנת לחקור ההשפעה של אורניום על עצם פיזיולוגיה⁷.

העצם היא רקמה mineralized זה הוא השתקם באופן רציף לאורך כל תקופת חייו. שיפוץ העצם הוא תהליך מורכב זה תלוי סוגי תאים מיוחדים והיא מורכבת בעיקר בשני שלבים: ספיגת המטריקס ישן הקיימת מראש על ידי osteoclasts ואחריו de novo עצם הבנייה על ידי תאי העצם. Osteoclasts הם תאים גדולים multinuclear הנובע הפיוז’ן של תאים קודמן ממוצא hematopoietic נודדים לאתרים resorption שבו הם לצרף העצם⁸. ההחזקה שלהם מתרחשת בו זמנית עם רה-ארגון נרחב של שלד התא שלהם⁹. הארגון מחדש נדרש להקמת תא מבודד בין התא לבין השטח העצם אשר לתוכו אוסטאוקלסט מפריש פרוטונים, שמוביל פירוק היידרוקסיאפטיט, פרוטאזות מעורב מהשפלת מטריקס אורגני. המוצרים השפלה וכתוצאה מכך endocytosed, מועבר דרך התא אל אזור ממברנה מול פני העצם, מופרש, תהליך הנקרא transcytosis^10,11.

תוצאות ממחקרים ב- vivo ו- in vitro לקשרי מצביעים על כך אורניום מעכב היווצרות העצם הפיצולים המספר וכן את פעילותם של תאי העצם^7,12. לעומת זאת, ההשפעות של אורניום על ספיגת עצם של osteoclasts נחקרו בצורה גרועה מספר ויוו מחקרים דיווחו על שיפור של ספיגת עצם לאחר מתן של חנקת uranyl^13,של עכברים או חולדות-¹⁴. יתר על כן, חקירה אפידמיולוגיים הציע כי הגדלת צריכת אורניום באמצעות שתיית מים נטו להיות מזוהה עם עלייה ברמת סרום של סמן ספיגת עצם גברים¹⁵. יחדיו, ממצאים אלה הובילו למסקנה כי אורניום, אשר צוברת בתוך עצם יכולים לקדם את ספיגת עצם. עם זאת, המנגנונים התאיים מעורב הזה אפקט פוטנציאליים האורניום של עדיין שאלה פתוחה. מסיבה זו, החלטנו לבחון את ההשפעה של אורניום על אופן הפעולה של resorbing תאים עצם.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול הקמנו כדי לאפיין ולכמת את ההשפעה של אורניום טבעי על הכדאיות osteoclasts מראש ועל בידול osteoclasts ופעילות resorptive. הניסויים המתוארים בזאת נעשו עם קו תא מקרופאג טרנספורמציה מאתר 264.7 גולמי, אשר בקלות יכולים להתמיין osteoclasts כאשר תרבותי בנוכחות ציטוקין רנקל 4 או 5 ימים, והוא אשר משמש בסגנון קלאסי ללמוד אוסטאוקלסט בידול ותפקוד¹⁶. ההליכים פיתח אמין, נותן תוצאות מאוד לשחזור והם החלים לחלוטין osteoclasts העיקרי. מכל הסיבות האלה, אנו מאמינים כי מתודולוגיה זו שימושית לקבלת הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים המעורבים אורניום רעילות בתוך עצם. יתר על כן, אנחנו חושבים כי גישה זו יכול להיות מותאם ככלי מיון לזיהוי אורניום חדש chelating סוכנים.

Protocol

1. הכנת Uranyl אצטט פתרון כדי להכין 2 מ ל 100 מ מ uranyl אצטט פתרון, להוסיף 85 מ”ג של uranyl אצטט (אז פרט להתמחות2(OCOCH3)2, 2 H2O; M = 424 g.mol-1) במצב מוצק צינור פלסטיק מ ל. להוסיף 2 מ ל מים מזוקקים צינור פלסטיק ולהתאים אותו עם פקק מפלסטיק. לנער את הצינור נמרצות עד התפרקות מו…

Representative Results

עמידים tartrate פוספטאז חומצה מכתים שימש כדי להמחיש osteoclasts כתאי סגול גדול יש 3 או יותר גרעינים. להחליפן בתמונות של osteoclasts מתקבל מתאי 264.7 גלם תרבותי בנוכחות רנקל, uranyl יונים מוצגים באיור1. שינוי המספר והגודל של osteoclasts בתגובה אורניום גלויים בקלות תמונות ללא הפרדות …

Discussion

עד כמה שידוע לנו, זו הפעם הראשונה המתואר הליך מפורט במטרה לחקור את ההשפעה של אורניום טבעי על עצם resorbing תאים. גישה זו יהיה שימושי להשיג הבנה טובה יותר של אורניום השפעה על עצם פיזיולוגיה, עשוי לספק כלי חדש מעניין להקרנה של אורניום chelators. יתר על כן, אנו מאמינים כי יכול להיות מיושם הפרוטוקול המתו?…

Materials

DMEM	Lonza	BE12-604F
α-MEM	Lonza	BE12-169F
EMEM without phenol red	Lonza	12-668E
Water for cell culture	Lonza	BE17-724F
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma-Aldrich	P4333
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Trypan Blue Solution 0.4%	Sigma-Aldrich	T8154
HyClone fetal bovine serum	GE Life Sciences	SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution	Sigma-Aldrich	S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder	Sigma-Aldrich	M5655
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol.	Alfa Aeros	42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates	Corning Life Sciences	3987
Multiwell 24 well plates	Falcon	353504
Flask 75 cm2	Falcon	353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml	Falcon	352070
Cell scrapers 30 cm	TPP	90003