Summary
Her beskriver vi en metode medgørlige til samtidig kvantificere og genome-wide kort ribonucleotides i meget intakt DNA på enkelt-nukleotid opløsning, kombinere enzymatisk kløvningen af genomisk DNA med alkalisk hydrolyse og efterfølgende 5´-afslutning sekventering.
Abstract
Etablerede metoder til at anslå antallet af ribonucleotides i en genom er begrænset til kvantitering af indarbejdet ribonucleotides ved hjælp af korte syntetiske DNA fragmenter eller plasmider som skabeloner og derefter ekstrapolere resultaterne til hele genom. Alternativt, antallet af ribonucleotides i en genom kan estimeres ved hjælp af alkalisk geler eller sydlige blots. Nyere i vivo tilgange ansætte næste generation sequencing tillader genome-wide kortlægning af ribonucleotides, holdning og identitet af integrerede ribonucleotides. De tillader dog ikke kvantitering af antallet af ribonucleotides, som er indarbejdet i en genom. Her beskriver vi sådan samtidig kortlægge og kvantificere antallet af ribonucleotides, som er indarbejdet i menneskelige mitokondriel DNA i vivo af næste generation sequencing. Vi bruger meget intakt DNA og indføre sekvens specifikke dobbeltstrenget pauser af fordøje det med en endonuklease, efterfølgende hydrolyserer indarbejdet ribonucleotides med alkali. De genererede ender er forbundet med adaptere og disse ender er sekventeret på en Next-generation sequencing maskine. Det absolutte antal af ribonucleotides kan beregnes som antallet af læser uden for genkendelsessekvens pr. gennemsnitlige antal læsninger på webstedet anerkendelse for sekvens specifikke liv1975. Denne protokol kan også udnyttes til at kortlægge og kvantificere gratis rifter i DNA og giver mulighed for tilpasning til at knytte andre DNA læsioner, der kan forarbejdes til 5´-OH ender eller 5´-fosfat ender. Desuden, denne metode kan anvendes på enhver organisme, en passende genom er tilgængelige. Denne protokol giver derfor et vigtigt redskab for at studere DNA-replikation, 5´-udgangen forarbejdning, DNA-skader og DNA reparation.
Introduction
I en eukaryote celle er koncentrationen af ribonucleotides (rNTPs) meget højere end koncentrationen af dexyribonucleotider (dNTP'er)1. DNA polymeraser diskriminerer mod ribonucleotides, men denne diskrimination er ikke perfekt, og som følge heraf ribonucleotides i stedet for dexyribonucleotider kan indbygges i genomer under DNA replikation. Ribonucleotides kan være de mest almindelige ikke-kanoniske nukleotider indarbejdet i genom2. De fleste af disse ribonucleotides er fjernet under Okazaki fragmenter modning af RNase H2 indviede ribonucleotide excision reparation (RER) eller Topoisomerase 1 (gennemgik i reference3). Ribonucleotides, der ikke kan fjernes forblive stabilt indarbejdet i DNA2,4 og kan påvirke det i både skadelige og gavnlige måder (gennemgik i gennemgik5). Udover at være i stand til at fungere som positive signaler, for eksempel i parring type skifte i Schizosaccharomyces pombe6 og maerkning det spirende DNA strand under uoverensstemmelse reparation (MFR)7,8, ribonucleotides påvirker den struktur9 og stabiliteten i de omkringliggende DNA på grund af 2´-hydroxyl gruppen af deres ribose10, hvilket resulterer i replicative stress og genom ustabilitet11. Overfloden af ribonucleotides i genomisk DNA (gDNA) og deres relevans i replikering samt reparations-mekanismer og følgerne for genom stabilitet, giver grund til at undersøge deres præcise forekomst og hyppighed i en genome-wide måde.
RNase H2 aktivitet ikke er blevet fundet i menneskelige mitokondrier og ribonucleotides er derfor ikke effektivt fjernet i mitokondrie-DNA (mtDNA). Flere veje er involveret i levering af nukleotider til menneskelige mitokondrier og for at undersøge, om forstyrrelser i mitokondrie nukleotid pool medføre et forhøjet antal ribonucleotides i humant mtDNA, vi udviklede en protokol til at kortlægge og kvantificere disse ribonucleotides i humant mtDNA isoleret fra fibroblaster, HeLa celler og patient celle linjer12.
De fleste in vitro- metoder (gennemgik i gennemgik13) for at bestemme DNA polymeraser selektivitet imod rNTPs er baseret på fælles ribonucleotide indsættelse eller primer udvidelse eksperimenter hvor konkurrerende rNTPs indgår i reaktionen mix, muliggør identifikation eller relative kvantitering ribonucleotide vedtægter i korte DNA skabeloner. Kvantitative tilgange på korte sekvenser kan ikke afspejler dNTP og rNTP puljer på cellulære koncentrationer og derfor give indsigt i polymerase selektivitet, men er af begrænset betydning med hensyn til hele genomer. Det har vist sig at den relative mængde af ribonucleotides indarbejdet under replikering af en længere DNA-skabelon som et plasmid, kan visualiseres på en sekventering gel ved hjælp af radiolabeled dNTP'er og hydrolyzing DNA i et alkalisk miljø14. Derudover er gDNA blevet analyseret på sydlige blots efter alkalisk hydrolyse, giver mulighed for strand-specifikke sondering og bestemmelse af absolutte priser ribonucleotide indarbejdelse i vivo15. Disse tilgange giver mulighed for en relativ sammenligning af indarbejdelse frekvens men levere ingen indsigt i holdning eller identiteten af de indbyggede ribonucleotides. Nyere tilgange til at analysere ribonucleotide indhold i gDNA i vivo, ligesom HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, Pu-Seq18eller emRiboSeq19, drage fordel af de integrerede ribonucleotides følsomhed over for basisk eller RNase H2 behandling, henholdsvis, og ansætte næste generation sequencing at identificere ribonucleotides genome-wide. Disse metoder giver ikke indblik i absolut indarbejdelse hyppigheden af de fundne ribonucleotides. Ved at tilføje trin i sekvensen specifikke enzymatisk kavalergang HydEn-seq-protokollen, metoden vi beskrive her bekvemt udvider de oplysninger fra en sekventering approach, som giver samtidig kortlægning og kvantitering af integreret ribonucleotides12. Denne metode gælder for næsten enhver organisme meget intakt DNA ekstrakter kan genereres og en passende genom er tilgængelige. Metoden kan tilpasses til at kvantificere og bestemme placeringen af enhver læsion, som kan fordøjes af en nukleasen og efterlader en 5´-fosfat eller en 5´-OH ende.
For at kortlægge og kvantificere ribonucleotides i genomisk DNA, metoden kombinerer spaltning af en sekvens specifikke liv1975 og alkalisk hydrolyse genererer 5´-fosfat ender på steder hvor den specifikke anerkendelse sekvens for liv1975 er placeret og 5´ ÅH ender på positioner, hvor ribonucleotides var placeret. Da de genererede frie ender er efterfølgende forbundet med adaptere og sekventeret, ved hjælp af næste generation sequencing, er det vigtigt at bruge meget intakt DNA og undgå tilfældige fragmentering under DNA udvinding og bibliotek forberedelse. Vurderingen af disse læser, der normaliserede at læser på liv1975 kavalergang websteder tillader en samtidige kvantitering og kortlægning af de fundne ribonucleotides. Gratis 5´-ends er opdaget i kontrol eksperimenter hvor alkalisk hydrolyse af DNA er erstattet af behandling med KCl. De indsamlede data giver indsigt i ribonucleotide placering og antal og giver analyser med hensyn til ribonucleotide indhold og indarbejdelse frekvens.
Protocol
denne protokol er skitseret i figur 1 og omfatter isolering af gDNA, fordøjelse med restriktionsenzymer at kvantificere antallet af ribonucleotides, behandling med alkali at hydrolysere fosfodiesterbindinger af ribonucleotides indarbejdet i gDNA, fosforylering af gratis 5´-OH ender, ssDNA ligatur af adaptere, anden strand syntese og PCR-amplifikation før sekventering.
1. adaptere og indeks primere
- få ARC49, ARC140 oligonukleotider, ARC76/77, adapter og ARC78-ARC107 indeks primere (Se tabel 1).
Bemærk: Oligonukleotider skal være HPLC renset. ARC76/77 er bestilt som duplex. - Forberede 100 µM stamopløsninger af hver oligonukleotid i Tris-EDTA (TE) buffer (Se Tabel af materialer) og opbevares ved -20 ° C.
- Forberede 10 µM løsninger for ARC67/77 og 2 µM løsninger af ARC49 og indeks primere ved fortynding i eluering buffer (EB; Se Tabel af materialer). Opbevares ved-20 ° C.
2. Vækst og høst af celler
- vokse HeLa celler i 70 mL Dulbecco ' s ændret Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum i en 250 mL Spinner kolbe på 37 ° C.
- Tæller antallet af celler og indsamle 5 x 10 6 celler i en 50 mL tube, centrifugeres i 5 min. ved 200 x g, og supernatanten.
- Cellerne vaskes med 20 mL 1 x PBS, centrifugeres i 5 min. ved 200 x g, og supernatanten.
- Fryse pellets ved-20 ° C eller fortsætte med DNA oprensning.
3. DNA oprensning og kvantitering
- rense gDNA ved hjælp af phenol-chloroform udvinding, som beskrevet nedenfor.
- Resuspend celler i 2 mL lysisbuffer (Se Tabel af materialer) og der inkuberes i 30 min. ved 42 ° C på en varme blok.
Forsigtig: Lysisbuffer indeholder farlige komponenter. SDS løsning er irriterende, Proteinase K sensibiliserende, irriterende og giftige. Bær beskyttende tøj og handsker. - Split prøven i to 2 mL rør og tilføje 1 volumen (V) af phenol-chloroform-isoamyl alkohol (25:24:1).
Forsigtig: Phenol-chloroform-isoamyl alkohol er giftige, mutagene, ætsende og farlige for vandmiljøet. Bruge i et stinkskab, bær beskyttende tøj og handsker, og kassér i særlige phenol-chloroform affald. - Blanding af inversion for 30-60 s, og der centrifugeres i 5 min på 15.000 x g ved stuetemperatur.
Bemærk: Må ikke vortex DNA for at undgå at indføre tilfældige strand pauser, hvilket fordrejer resultaterne. - Overføre den øvre, vandige fase til et nyt 2 mL rør og tilføje 1 V af phenol-chloroform-isoamyl alkohol (25:24:1).
- Blanding af inversion, og der centrifugeres i 5 min på 15.000 x g ved 4 ° C.
- Overføre øvre, vandig fase for at et nyt 2 mL tube og tilføje 20 µL NaCl (5 M) og 1 V i kolde isopropanol.
Forsigtig: Isopropanol er brandfarlige, irriterende og giftige. Gemme det i en ventileret skab, bær beskyttende tøj og handsker og holde det væk fra flammer. - Blanding af inversion og Inkuber i mindst 1 time på -20 ° C.
- Centrifugeres i 20 min. på 15.000 x g, 4 ° C og Fjern supernatanten.
- Vask DNA pellet med 200 µL koldt 70% ethanol, centrifugeres i 20 min. på 15.000 x g ved 4 ° C og kassér supernatanten.
Forsigtig: 70% ethanol er brandfarlige og irriterende. Holde brugsopløsning på-20 ° C, ellers butik i ventileret skab, slid beskyttende tøj og handsker, og holde det væk fra flammer. - Tørre DNA pellet ved stuetemperatur i 20-25 min.
- Opløser DNA pellets i 100 µL TE buffer og samle prøver i en tube.
- Resuspend celler i 2 mL lysisbuffer (Se Tabel af materialer) og der inkuberes i 30 min. ved 42 ° C på en varme blok.
- Kvantificere DNA koncentration ved hjælp af en dsDNA kvantitering reagens ifølge producenten ' s specifikationer (Se Tabel of Materials).
Bemærk: Brug en dsDNA kvantitering reagens, fordi spektrofotometriske DNA kvantitering kan blive påvirket af resterende phenol. - Butik DNA ved-20 ° C eller fortsætte med HincII behandling.
4. HincII behandling og alkalisk hydrolyse
- Digest 1 µg af DNA i en reaktion blanding indeholdende 5 µL 10 x buffer 3.1, 1 µL (10 U) HincII og nukleasen-fri H 2 O til en endelige mængden af 50 µL.
Bemærk: For at opnå optimale betingelser for ligatur, anden strand syntese og PCR-amplifikation, det kan være nødvendigt at øge mængden af input DNA hvis det forventes, at DNA indeholder et meget lavt antal ribonucleotides. På samme måde, kan det være nødvendigt at sænke input DNA, hvis antallet af ribonucleotides er meget høje. - Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
- Rense HincII behandlet DNA med Paramagnetiske perler.
Bemærk: Holde røret låg åbne i følgende trin for at ikke forstyrre pellets ved at åbne rør.- Tilføje 1,8 V af Paramagnetiske perler til hver prøve, omhyggeligt mix af pipettering, og der inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
- Bruge et magnetisk rack pellet perler i 5 min, og derefter fjerne og kassere supernatanten.
- Vaske pellet med 150 µL af 70% ethanol (stuetemperatur) for ca. 30 s så fjern og kassér supernatanten.
- Vask pellet med 200 µL af 70% ethanol (stuetemperatur) for omkring 30 s derefter fjerne og supernatanten.
Bemærk: Resterende ethanol kan fjernes med en 10 µL pipette. Dråberne kan være spundet ned kort forinden. - Tør prøverne ved stuetemperatur i ca 15-20 min.
Bemærk: Den nøjagtige tid afhænger mængden af perler og formen af toerstoffet, derfor pellets bør kontrolleres visuelt. - Fjerne rør fra den magnetiske rack og elueres pellet i 45 µL EB, mix af pipettering omhyggeligt.
- Ruger 5 min. derefter pellet perler på den magnetiske rack og bruge 45 µL af oprenset DNA i trin 4.4.
- Tilføje 5 µL af KOH (3 M) eller KCl (3 M) i DNA, at skabe en samlet maengde paa 50 µL.
Forsigtig: 3 M KOH løsning er ætsende. Bær beskyttende tøj og handsker. - Incubate i 2 timer ved 55 ° C i en hybridisering ovn efterfulgt af 5 min på ice.
Bemærk: Det anbefales at udføre KOH behandling i en ovn i stedet for en opvarmning blok til at opretholde en ensartet opvarmning af røret og forhindre kondens på låget. - Udfældes DNA ved at tilføje 10 µL natriumacetat (3 M, pH = 5.2) og 125 µL koldt 100% ethanol. Der inkuberes i isbad i 5 min.
Forsigtig: 100% ethanol er brandfarlige og irriterende. Lagre i en ventileret skab, bær beskyttende tøj og handsker og holde sig væk fra flammer. - Pellet gDNA ved centrifugering på 21.000 x g, 4 ºC i 5 min. og supernatanten.
- Vask DNA pellet med 250 µL koldt 70% EtOH, centrifugeres ved 21.000 x g, 4 ºC i 5 min, og supernatanten.
Bemærk: Hvis du vil fjerne dråber, røret kan være spundet ned kort igen og supernatanten kan fjernes med en 10 µl pipette. - Lad pellet tørre i et åbent rør til omkring 5-10 min indtil nogen synlige væske er fordampet.
- Lad DNA pellet opløses i 20 µL EB i 30 min. ved stuetemperatur.
5. 5´ ende fosforylering
- forberede reaktion blanding for hver prøve på forhånd ulemperrende af 2,5 µL 10 x T4 polynucleotide kinase reaktion buffer, 1 µL (10 U) 3´-fosfatase-minus T4 polynucleotide kinase og 2,5 µL ATP (10 mM).
- Overføre 19 µL af hver DNA prøve ind i en ny 200 µL rør og denaturere for 3 min ved 85 ° C i en thermo cycler.
- Cool DNA prøver på is og tilføje 6 µL af mastermix til hver prøve.
- Incubate reaktion blander ved 37 ° C i 30 min og stop reaktion ved at inkubere prøver på 65 ° C i 20 min.
- Rense DNA som beskrevet i 4.3, ved hjælp af 1,8 V af Paramagnetiske perler men elueres i 14 µL EB.
6. ssDNA ligatur
- forberede hver på forhånd stikprøve 0,5 µL ATP (2 mM), 5 µL 10 x T4 RNA ligase reaktion buffer, 5 µL CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), mastermix 0,5 µL ARC140 (100 µM), og 25 µL 50% PLØK 8000. Bland godt af pipettering.
Forsigtig: CoCl 3 (NH 3) 6 er kræftfremkaldende, allergifremkaldende og farlige for vandmiljøet. Bær beskyttende tøj og handsker. - Overføre 13 µL af oprenset DNA fra trin 5.5 til en ny 200 µL tube og denaturere for 3 min ved 85 ° C i en thermo cycler.
- Cool DNA på isen og tilføje 36 µL af mastermix til hver prøve indsamles, mix af pipettering og spin ned kortvarigt.
- Tilføje 1 µL (10 U) af T4 RNA Ligase til hver reaktion, mix af pipettering, og spin ned kortvarigt.
- Ruger prøverne ved stuetemperatur i den mørke natten.
7. Anden-strand syntese
- rense forbundet DNA som beskrevet i 4.3, men bruge 0,8 V af Paramagnetiske perler, pellet perler i 10 min og elueres i 20 µL EB.
Bemærk: På grund af den højere viskositet af ligatur mastermix, forlænges de første skridt i pelleting. - Overføre 20 µL DNA prøve til en ny 200 µL PCR rør. Gentag trinnet rensning ved hjælp af 0,8 V af Paramagnetiske perler efter fabrikanten ' s specifikationer og elueres i 14 µL EB.
- Forbereder mastermix for hver prøve på forhånd bestående af 2 µL af 10 x T7 DNA polymerase reaktion buffer, 2 µL ARC76/77 (2 µM), 2 µL dNTP'er (2 mM) og 0,8 µL BSA (1 mg/mL).
- Overføre 12,8 µL renset DNA til en ny 200 µL tube, denaturere for 3 min ved 85 ° C i en thermo cycler.
- Cool DNA på isen og tilføje 6.8 µL af mastermix til hver prøve indsamles, mix af pipettering, spin ned kort og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
- Tilføje 0,4 µL (4 U) T7 DNA polymerase til hver reaktion og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
- Rense DNA som beskrevet i 4.3, ved hjælp af 0,8 V af Paramagnetiske perler og elueres i 11 µL EB.
8. PCR-amplifikation og bibliotek kvantitering
- Forbered mastermix for hver prøve i en ny 200 µL tube i forvejen bestående af 7,5 µL ARC49 (2 µM), 7,5 µL indeks primer (2 µM, unik for hver enkelt prøve) og 25 µL 2 x varm start klar mix.
- Tilføje 10 µL af DNA-prøve, at hver reaktion. Forstærke biblioteket ved hjælp af følgende betingelser: denaturere ved 95 ° C til 45 s, efterfulgt af 18 cyklusser af 98 ° C til 15 s, 65 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s, slutter med en afsluttende brudforlængelse ved 72 ° C i 2 min. Hold prøver på 4 ° C efter forstærkning.
- Rense biblioteker som beskrevet i 4.3, ved hjælp af 0,8 V af Paramagnetiske perler, og elueres i 20 µL TE buffer.
- Kvantificere biblioteker ved hjælp af en dsDNA kvantitering reagens, ifølge producenten ' s specifikationer (Se Tabel of Materials).
- Gemme prøver på-20 ° C eller fortsætte med biblioteket analyse.
9. Biblioteket analyse og samle
- bestemmende for kvaliteten af hvert bibliotek og estimere den gennemsnitlige fragment størrelse ved hjælp af en digital elektroforese.
Bemærk: Den gennemsnitlige fragment størrelse vurderes ved forkalkulation, hvor arealet under kurven for elektroferogrammet er halveret, ses der bort fra toppene fra markører. Repræsentative resultater af passende bibliotek profiler efter KOH eller KCl behandling gives i figur 2A. - Beregne koncentrationen (nM) af biblioteker som:
(c/10 3) /(p*650)] * 10 9
hvor c er koncentrationen af biblioteket i ng/µL og p er den gennemsnitlige fragment størrelse i bp, som anslået i 9.1. - Pool lige store kindtand mængder op til 24 biblioteker forstærket med forskellige index primere til sekvensering. Tilføje TE buffer til en endelige mængden af 25 µL og koncentration på 10 nM.
Bemærk: Afhængigt af antallet af biblioteker til at samles, mængden af DNA fra hver bibliotek er justeret. Hvis primer dimerer blev fundet i trin 9.1 som en særskilt peak omkring 130 bp, den endelige mængden af bibliotek pool kan overstige 25 µL, fordi rensning trin gentages som beskrevet i 4.3, ved hjælp af 0,8 V af Paramagnetiske perler, og DNA er elueret i 25 µL TE buf fer.- Bestem det nye bibliotek pool koncentration ved hjælp af en dsDNA kvantitering reagens ifølge producenten ' s specifikationer og gennemsnitlige peak størrelse som beskrevet ovenfor. Fortsæt til sekvensering og data analyse (afsnit 10 og 11).
10. Sekventering
- udføre 75-base parret ende sekventering på poolet biblioteker 12.
11. dataanalyse
- Trim alle læser at fjerne adapteren sekvenser, filtrere for kvalitet og læse længde.
Bemærk: Dette kan gøres ved hjælp af cutadapt 1.2.1 20 med kommandoen ' cutadapt -f fastq - match-Læs-jokertegn--stille -m 15 - q 10 - en NNNNNNN < fil >', hvor NNNNNNN er erstattet med den faktiske adapter sekvens og < fil > er erstattet med navnet fastq. - Fjerne kammerater af læser, der var frasorteret i de forrige trin ved hjælp af brugerdefinerede scripter.
- Juster Mate 1 resterende par et indeks, der indeholder sekvensen af alle oligonukleotider bruges i biblioteket forberedelse (f.eks. ved hjælp af Butterfly 0.12.8 21 og den befale kø valgmuligheder - m1-v2). Kassér alle par med vellykket alignments.
- Juster resterende par at organismen reference genom ved hjælp af Butterfly med den befale kø valgmuligheder - v2 -X 10000--bedste.
- Kort læser at spændvidde mellem mitokondriel molekyle begyndelsen og slutningen af justering Mate 1 af alle unaligned par (ved hjælp af Butterfly med den befale kø valgmuligheder - v2).
- Afgøre Greven af 5´-enderne for alle enkelt og parret ende linjeføringer. Skifte placeringen af disse ved en base opstrøms til den position, hvor de hydrolyseret ribonucleotides var.
- Eksportdata fra filen Butterfly-format til en bedgraph filformat ved hjælp af brugerdefinerede scripts til visualisering til fælles genom browsere. Normalisere læser hver linje for at læser per million.
- Ved hjælp af position og tæller fra filen bedgraph reference organisme genomet sekvens til at fastslå identiteten på incorporated ribonucleotides.
Bemærk: For den menneskelige mitokondrie genom læser fra regionerne 16.200-300 og 5,747-5,847 for hver strand bør udelukkes da disse områder indeholder mange gratis 5´-enderne ikke er relateret til ribonucleotide indarbejdelse af DNA polymerase γ. - Opdele de samlede læser, ikke herunder læsninger i elleve HincII steder, med det gennemsnitlige antal læser per HincII websted for at få antallet af ribonucleotides pr. enkelt streng pause, (dvs. antallet af ribonucleotides pr. mitokondrie molekyle).
Representative Results
Illustrerer den metode beskrevet ovenfor, repræsentative data blev genereret analysere menneskelige mitokondrie-DNA fra HeLa-celler12. Figur 2B viser de summerede læser på alle HincII websteder i heavy (HS) og lys strand (LS) af humant mtDNA efter KCl behandling (venstre paneler). Omkring lokalisere 70% af alle registrerede 5´-ends til cut-websteder, viser den høje effektivitet af HincII fordøjelse. Behandling af biblioteker med KOH at hydrolysere DNA på integrerede ribonucleotides nedsætter antallet af læser på HincII websteder til omkring 40% (figur 2B, rigtige paneler). Dette forventes, da store mængder af 5´-ends er genereret på websteder ribonucleotide vedtægter, og er vejledende en tilstrækkelig bibliotek kvalitet. Figur 2 c illustrerer lokalisering og hyppigheden af 5´-slutter (green) efter KCl behandling og læser genereret af HydEn-seq (magenta) efter KOH behandling, afsløre både frie 5´-ender og ender genereres på ribonucleotides af alkalisk hydrolyse. Gratis 5´-ends og ribonucleotides lokalisering til HS af humant mtDNA er vist i panelet til venstre og dem lokalisering til LS er vist i højre panel. Det relative antal rå læsninger på ribonucleotides (figur 2D, øverste panel) eller HincII websteder (nederste panel) på HS og LS af mtDNA Vis, henholdsvis, en 14-fold eller 31-fold stærkere dækning af LS i forhold til HS, mens en lignende bias ikke blev observeret for nukleare DNA. Denne strand bias kan forklares ved den tydelig forskel i base sammensætningen af de to tråde og illustrerer betydningen af normalisering til læser på HincII websteder.
Normalisere Læs tæller til HincII giver et kvantitativt mål for antallet af ribonucleotides pr. mitokondrie genomet (figur 3A). Som illustreret i figur 3B, viser læser efter KOH behandling for hver ribonucleotide normaliseret sekvens sammensætningen af hver strand forholdet anderledes end 1, med angivelse af et ikke-tilfældige fordeling af læser tyder på en særskilt ribonucleotide mønster og en høj bibliotek kvalitet. Dette forhold er upåvirket af tidligere fordøjelse med HincII, kontrollere det enzym kavalergang specificitet. Normalisere læser på steder af integrerede ribonucleotides til dem på HincII kavalergang websteder samt til genom nukleotid indhold, genererer en kvantitativ måling af hvor mange af hver ribonucleotide er indarbejdet pr. 1.000 supplerende baser ( Figur 3 c).
Figur 1: skematisk for DNA forarbejdning og bibliotek forberedelse. (1) hele genomisk DNA er kløvet af HincII for normalisering i de efterfølgende kvantitering af ribonucleotides, generere stumpe ender på HincII websteder (sort pilespids). (2) DNA er behandlet med KOH at hydrolysere på ribonucleotide websteder, fører til 2´, 3´-cyklisk fosfat (rød pentagon) på 3´-ender og gratis 5´-OH ender. (3) 5´-OH ender er fosforyleret af T4 Polynucleotide Kinase 3´-fosfatase-minus. (4) alle 5´-ends transporterer en fosfat gruppen er forbundet til ARC140 oligonukleotid af T4 RNA ligase. (5) den anden streng er syntetiseret ved hjælp af T7 DNA Polymerase og ARC76-77 oligonukleotider indeholdende tilfældige N6 sekvenser. (6) biblioteket er forstærket af en high-fidelity DNA Polymerase ved hjælp af ARC49 og en af ARC78 til ARC107 indeks primere som indeholder en unik stregkode for multiplexing. (7) 5´-ends er placeret ved parret ende sekvensering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: metode validering. (A) repræsentative elektroferogrammer genereret ved hjælp af en automatiseret elektroforese system til at bestemme kvaliteten af genereret biblioteker behandlet med KOH eller KCl. (B) Summarized signal på HincII websteder i heavy (HS) og lys strand (LS) humant mtDNA efter KCl (venstre paneler) eller KOH (højre paneler) behandling. (C) Circos figur af gratis 5´-slutter (green) og fra HydEn-Seq (gratis 5´-ends og ribonucleotides, magenta) i HS (venstre panel) og LS (højre panel) humant mtDNA. Toppe er normaliseret til per million læser og den maksimale peak er justeret til det maksimale antal læsninger af HydEn-seq bibliotek. (D) Summarized rå lyder på ribonucleotides (øverste panel) og HincII sites (nederste panel) i tunge (H) og lys (L) strand i humant mtDNA (Mito.) eller i omvendt rækkefølge (RV) eller videresendelse (FW) strand i nukleare (NUK). DNA. Figur B, C og D er tilpasset fra reference12. Fejllinjer udgør standard fejlen af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant resultater. (A) relative antal ribonucleotides normaliseret til læser på HincII websteder for KOH behandlet biblioteker på tunge (H) eller lys (L) strand. (B) forholdet mellem ribonucleotide identitet til mtDNA genom sammensætning for KOH behandlet (KOH) og HincII kløvet med KOH behandlet (HincII + KOH) biblioteker på tunge (H) eller lys (L) strand af mtDNA. (C) Ribonucleotide frekvens normaliseret til 1.000 supplerende baser for HincII og KOH behandlet biblioteker på tunge (H) eller lys (L) strand af mtDNA. Tallene er tilpasset fra reference12. Fejllinjer udgør standard fejlen af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | Sekvens | |||
| ARC49 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC76 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * Nielsen * | |||
| ARC77 | AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C | |||
| ARC78 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC84 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC85 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC86 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC87 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA | |||
Tabel 1: oligonukleotider. Er anført oligonukleotider bruges til HydEn-FF. Fed ansigt angiver indeksering. * angiver en phosphorothioate bond. ARC140 indeholder en 5´-amino gruppe i stedet for en 5´-OH-gruppen i kombination med en C6 linker. Denne ændring reducerer dannelsen af ARC140 concatemers under ligatur.
Discussion
Her vil vi præsentere en teknik til at samtidig kortlægge og kvantificere ribonucleotides i gDNA og mtDNA især, af den simple indførelsen af DNA kavalergang på sekvens specifikke steder i genomet som et supplement til den etablerede HydEn-seq protokol. Mens denne undersøgelse fokuserer på humant mtDNA, blev oprindeligt HydEn-seq-metoden udviklet i Saccharomyces cerevisiae, illustrerer den metode oversættelse til andre organismer12,16.
For pålidelige resultater af denne tilgang, nogle kritiske trin skal bemærkes: (A) da sekventering adaptere ligate til alle tilgængelige 5´-enderne, det er afgørende at arbejde med meget intakt DNA. DNA bør isoleres og biblioteker bør ske helst umiddelbart efter DNA isoleret eller DNA kan opbevares ved-20 ° C. Det anbefales ikke at gemme DNA i køleskabet for lang tid eller at fryse og tø det flere gange. (B) for at generere egnet biblioteker med denne metode, er det afgørende at udføre KOH behandlingen af DNA i ovn inkubation, snarere end en varme blok, sikre ensartet varme i hele prøven og kvantitative hydrolyse. (C) Derudover er det kritisk at kontrollere kvaliteten af biblioteker før gruppering og sekventering. DNA skal kvantificeres og analyseres ved hjælp af en automatiseret elektroforese system til at sikre tilstrækkelige mængder af bibliotek DNA, bekræfte passende fragment størrelser, og indskrive nemlig primer dimerer.
For en meningsfuld dataanalyse er det også vigtigt at bemærke, at den informative værdi af denne metode er afhængig af passende kontrol for at vurdere baggrunden tæller og sekvens eller strand bias. Vi opnå rutinemæssigt en kortlægning effektivitet i KCl prøver af næsten 70%, når kun fordøje med sekvens specifikke liv1975 (figur 2B, venstre paneler). Det er derudover vigtigt at bekræfte, at liv1975 behandling ikke påvirker samlet påvisning af indarbejdet ribonucleotides ved at sammenligne HincII behandlet og ubehandlet prøver (figur 3B). I disse eksperimenter, har vi brugt HincII for at indføre stedsspecifik nedskæringer, selvom andre Hi-Fi-restriktionsenzymer kan også bruges.
Protokollen kunne tilpasses til at studere andre typer af DNA læsioner, der kan forarbejdes til 5´-fosfat eller 5´-OH slutter. Nøjagtigheden af resultaterne er afhængige af specificiteten af forarbejdning og kræver passende kontrol (fx vildtype eller ubehandlet) til verifikation. Desuden, når tilpasning af denne metode til andre programmer eller til brug med andre organismer, bør man overveje at metoden i sin nuværende setup kræver ca. 1 µg af DNA, der er forarbejdet til et bibliotek. Da antallet af ender er afhængig af antallet af integrerede ribonucleotides, som varierer afhængigt af organisme eller mutant, prøver, herunder et lavere antal ribonucleotides ville kræve mere input DNA for at skabe et tilstrækkeligt antal ender i den efterfølgende bibliotek konstruktion. Tilsvarende, hvis DNA-prøver har et langt højere antal af ribonucleotides, vil det også kræve bruger mindre input DNA til at opnå optimale betingelser for ligatur, anden strand syntese og PCR-amplifikation. Det er bemærkelsesværdigt, at bibliotek opbygningen som beskrevet i denne protokol også genereres data for det nukleare genom (som vist i figur 2D) og kun dataanalyse var fokuseret på mtDNA. Dette illustrerer, at større genomer med moderat lavere ribonucleotide frekvenser er også fanget af denne metode.
Når de overvejer denne metode, visse begrænsninger bør tages i betragtning: selv om denne metode bør, i teorien, kunne anvendes på stort set enhver organisme, en passende genom er nødvendige for tilpasning af læser. Endvidere, resultaterne fra vores protokol repræsenterer læser fra et stort antal celler. Specifikke ribonucleotide indarbejdelse mønstre af en delmængde af celler kan ikke identificeres ved denne tilgang. Hvis ribonucleotides er kortlagt i større genomer med et meget lavt antal af ribonucleotides, det kan være en udfordring for at skelne ribonucleotides fra tilfældige rifter og passende kontrol er derfor nødvendigt.
Metoden vi beskrive her, udvider tilgængelige i vivo -teknikker såsom HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, Pu-Seq18eller emRiboSeq19. Disse tilgange drage fordel af den integrerede ribonucleotides følsomhed over for basisk eller RNase H2 behandling, henholdsvis beskæftiger næste generation sequencing at identificere ribonucleotides genome-wide, som giver deres kortlægning og sammenligning af relative indarbejdelse. Ved at holde DNA-sekvens specifikt, som beskrevet ovenfor, ud over alkalisk hydrolyse på integrerede ribonucleotides, kan læser til ribonucleotides normaliseres webstedernes kavalergang, ikke kun identifikation og kortlægning af ribonucleotides, men også deres kvantitering for hver DNA-molekylet. Anvendelsen af vores teknik i forbindelse med sygdomme relateret til DNA-replikation, DNA reparation og TLS kunne give en dybere forståelse af rollen, som ribonucleotides i underliggende molekylære mekanismer og genom integritet i almindelighed.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af svenske Forskningsråd (www.vr.se) tilskud til ARC (2014-6466 og det svenske Institut for strategisk forskning (www.stratresearch.se) til ARC (ICA14-0060). Chalmers University of Technology ydet finansiel støtte til MKME under dette arbejde. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
| 10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0216L | |
| 1x PBS | Medicago | 09-9400-100 | dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 33539-1L-GL-R | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| 50 mL Centrifuge Tube | VWR | 525-0610 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP, 10 mM) | New England Biolabs | P0756S | dilute with EB to 2 mM |
| Agilent DNA 1000 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | referred to as EB |
| CleanPCR paramagnetic beads | CleanNA | CPCR-0050 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each) | New England Biolabs | N0447L | dilute with EB to 2 mM |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61965026 | |
| DynaMag 96 Side | Thermo Fisher | 12331D | |
| Ethanol 99.5% analytical grade | Solveco | 1395 | dilute with milliQ water to 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M) | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC | AppliChem | A6906,0125 | |
| Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6) | Sigma-Aldrich | H7891-5G | dissolve in nuclease-free H2O for 10 M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment. |
| HincII | New England Biolabs | R0103S | supplied with NEBuffer 3.1 |
| Hybridiser HB-1D | Techne | FHB4DD | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Kapa Biosystems | KK2602 | |
| Lysis buffer | 50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 µg/mL), 1% SDS | ||
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Microcentrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000014 | |
| Microcentrifuge MiniStar silverline | VWR | 521-2844 | |
| Multiply µStripPro 0.2 mL tube | Sarstedt | 72.991.992 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| Phenol – chloroform – isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 26764.232 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Potassium hydroxide (KOH) | VWR | 26668.296 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Refrigerated Centrifuge 4K15 | Sigma Laboratory Centrifuges | No. 10740 | |
| SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553-035 | |
| Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc) | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 27810.295 | dissolve in nuclease-free H2O for 5 M solution, sterile filter |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (3' phosphatase minus) | New England Biolabs | M0236L | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204L | supplied with PEG 8000 (50%) |
| T7 DNA Polymerase (unmodified) | New England Biolabs | M0274S | supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer |
| TE Buffer | Invitrogen | 12090015 | |
| ThermoMixer F2.0 | Eppendorf | 5387000013 |
References
- Traut, T. W. Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines. Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).
- McElhinny, S. A. N., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).
- Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta. DNA Repair. 12, 121-127 (2013).
- Potenski, C. J., Klein, H. L. How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells. Nucleic Acids Res. 42, 10226 (2014).
- Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors. Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).
- Ghodgaonkar, M. M., et al. Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair. Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).
- DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide. Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).
- Li, Y. F., Breaker, R. R. Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 '-hydroxyl group. J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).
- McElhinny, S. A. N., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).
- Berglund, A. K., et al. Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA. Plos Genet. 13, (2017).
- Brown, J. A., Suo, Z. C. Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases. Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair. Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved. Plos Genet. 7, (2011).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).
- Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat. Methods. 12, 251 (2015).
- Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq). Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).
- Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq. Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, (2009).
