Summary
ここで同時に量的に従うメソッドとアルカリ加水分解とその後 5´ エンド ゲノム DNA の酵素の開裂を組み合わせて単一ヌクレオチド分解能で高度そのまま DNA のゲノム地図リボヌクレオチドについて述べるシーケンス。
Abstract
リボヌクレオチド ゲノムに存在の数を推定する確立された方法は法人リボヌクレオチド短い合成 DNA のフラグメントかプラスミッドをテンプレートとして使用し、全体の結果を推定の定量に限定されます。ゲノム。また、リボヌクレオチド ゲノムに存在の数が推定するアルカリ ゲルまたは南しみ。最近の体内アプローチは、位置と埋め込みリボヌクレオチドの id を提供するリボヌクレオチドのゲノム マッピングを許可する次世代シーケンスを採用しています。しかし、彼らは、リボヌクレオチド ゲノムに組み込まれている数の定量できないようにします。ここで同時にマップし、次世代シーケンサーによる人間ミトコンドリア DNA体内に組み込まれているリボヌクレオチドの数を量的に表わす方法をについて説明します。高い無傷の DNA を使用し、エンドヌクレアーゼ、アルカリ加水分解後法人リボヌクレオチドの消化によってシーケンス特定の二重鎖切断を導入します。生成された端がアダプターと組み合わされて、これらの端が次世代シーケンス コンピューターでシーケンス処理されました。リボヌクレオチドの絶対数は、シーケンス特定エンドヌクレアーゼの認識サイトで読み取りの平均数ごとに認識サイト外の読み取りの数として計算することができます。このプロトコルはまたマップし、DNA で無料のニックネームを量的に利用することがあり、適応 5´ OH に処理することができます他の DNA の損害をマップすることができます終了または 5´ リン酸終了。さらに、このメソッドは適切な参照ゲノムが利用できることを考える、どんな有機体に適用できます。このプロトコルしたがって、DNA 複製、5´ エンドの処理、DNA 損傷と DNA 修復を研究する重要なツールを提供します。
Introduction
真核細胞のリボヌクレオチド (rNTPs) の濃度は、ナノメーター (dNTPs)1の濃度よりはるかに高いです。DNA ポリメラーゼは、リボヌクレオチドを差別しますが、この差別は完璧ではないし、代わりにデオキシリボヌクレオチド リボヌクレオチド結果として、DNA の複製中にゲノムに組み込むことができます。2ゲノムに組み込む最も一般的な非正規ヌクレオチド リボヌクレオチドがあります。RNase H2 開始リボヌクレオチド切除修理 (RER) または (参照3の見直し) トポイソメラーゼ 1、岡崎フラグメントの成熟に伴うこれらのリボヌクレオチドのほとんどが削除されます。削除できませんリボヌクレオチドいて DNA2,4に安定的に組み込まれ (レビュー5レビュー) 両方の有害、有益な方法でそれに影響を与える可能性があります。肯定的な信号として使用するほかに、たとえば交配型のスイッチで分裂酵母6 (MMR)7、8を修復の不一致の中に新生 DNA 鎖をマーキング、リボヌクレオチドに影響を与える、構造9複製ストレスとゲノム不安定性11の結果として彼らのリボースの10、2´ ヒドロキシル グループによる周辺の DNA の安定性。Genomic DNA (gDNA) のリボヌクレオチドとレプリケーション修復機構とゲノム安定性への影響の関連性の豊かさは、ゲノムワイドな方法で彼らの正確な出現頻度と頻度を調査する理由を与えます。
人間のミトコンドリアの RNase H2 アクティビティが見つかりません、リボヌクレオチドのため効率的な削除されるミトコンドリア DNA (mtDNA) に。いくつかの経路は、ヒトのミトコンドリアにヌクレオチドの供給に関与しているし、ミトコンドリア ヌクレオチド プールの障害が人間の mtDNA のリボヌクレオチドの上昇数を発生するかどうかを調べるには、我々 は開発をマップし、量的に表わすのためのプロトコルこれらのリボヌクレオチド由来の線維芽細胞、HeLa 細胞と患者の細胞ライン12ヒト ・ ミトコンドリア Dna の。
(見直し見直し13) rNTPs に対して DNA ポリメラーゼの選択性を決定するほとんどの in vitroアプローチ競合 rNTPs が反応に含まれている単一のリボヌクレオチド挿入またはプライマー拡張の実験に基づいています。ミックス、短い DNA テンプレートの識別やリボヌクレオチド定款の相対的な定量分析を許可します。短い配列の定量的アプローチ可能性がありますいない細胞濃度で dNTP と rNTP のプールを反映し、したがって全体のゲノムに関する限られた意義がポリメラーゼ選択性に洞察力を提供します。配列のゲル radiolabeled dNTPs を使用し、アルカリ環境14で DNA を加水分解で、プラスミドなどの長い DNA テンプレートの複製中に組み込むリボヌクレオチドの相対量を視覚化できることが示されています。さらに、南しみアルカリ加水分解、アンチセンス プローブと15体内リボヌクレオチド定款の絶対的な率の決定に gDNA を分析されています。これらのアプローチ混入頻度の相対的な比較を許可するが、位置または法人リボヌクレオチドのアイデンティティへの洞察を提供します。最近の gDNA体内埋め込みリボヌクレオチドの HydEn Seq emRiboSeq19, Pu Seq18やリボース Seq1716を活用のようなリボヌクレオチド内容の分析方法アルカリへの感受性または H2 RNase 処理をそれぞれ、リボヌクレオチド ゲノム全体を識別するために次世代シーケンスを採用し、。これらのメソッドは、検出されたリボヌクレオチドの絶対混入頻度に洞察力を提供していません。シーケンス特定酵素胸の谷間のステップを HydEn seq プロトコルに追加すると、便利なここについて述べるメソッドが拡張同時マッピングを許可する配列のアプローチから得られる情報との定量が埋め込まれました。リボヌクレオチド12。このメソッドは、高度そのまま DNA 抽出を生成でき、適切な参照ゲノムが利用可能なことを考えるあらゆる生物に適用されます。メソッドは、量的に表わすヌクレアーゼによって消化することができます、5´ リン酸塩や 5´ ああ終わり葉病変の位置を確認して合わせることができます。
マップは、リボヌクレオチド genomic DNA の量的に表わすメソッドはシーケンス特定エンドヌクレアーゼで胸の谷間を結合し、5´-リン酸を生成するアルカリ加水分解はエンドヌクレアーゼの特定の認識配列があると 5´ のサイトで終了ああリボヌクレオチドが置かれた位置で終わります。生成された自由端がアダプターと組み合わされてその後、次世代シーケンサーを使用してシーケンスされたので、高い無傷の DNA を使用し、DNA の抽出やライブラリの準備作業中にランダムな断片化を避けるために重要なのです。同時定量および検出されたリボヌクレオチドのマッピングできますエンドヌクレアーゼ胸の谷間サイトで読み取りに正規化されたこれらの読み取りを評価します。無料 5´-終了は、KCl 処理による DNA のアルカリ加水分解を交換する場所のコントロール実験で検出されます。集録したデータ リボヌクレオチド場所と量に洞察力を提供でき、リボヌクレオチド コンテンツと混入頻度に関して分析。
Protocol
このプロトコル概要を 図 1 と gDNA、アルカリ加水分解処理リボヌクレオチド、数を量的に表わすことができるに制限の酵素と消化の分離が含まれていますgDNA、無料 5´-オハイオ州の端のリン酸化、アダプター、2 番目の鎖の合成、およびシーケンスの前に PCR 増幅の ssDNA 結紮組み込まれてリボヌクレオチドのリン酸ジエステル結合
。1 アダプターおよびインデックス プライマー
- ARC78 ARC107、アダプター ARC76/77 オリゴヌクレオチド ARC140 を取得 ARC49 のインデックス プライマー (表 1 を参照)。
。 注: オリゴヌクレオチドは、HPLC 精製をする必要があります。ARC76/77 二重として並べ 。
- トリス EDTA (TE) バッファー内の各のオリゴヌクレオチドの準備 100 μ M 原液 (材料表 参照)-20 デパートと ° C
- は、溶出バッファー (EB; 参照 テーブルの材料) で希釈することによって ARC67/77 の 10 μ M ソリューションと ARC49、インデックスのプライマーの 2 μ M ソリューションを準備します。-20 ° C にてストア
2。成長と細胞の収穫
- 70 mL ダルベッコの成長 HeLa 細胞 ' s 修正イーグル培地 (DMEM) 37 で 250 mL スピナー フラスコの 10% 牛胎児血清を添加した ° C
- セルの数を数えると 200 x g で 5 分間遠心分離 50 mL チューブに 5 x 10 の 6 セルを収集し、上澄みを廃棄します 。
- 20 mL の 1x PBS、200 x g で 5 分間遠心分離と細胞を洗浄し、上澄みを廃棄します 。
- -20 ° C でペレットを凍結または DNA の浄化を続行します 。
3。DNA の精製と定量
- フェノール-クロロホルム抽出法を使用して下記のとおり gDNA を浄化します。
- は、2 mL の溶解バッファーで細胞を再懸濁します (材料の表 を参照) と暖房のブロックの 42 ° C で 30 分間インキュベートします
。 注意: 換散バッファーには、有害なコンポーネントが含まれています。SDS ソリューションは刺激、プロテイナーゼ K は感、刺激、および有毒です。防護服と手袋を着用します 。
- 2 つの 2 mL チューブにサンプルを分割し、フェノール ・ クロロホルム ・ イソアミル アルコール (25:24:1) の 1 巻 (V) を追加します
。 注意: フェノール ・ クロロホルム ・ イソアミル アルコールは毒性、変異原性、腐食性、水生環境に危険をもたらすです。発煙のフードを使用して、防護服と手袋を着用、特殊フェノール クロロホルム廃棄物の破棄します 。
室温で 30-60 秒の逆転や 15,000 x で 5 分間遠心分離による - ミックス g.
注: 結果を歪める、ランダムな鎖切断を導入することを避けるためにない渦 DNA はありません 。
- 上、水性相を新しい 2 mL のチューブに転送し、フェノール ・ クロロホルム ・ イソアミル アルコール (25:24:1) の 1 V を追加します 。
- ミックスの逆転や 4 で 15,000 × g で 5 分間遠心 ° C
- を新しい 2 mL チューブ 20 μ L を追加し上部の水様段階転送塩化ナトリウム (5 M) と冷たいイソプロパノールの 1 V
。 注意: イソプロパノールは、刺激性、可燃性、有毒です。換気されたキャビネットに格納、防護服と手袋を着用、炎から離しておく 。
- 反転でミックスし-20 で少なくとも 1 時間インキュベート ° C
- G、4 ° C と破棄清 x 15,000 で 20 分間遠心します 。
- 200 μ L 冷たい 70% エタノールで洗浄 DNA の餌は 4 ° C で 15,000 × g で 20 分間遠心し、上澄みを廃棄します
。 注意: 70% のエタノールは可燃性および刺激です。換気されたキャビネット、防護服と手袋、-20 ° C、それ以外の店で働く解決策を保持し、炎から離しておく 。
- 20-25 分の室温で DNA ペレットを乾燥
- 溶解 DNA ペレット 100 μ L TE バッファーに格納し、プールの 1 つの管のサンプル 。
- は、2 mL の溶解バッファーで細胞を再懸濁します (材料の表 を参照) と暖房のブロックの 42 ° C で 30 分間インキュベートします
- メーカーによると dsDNA 定量試薬を用いた量的 DNA 濃度 ' s 仕様 (材料の表 を参照してください).
注: 残留フェノールによって DNA の吸光光度定量に影響するので dsDNA 定量試薬を使用しています 。
- -20 ° C でストア DNA HincII 治療を続行か 。
4。HincII 治療とアルカリ加水分解
5 μ L 10 x バッファー 3.1、1 μ L (10 U) を含む- 反応における DNA のダイジェスト 1 μ g ミックス HincII とヌクレアーゼ フリー H 2 O 50 μ L の最終巻にします
。 注: 結紮のための最適な条件を達成するために 2 番目の鎖合成や PCR 増幅、必要がありますそれはリボヌクレオチドの数が非常に少ないが、DNA に含まれていることが予想される場合、入力の DNA の量を増やすには。同様に、リボヌクレオチドの数が非常に高い場合、入力の DNA を減少する必要があります 。
- 37 ° C で 30 分間インキュベート
- 浄化 HincII 常磁性ビーズで DNA を扱われます
。 注意: チューブ チューブを開くことでペレットを邪魔しないように次の手順で蓋を開きます。- 常磁性ビーズをそれぞれの 1.8 V を追加サンプル、ピペッティング、ミックスを慎重に、10 分間室温でインキュベート
- 5 分のビーズをペレット、削除し、上澄みを廃棄する磁気ラックを使用します 。
- 約 30 s し削除破棄上清の 70% のエタノール (室温) の 150 μ L でペレットを洗うです 。
- 洗浄の 70% のエタノール (室温) 約 30 の 200 μ L でペレット s を削除し、上清を捨てる
。 注: 残留エタノールを 10 μ L ピペットを削除できます。水滴が簡単にあらかじめスピンダウンを 。
- 乾燥室温約 15-20 分のサンプル
注: 正確な時間量のビーズ、ペレットの形状に依存し、したがってペレットが視覚的にチェックする必要があります 。
- 磁気ラックからチューブを外し、45 μ L EB、慎重にピペッティングによるミックスでペレットを溶出します 。
- インキュベート 5 分、磁気ラックのビーズをペレットし、4.4 の手順で浄化された DNA の 45 μ L を使用します 。
- 島 (3 M) または KCl (3 M) DNA を 50 μ L の総ボリュームを作成するための追加の 5 μ L.
注意: 3 M KOH 溶液は腐食性です。防護服と手袋を着用します 。
氷 5 分続いて、交配で 55 ° C で 2 時間加温 - オーブン
メモ: それはチューブの均一加熱を維持し、蓋に結露を防ぐため暖房のブロックではなくオーブンで島治療を実行する勧めします 。
酢酸ナトリウム 10 μ L を追加することによって - を沈殿させる DNA (3 M, pH = 5.2) と 125 μ L 冷たい 100% エタノール。氷上で 5 分間インキュベート
注意: 100% エタノールは可燃性および刺激です。換気されたキャビネットに格納、防護服と手袋を着用、炎には近づかない 。
- 21,000 x g、5 分の 4 ° C で遠心分離によって gDNA をペレットし、上澄みを廃棄します 。
- 洗浄 DNA ペレット 250 μ L 冷たい 70 %etoh、21,000 x g、5 min のための 4 ° C で遠心し、上澄みを廃棄します
。 注: 液滴を削除するチューブがスピン ダウン簡単に再びし、10 μ l ピペットで上澄みを削除できます 。
- 任意の目に見える流体が蒸発するまで約 5-10 分のための開いた管の乾燥ペレットをしましょう 。
- 20 μ L EB 室温で 30 分間で聞かせて DNA ペレット溶解します 。
5。 5´ リン酸化エンド
- が事前に短所は、各サンプルで反応混合物を備えます。T4 ポリヌクレオチド キナーゼ反作用バッファー、1 μ L (10 U) 3´ ホスファターゼ マイナス T4 ポリヌクレオチド キナーゼおよび 2.5 μ L ATP (10 mM) x 2.5 μ 10 の置かれて 。
- 転送 19 μ L 各 DNA の新しい 200 μ L チューブにサンプルし、熱 cycler で 85 ° C で 3 分間変性します 。
- クールな DNA が氷の上をサンプリングし、各サンプルに反作用の組合せの 6 μ L を追加します 。
- 30 分の停止反応 65 ° C 20 分でサンプルをインキュベートし 37 ° C で加温反応ミックス
- としての DNA の浄化は 4.3、常磁性ビーズの 1.8 V を使用して説明されていますが、14 μ L EB で溶出します 。
6 ssDNA 結紮
- が 0.5 μ l ATP (2 mM)、5 μ l 10 T4 RNA リガーゼの反応バッファー、5 μ l CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM)、x から成る事前に各サンプルの反応混合物を準備。0.5 μ L ARC140 (100 μ M)、および 25 μ L 50% PEG 8000。ピペッティングで混ぜるします
。 注意: CoCl 3 (NH 3) 6 は感作、発癌性、水生環境に有害です。防護服と手袋を着用します 。
- 転送 13 μ L から浄化された DNA の新しい 200 μ L チューブ ステップ 5.5 と熱 cycler で 85 ° C で 3 分間変性します 。
- 氷の DNA をクールな各サンプルは、ピペッティングにより混合反応混合物を 36 μ l 添加し、簡潔にスピンダウンします 。
- 追加 1 μ L (10 U) T4 RNA リガーゼの各反応に、ピペッティングで混ぜるし、簡単にスピンダウンします 。
- 暗い夜間の室温でサンプルをインキュベートします 。
7。第 2 鎖合成
4.3 で説明したように、- 浄化が DNA を結紮が 0.8 V 常磁性ビーズを使用して、10 分のビーズをペレットし、20 μ L EB で溶出します
。 注: ライゲーション反応混合物の粘度が高いためペレット化の第一歩は延長します 。
新しい 200 μ L の PCR チューブに DNA サンプルの - 転送 20 μ L。0.8 V 次の製造元常磁性ビーズを用いた浄化手順 ' s 仕様には 14 μ L EB と 。
- 10 x T7 DNA ポリメラーゼ反応バッファー、2 μ L の 2 μ L から成る事前に各サンプルの反応混合物を準備 ARC76/77 (2 μ M)、2 μ L dNTPs (2 mM) と 0.8 μ L BSA (1 mg/mL).
- 転送 12.8 μ L が新しい 200 μ L 管へ DNA を精製し、熱 cycler で 85 ° C で 3 分間変性します 。
- 氷の DNA を冷却し、それぞれのサンプル、ピペッティングで混ぜる、簡潔に、スピンダウン、室温で 5 分間インキュベートする反作用の組合せの 6.8 μ L を追加します 。
- 各反応に 0.4 μ L (4 U) T7 DNA ポリメラーゼを追加し、室温で 5 分間インキュベートします 。
- 常磁性ビーズの 0.8 V を使用して 4.3、記載としての DNA の浄化し、11 μ L EB で溶出します 。
8。PCR 増幅とライブラリ定量
前もって 7.5 μ L から成る- 準備新しい 200 で各サンプルに対して反作用の組合せ μ 管 ARC49 (2 μ M)、7.5 μ L インデックス プライマー (2 μ M、サンプルごとにユニークな)、およびホット スタート x 25 μ L 2レディ ミックス 。
- 各反応する DNA のサンプルの追加 10 μ L。次の条件を使用してライブラリを増幅する: 45 95 ° C で変性 15 98 ° C の 18 サイクルに続いて s s、65 ° C、30 s 72 ° C、30 秒、2 分保持するサンプル 4 ° 72 ° C で最終伸長で終わる増幅後 C.
- 4.3、0.8 V 常磁性ビーズを使用しての説明に従ってライブラリを浄化し、20 μ L TE バッファーで溶出します 。
- 、メーカーによると dsDNA 定量試薬を使用してライブラリを量的に表わす ' s 仕様 (材料の表 を参照してください).
- -20 ° C でサンプルを格納またはライブラリの分析を続行します 。
9。ライブラリの分析とプール
- 各ライブラリの品質を決定する、デジタル電気泳動システムを使用してフラグメントの平均サイズを予測します
。 注: 平均フラグメントのサイズは一塩の曲線下面積は半分になる、推定による評価はマーカーからピークを無視して。島または KCl 治療後適切なライブラリ プロファイルの代表の結果は、 図 2 a で与えられる 。
- 計算ライブラリとしての濃度 (nM):
(c/10 3)/(p*650)] * 10 9
c が ng/μ L のライブラリの濃度にあり、p は bp、平均フラグメント サイズに推定される 9.1 。
- プール モルの平等な金額まで 24 ライブラリは、別のインデックス配列のプライマーで増幅。25 μ L の最終巻と 10 の濃度に TE バッファーを追加 nM
。 注: プールするライブラリの数、に応じて各ライブラリからの DNA の量が調整されます。約 130 の明瞭なピークとして 9.1 をステップしたプライマー二量体が検出された場合 0.8 V 常磁性ビーズを用いた 4.3 で説明されているように精製ステップが繰り返されますので 25 μ L TE buf に DNA を溶出、bp、ライブラリ プールの最終巻は 25 μ L を超えることfer。- を決定するメーカーによると dsDNA 定量試薬を用いた新しいライブラリ プール濃度 ' s 仕様と平均ピーク サイズ上記のよう。シーケンスとデータ解析 (セクション 10 および 11) に進みます 。
10。シーケンス
- プールされたライブラリ 12 75 ベース ペアエンド シーケンスを実行します
11 データ分析
- トリム アダプター シーケンスを削除するすべての読み取りフィルターの品質と長さを読む。
。 メモ: これは実行することができますコマンドで cutadapt 1.2.1 20 を使用 ' cutadapt -f fastq - 試合-読み取り-ワイルドカード - 静かな m 15 - q 10-、NNNNNNN < ファイル >' NNNNNNN は実際アダプター シーケンスに置き換えられます場所、および < ファイル > はfastq ファイル名に置き換えられます 。
- カスタム スクリプトを使用して、前の手順で廃棄された読み取りの合致を削除します 。
- 残りの合わせメイト 1 組ライブラリの準備で使用されるすべてのオリゴヌクレオチドのシーケンスを含むインデックスを (例えば、 ボウタイ 0.12.8 21 とコマンド ・ ラインを使用してオプション - m1-v2)。成功した線形のすべてのペアを破棄します 。
- 生物参照ゲノムをコマンドラインでボウタイを使用して残りのペアを揃えるオプション - v2 X 10000--最高 。
- 地図が不整列のすべてのペアのメイト 1 を合わせ、そのミトコンドリアの分子の先頭と末尾の間を読み取り (ボウタイを用いたコマンド ライン オプション - v2).
- は、すべてのシングルとペアの最後の線形の 5´ エンドの数を決定します。加水分解のリボヌクレオチドがいた位置に一塁上流によってこれらの位置をシフトします 。
- ボウタイ ファイルからデータをエクスポートは、ゲノム ブラウザー共通の可視化のためのカスタム スクリプトを使用して bedgraph ファイル形式にフォーマットします。読み取りごとに各ストランドの読み取りを正規化百万 。
- Incorp のアイデンティティを決定する有機体のゲノム塩基配列を参照位置とカウントを使用して、bedgraph ファイルからリボヌクレオチドの代表 orated
。 注: 16,200 300 の 5,747 5,847 の地域から人間のミトコンドリアのゲノムを読み取りのそれぞれの鎖除外すべきこれらの地域を含む多くの無料 5´ の両端が DNA ポリメラーゼ γ によってリボヌクレオチド定款とは無関係なので 。
- ない 11 HincII サイトを単一鎖切断、(すなわち ミトコンドリア分子当たりリボヌクレオチドの数) あたりのリボヌクレオチドの番号を取得する HincII サイトごとの読み取りの平均数と読み取りを含めて合計読み取りを分割します 。
Representative Results
12を細胞 hela 細胞からの人間のミトコンドリア DNA を分析、代表的な上記のデータが生成された方法論を示します。図 2 bは、要約の読み取りすべての HincII サイト重い (HS) と人間の mtDNA の軽鎖 (LS) KCl 治療 (左側パネル) の後です。約 70% すべての検出された 5´ 端を HincII 消化の効率を示すカット サイトにローカライズします。埋め込みリボヌクレオチドで DNA を加水分解する島のライブラリを扱う約 40% (図 2 b、右パネル) HincII サイトで読み取りの数が減少します。これはリボヌクレオチド定款サイトで生成される 5´ エンドの数が多いので期待は、十分なライブラリの品質を示すものです。図 2を示していますローカリゼーションと 5´ 端 (緑) の周波数 KCl 処理と読み取りを生成した後 HydEn seq (マゼンタ) によって島治療後無料 5´ 両端とリボヌクレオチドでアルカリ加水分解によって生成される終了を検出します。無料 5´ エンドと人間の mtDNA の HS にローカライズするリボヌクレオチドを左パネルに表示し、LS にローカライズするそれらが右側のパネルに表示されます。リボヌクレオチド (図 2 D、上部のパネル) や HS と mtDNA の LS HincII サイト (下段) で raw 読み取りの相対数中に表示、それぞれ、HS、相対的な LS の 14-fold または 31-fold より強力な報道と同様のバイアスが観察されなかった核の DNA。この鎖のバイアスは 2 つの繊維の基本組成の違いによって説明されるかもしれないし、HincII サイトで読み取りに正規化の重要性を示しています。
ミトコンドリアゲノム (図 3 a) あたりリボヌクレオチドの数の量的な測定 HincII 与えるカウント読み取りを正規化します。各ストランドのシーケンス構成に正規化された各リボヌクレオチドの島治療後読み込み比率と異なるリボヌクレオチドを示唆して読み取りの非ランダムな分布を示す 1 異なる表示図 3Bに示すように、パターンとライブラリの高品質。その比率は HincII、酵素の切断特異性を確認すると以前の消化によって影響を受けるです。1,000 相補的な塩基 (あたり組み込まれているどのように各リボヌクレオチドの多くの量的な測定を生成する HincII 切断点がある人々 にだけでなく、ゲノム塩基配列のコンテンツに埋め込まれたリボヌクレオチドのサイトで読み取りを正規化図 3)。
図 1: DNA の処理やライブラリの準備のためスケマティック。(1) 全 genomic DNA は鈍端 HincII サイト (黒矢印) を生成、リボヌクレオチドの後続の定量での正規化 HincII による切断され。(2) DNA は、2´、3´ 環状リン酸 (赤米国防総省) 3´ 終了で無料 5´ OH 終了につながるリボヌクレオチドのサイトで分解する島と扱われます。(3) 5´-オハイオ州の端は T4 ポリヌクレオチド キナーゼ 3´ ホスファターゼ マイナスによりリン酸化されます。(5´ 末端のリン酸基を運ぶ 4) すべてが T4 RNA リガーゼによって ARC140 オリゴヌクレオチドに組み合わされて。(5) の 2 番目のストランドは、T7 DNA ポリメラーゼとランダムな N6シーケンスを含んでいる ARC76 77 オリゴヌクレオチドを使用して合成されます。(6) ライブラリは、ARC49 と多重化に対する一意のバーコードを含む ARC107 インデックス プライマーに ARC78 のいずれかを使用して、忠実度の高い DNA ポリメラーゼによって増幅されます。(ペアエンド シーケンスによって 7) 5´ エンドがあります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 法検証します。(A) 代表的なエレクトロフェロの品質を決定する自動電気泳動システムを使用して生成された生成 HincII 重 (HS) と軽鎖 (LS) のサイトで島または集計 KCl (B) 信号処理ライブラリ。ヒト ・ ミトコンドリア Dna KCl (左側パネル) や島 (右側のパネル) 治療後。(C) Circos 無料 5´-端 (緑), 及び HydEn Seq (無料 5´ エンドとリボヌクレオチド、マゼンタ) HS (左のパネル)、LS (右側のパネル) ヒト ・ ミトコンドリア Dna からの図します。ピークが百万読み取りごとに正規化された、最大のピークは HydEn seq ライブラリの読み取りの最大数に調整。(D) 集計 raw 読み取りリボヌクレオチド (上部パネル) で重い (H) と光 (L) 鎖ヒト ・ ミトコンドリア Dna (水戸.) または逆 (RV) や核の (Nuc) フォワード (FW) 鋳 HincII サイト (下段)DNA。図 B、C および D は、参照12から適応されます。誤差範囲は、平均値の標準誤差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 代表結果。重い (H) やライト (L) 鎖島処理ライブラリ HincII サイトで読み取りに正規化されたリボヌクレオチドの相対的な (A) 数です。(B) 比島の mtDNA ゲノム構成するリボヌクレオチド id の処理 (KOH) と HincII 切断処理コ (KOH + HincII) と mtDNA の軽 (L) 鎖や重い (H) 上のライブラリ。(C) HincII と島扱われる mtDNA のライト (L) 鎖や重い (H) 上のライブラリのリボヌクレオチド周波数が 1,000 の相補的な塩基を正規化します。数字は、参照12から適応されます。誤差範囲は、平均値の標準誤差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 名 | シーケンス | |||
| ARC49 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC76 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N | |||
| ARC77 | AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C | |||
| ARC78 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC84 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC85 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC86 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC87 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA | |||
表 1: オリゴヌクレオチド。HydEn シーケンス用オリゴヌクレオチドのとおり太字は、インデックスを示します。* ホスホロチオエート結合を示します。ARC140 には、C6 リンカーとの組み合わせでの 5´-オハイオ州グループではなく 5´ アミノ グループが含まれています。この変更は、結紮 ARC140 コンカテマーの形成を軽減します。
Discussion
同時にマップし、特に、確立された HydEn seq プロトコルに付加としてゲノムのシーケンス特定のサイトでの DNA 切断の簡単な紹介で gDNA、mtDNA のリボヌクレオチドを定量化する手法をご紹介します。本研究は、人間の mtDNA に焦点を当てて、もともと HydEn seq メソッドは酵母、他の生物12,16メソッドの翻訳を示す開発されました。
このアプローチから得られる信頼性の高い結果を得るのためいくつかの重要なステップがあります: (A) シーケンス アダプターは、すべての利用可能な 5´ エンドに縛るので、それは非常に無傷の DNA を操作することが重要です。DNA を分離する必要があります、ライブラリできるようにできれば DNA 分離直後後や DNA は、-20 ° C で保存できます。長い時間冷蔵庫の中に DNA を保存するか、凍結し、解凍を繰り返すことはお勧めしません。(B) この方法で適切なライブラリを生成するためサンプル全体と定量加水分解の均一な暖房を確保する暖房のブロックよりもむしろインキュベーション オーブン、DNA の島治療を実行することが重要です。(C) さらに、プーリングとシーケンスの前にライブラリの品質を制御するため重要です。DNA 定量化する必要があります、ライブラリ、DNA の十分な量を確保するため自動電気泳動システムを用いて適切なフラグメント サイズを確認し、プライマー二量体のチェックします。
意味のあるデータ分析のため、このメソッドの有益な値はバック グラウンドのカウントとシーケンスまたは鎖の先入観を評価するために適切なコントロールに依存に注意してくださいすることが重要ですも。日常的にのみシーケンス特定エンドヌクレアーゼ (図 2 b、左パネル) と消化時 70% 近くの KCl のサンプルのマッピングの効率を実現します。エンドヌクレアーゼ処理が全体に影響されていないことを確認することが重要ですさらに、HincII を比較することによって法人リボヌクレオチドの検出処理し、未処理のサンプル (図 3 b).これらの実験で使いました HincII サイト固有のカットを紹介するのに他の忠実度の高い制限酵素を使用することも。
プロトコルは合わせることができる 5´ リン酸または 5´-オハイオ州に処理することができます DNA 損傷の他の種類の研究を終了します。結果の精度は処理の特異性に依存して、適切な制御を必要とする (例えば野生型または未処理) 確認のため。また、他アプリケーション、または他の有機体で使用するため、このメソッドを適用するときは、その現在の設定の方法がライブラリに処理される DNA の約 1 μ g を必要とする 1 つ検討してください。端の数は埋め込みリボヌクレオチドの数に依存して、のでサンプル リボヌクレオチドの低い番号を含む有機体または変異体によって異なりますが必要になります以上の入力の終了の十分な数を生成する DNA、その後図書館の建設。同様に、DNA のサンプルのより多くリボヌクレオチドの場合必要も少ない入力 DNA を使用して結紮、第 2 鎖合成、PCR 増幅に最適な条件を取得します。それが注目されるは、このプロトコルで記述されている、図書館の建設も生成されます (図 2 Dで表示)、核ゲノムをカバーするデータ、データ解析のみ mtDNA に集中していた。これは、リボヌクレオチドに適度に低い周波数でより大きいゲノムがまたこのメソッドによってキャプチャされる示しています。
このメソッドを考慮するとき特定の制限する必要があります考慮する: このメソッドする必要があります、理論的には、事実上すべての有機体に適用される適切な参照ゲノムは読み取りを配置するために必要な。さらに、提案手法から得られた結果は、多数のセルから読み取りを表します。このアプローチによって、セルのサブセットの特定リボヌクレオチド設立パターンを識別できません。リボヌクレオチドの数が非常に少ないより大きいゲノムのリボヌクレオチドをマップすると、ランダムな刻み目からリボヌクレオチドを差別することが難しいし、適切なコントロールが必要と。
ここで述べる方法は、HydEn Seq16、リボース Seq17、Pu Seq18emRiboSeq19など生体内で利用できる技術を拡張します。これらのアプローチを活用する埋め込みリボヌクレオチドの感度アルカリまたは H2 RNase 処理をそれぞれのマッピングとの比較を可能にするリボヌクレオチド ゲノム全体を識別するために次世代シーケンサーを用いた相対設立。DNA シーケンスを具体的に切断し埋め込みリボヌクレオチドでアルカリ加水分解に加え、上記のようリボヌクレオチドの読み取りすることができますに正規化するそれらの胸の谷間サイトだけでなく特定できるとのマッピングリボヌクレオチド、しかし各 DNA 分子の定量DNA 複製関連疾患において本手法の応用 DNA 修復、および TLS は、一般に分子機構とゲノムの維持と、元のリボヌクレオチドの役割のより深い理解を提供できます。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
本研究は、スウェーデンの研究評議会によって支えられたアークに助成金 (www.vr.se) (2014-6466 とアーク (ICA14-0060) 戦略的研究 (www.stratresearch.se) のためのスウェーデンの財団。チャルマース工科大学は、この作業中に MKME に財政援助を提供します。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
| 10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0216L | |
| 1x PBS | Medicago | 09-9400-100 | dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 33539-1L-GL-R | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| 50 mL Centrifuge Tube | VWR | 525-0610 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP, 10 mM) | New England Biolabs | P0756S | dilute with EB to 2 mM |
| Agilent DNA 1000 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | referred to as EB |
| CleanPCR paramagnetic beads | CleanNA | CPCR-0050 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each) | New England Biolabs | N0447L | dilute with EB to 2 mM |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61965026 | |
| DynaMag 96 Side | Thermo Fisher | 12331D | |
| Ethanol 99.5% analytical grade | Solveco | 1395 | dilute with milliQ water to 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M) | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC | AppliChem | A6906,0125 | |
| Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6) | Sigma-Aldrich | H7891-5G | dissolve in nuclease-free H2O for 10 M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment. |
| HincII | New England Biolabs | R0103S | supplied with NEBuffer 3.1 |
| Hybridiser HB-1D | Techne | FHB4DD | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Kapa Biosystems | KK2602 | |
| Lysis buffer | 50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 µg/mL), 1% SDS | ||
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Microcentrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000014 | |
| Microcentrifuge MiniStar silverline | VWR | 521-2844 | |
| Multiply µStripPro 0.2 mL tube | Sarstedt | 72.991.992 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| Phenol – chloroform – isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 26764.232 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Potassium hydroxide (KOH) | VWR | 26668.296 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Refrigerated Centrifuge 4K15 | Sigma Laboratory Centrifuges | No. 10740 | |
| SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553-035 | |
| Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc) | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 27810.295 | dissolve in nuclease-free H2O for 5 M solution, sterile filter |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (3' phosphatase minus) | New England Biolabs | M0236L | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204L | supplied with PEG 8000 (50%) |
| T7 DNA Polymerase (unmodified) | New England Biolabs | M0274S | supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer |
| TE Buffer | Invitrogen | 12090015 | |
| ThermoMixer F2.0 | Eppendorf | 5387000013 |
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