Summary
Hier beschrijven we een methode die zich lenen voor het gelijktijdig kwantificeren en genoom-brede kaart ribonucleotides in zeer intact DNA op single-nucleotide de resolutie, enzymatische splitsing van genomic DNA te combineren met de alkalische hydrolyse en de daaropvolgende 5´-end sequencing.
Abstract
Gevestigde benaderingen om het aantal ribonucleotides aanwezig in een genoom te schatten zijn beperkt tot de kwantificatie van opgenomen ribonucleotides met behulp van korte synthetisch DNA-fragmenten of plasmiden als sjablonen en vervolgens het extrapoleren van de resultaten voor de hele genoom. Anderzijds kan het aantal ribonucleotides aanwezig in een genoom worden geschat met behulp van alkalische gels of zuidelijke blots. Meer recente in vivo benaderingen hanteren Next-generation sequencing waardoor genoom-brede toewijzing van ribonucleotides, bieden de positie en de identiteit van de ingesloten ribonucleotides. Ze laat echter geen kwantificatie van het aantal ribonucleotides die in een genoom worden verwerkt. Hier beschrijven we hoe u kunt gelijktijdig kaart en kwantificeren van het aantal ribonucleotides die zijn opgenomen in de menselijke mitochondriaal DNA in vivo door Next-generation sequencing. Wij gebruiken zeer intact DNA en voeren reeks specifieke dubbele strand einden door het met een endonuclease, daarna hydrolyseerd opgenomen ribonucleotides met alkali verteren. De gegenereerde uiteinden worden afgebonden met adapters en deze uiteinden zijn sequenced op een Next-generation sequencing machine. Het absolute aantal ribonucleotides kan worden berekend als het aantal leest buiten de erkenning site per gemiddeld aantal leest op de site van erkenning voor de reeks specifieke endonuclease. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de kaart en kwantificeren van gratis nicks in DNA en kan aanpassing aan andere DNA-letsels die kunnen worden verwerkt toewijzen aan 5´-OH eindigt of 5´-fosfaat eindigt. Bovendien, deze methode geschikt is voor elk organisme, gezien het feit dat een geschikte referentiemiddelen genoom beschikbaar is. Dit protocol is daarom een belangrijk instrument om te bestuderen van de DNA-replicatie, 5´-end verwerking, DNA-beschadiging en DNA-herstel.
Introduction
In een eukaryotische cel is de concentratie van ribonucleotides (rNTPs) veel hoger dan de concentratie van deoxyribonucleotides (dNTPs)1. De polymerase van DNA discrimineren tegen ribonucleotides, maar deze discriminatie is niet perfect en, dientengevolge, ribonucleotides in plaats van deoxyribonucleotides kunnen worden opgenomen in genomen tijdens de replicatie van DNA. Ribonucleotides kan de meest voorkomende niet-canonieke nucleotiden in het genoom2opgenomen worden. De meeste van deze ribonucleotides zijn verwijderd tijdens Okazaki-fragment rijping door RNase H2 ingewijden ribonucleotide excisie reparatie (RER) of door Topoisomerase 1 (herzien in verwijzing3). Ribonucleotides die niet kunnen worden verwijderd blijven stabiel verwerkt in het DNA2,4 en kunnen beïnvloeden het op zowel gunstige als schadelijke manieren (herzien in herziene5). Naast de mogelijkheid om op te treden als positieve signalen, bijvoorbeeld in het type paring schakelen in Schizosaccharomyces pombe6 en markering van de ontluikende bundel van DNA tijdens mismatch reparatie (BMR)7,8, ribonucleotides van invloed zijn op de 9 van de structuur en stabiliteit van de omliggende DNA als gevolg van de 2´-hydroxylgroep van hun ribose10, wat resulteert in Dr. stress en genoom instabiliteit11. De overvloed van ribonucleotides in genomic DNA (gDNA) en hun relevantie in replicatie herstelmechanismes, alsmede de gevolgen voor de stabiliteit van het genoom, geven reden te onderzoeken hun precieze vóórkomen en frequentie in een genoom-brede manier.
RNase H2-activiteit is niet gevonden in menselijke mitochondriën en ribonucleotides zijn daarom niet efficiënt verwijderd in het mitochondriaal DNA (mtDNA). Verschillende trajecten betrokken zijn bij de levering van nucleotiden aan menselijke mitochondriën en om te onderzoeken of verstoringen in het zwembad van de mitochondriale nucleotide een verhoogde aantal ribonucleotides in menselijke mtDNA veroorzaken, ontwikkelden we een protocol kaart te kwantificeren Deze ribonucleotides in menselijke mtDNA geïsoleerd van fibroblasten, HeLa cellen en patiënt cel lijnen12.
De meeste in vitro benaderingen (herzien in herziene13) om te bepalen van de polymerase van DNA selectiviteit tegen rNTPs zijn gebaseerd op één ribonucleotide invoegen of primer extensie experimenten waar concurrerende rNTPs zijn opgenomen in de reactie mix, zodat de identificatie of de relatieve kwantificatie van ribonucleotide opneming in korte DNA-sjablonen. Kwantitatieve benaderingen op korte reeksen kunnen niet weerspiegelen dNTP en rNTP zwembaden bij cellulaire concentraties en daarom inzicht polymerase selectiviteit maar zijn van beperkte betekenis met betrekking tot de hele genoom. Het is aangetoond dat de relatieve hoeveelheid ribonucleotides tijdens de replicatie van een langere DNA-sjabloon, zoals een plasmide, opgenomen kan worden gevisualiseerd op een gel sequencing met behulp van radiolabeled dNTPs en hydrolyseerd het DNA in een alkalisch milieu-14. Bovendien heeft gDNA op zuidelijke vlekken na de alkalische hydrolyse, waardoor strand-specifieke indringende en bepaling van absolute tarieven van ribonucleotide opneming in vivo15is geanalyseerd. Deze benaderingen toestaan een relatieve vergelijking van de opname frequentie, maar leveren geen inzicht in de positie of de identiteit van de opgenomen ribonucleotides. Meer recente benaderingen voor het analyseren van de inhoud van de ribonucleotide in gDNA in vivo, zoals HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, Pu-Seq18of emRiboSeq19, profiteren van de ingesloten ribonucleotides gevoeligheid voor alkaline of RNase H2 behandeling, respectievelijk, en Next-generation sequencing te identificeren ribonucleotides genoom-brede in dienst. Deze methoden geven geen inzicht in de frequentie van de absolute opneming van de gedetecteerde ribonucleotides. De stap van een reeks specifieke enzymatische decollete aan het HydEn-seq-protocol toevoegt, de methode we hier gemakshalve beschrijven breidt de informatie die is opgedaan met een benadering van sequencing, waardoor gelijktijdige toewijzing en kwantificatie van ingesloten ribonucleotides12. Deze methode is van toepassing op vrijwel elk organisme gezien het feit dat zeer intact DNA-fragmenten kunnen worden gegenereerd en een geschikte referentiemiddelen genoom beschikbaar is. De methode kan worden aangepast aan het kwantificeren en bepalen de locatie van een laesie dat kan worden verteerd door een nuclease en laat een 5´-fosfaat of een 5´-OH-einde.
Kaart en kwantificeren van ribonucleotides in genomic DNA, de methode combineert decolleté door een reeks specifieke endonuclease en alkalische hydrolyse genereren 5´-fosfaat eindigt op plaatsen waar de volgorde van de specifieke erkenning voor de endonuclease zich bevindt en 5´- OH eindigt op posities waar de ribonucleotides gelegen waren. Aangezien de gegenereerde vrije uiteinden vervolgens als ligatuur zijn verbonden met adapters en sequenced met behulp van Next-generation sequencing, is het van belang is voor het gebruik van zeer intact DNA en Vermijd willekeurige fragmentatie tijdens voorbereiding van DNA-extractie en bibliotheek. Beoordeling van deze leest genormaliseerd naar de leest op de endonuclease decollete sites kunt een gelijktijdige kwantificatie en de toewijzing van de gedetecteerde ribonucleotides. Vrije 5´-uiteinden worden gedetecteerd in controle experimenten waarbij de alkalische hydrolyse van DNA wordt vervangen door behandeling met KCl. De opgehaalde gegevens bieden inzicht in ribonucleotide locatie en hoeveelheid en analyses met betrekking tot ribonucleotide inhoud en opname frequentie staat.
Protocol
dit protocol is uiteengezet in Figuur 1 en bevat het isolement van gDNA, spijsvertering met enzymen van de beperking te kunnen kwantificeren van het aantal ribonucleotides, behandeling met alkali om te hydrolyseren de phosphodiester banden van ribonucleotides opgenomen in de gDNA, de fosforylatie van gratis 5´-OH eindigt, ssDNA Afbinding van adapters, tweede onderdeel synthese, en PCR versterking voor sequencing.
1. adapters en Index inleidingen
- ARC49 verkrijgen, ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, adapter en ARC78-ARC107 index inleidingen (Zie tabel 1).
Opmerking: Moet Oligonucleotides HPLC gezuiverd. ARC76/77 zijn besteld als duplex. - Bereiden 100 µM voorraadoplossingen van elke oligonucleotide in Tris-EDTA (TE) buffer (Zie de Tabel van materialen) en opgeslagen bij -20 ° C.
- Bereiden 10 µM oplossingen voor ARC67/77 en 2 µM oplossingen voor ARC49 en index inleidingen door verder verdunnen in elutie buffer (EB; Zie de Tabel van de materialen). Winkel bij-20 ° C.
2. Groei en oogst van cellen
- groeien HeLa cellen in 70 mL Dulbecco ' s gewijzigd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum in een Spinner kolf van 250 mL bij 37 ° C.
- Het aantal cellen tellen en verzamelen van 5 x 10 6 cellen in een 50 mL-buis, centrifuge voor 5 min. op 200 x g, en verwijder het supernatant.
- Wassen van de cellen met 20 mL 1 x PBS, centrifuge voor 5 min. op 200 x g, en verwijder het supernatant.
- Het bevriezen van de pellets op-20 ° C of voortzetten van DNA zuivering.
3. DNA zuivering en kwantificatie
- gDNA met behulp van fenol-chloroform extractie, zoals hieronder beschreven zuiveren.
- Resuspendeer de cellen in 2 mL lysis-buffermengsel (Zie de Tabel van materialen) en incubeer gedurende 30 min op 42 ° C op een blok Verwarming.
Let op: Lysis buffer bevat gevaarlijke componenten. SDS oplossing is irritant, proteïnase K sensibilisatie, irriterende en giftige. Draag beschermende kleding en handschoenen. - Splitsen van het monster in twee buizen van 2 mL en voeg 1 volume (V) van fenol-chloroform-Isoamylalcohol (25:24:1).
Let op: Fenol-chloroform-Isoamylalcohol is toxische, mutagene, bijtende en gevaarlijk zijn voor het aquatisch milieu. Gebruiken in een zuurkast, Draag handschoenen en beschermende kleding en negeren in speciale fenol-chloroform afval. - Mix door inversie voor 30-60-s en Centrifugeer gedurende 5 min op 15.000 x g bij kamertemperatuur.
Opmerking: Geen vortex DNA om te voorkomen dat de invoering van willekeurige strand einden, waarmee de resultaten zou verstoren. - De bovenste, waterige fase overbrengen in een nieuwe tube 2 mL en voeg 1 V van fenol-chloroform-Isoamylalcohol (25:24:1).
- Mix door inversie en Centrifugeer gedurende 5 min bij 15.000 x g bij 4 ° C.
- Transfer bovenste, waterige fase om een nieuwe 2 mL tube en Voeg 20 µL NaCl (5 M) en 1 V van koude isopropanol.
Let op: Isopropanol is ontvlambaar, irriterend en giftig. Opslaan in een geventileerde kabinet, Draag handschoenen en beschermende kleding, en het wegblijven van vlammen. - Mix door inversie en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij -20 ° C.
- Centrifuge voor 20 min op 15.000 x 4 ° C, g en negeren supernatant.
- Wassen DNA pellet met 200 µL koude 70% ethanol, Centrifugeer gedurende 20 min bij 15.000 x g bij 4 ° C en weggeworpen.
Let op: 70% ethanol is brandbaar en irritant. Werkende oplossing bij-20 ° C, anders slaan in geventileerde kabinet, Draag beschermende kleding en handschoenen en bewaart het uit de buurt van vlammen. - Droog de pellet DNA bij kamertemperatuur gedurende 20-25 minuten
- DNA los pellets in 100 µL TE bufferen en bundelen van de monsters in één buis.
- Resuspendeer de cellen in 2 mL lysis-buffermengsel (Zie de Tabel van materialen) en incubeer gedurende 30 min op 42 ° C op een blok Verwarming.
- Kwantificeren DNA-concentratie met behulp van een reagens kwantificatie dsDNA volgens fabrikant ' s-specificaties (Zie de Tabel van de materialen).
Opmerking: Gebruik een dsDNA kwantificatie reagens, omdat spectrofotometrische kwantificatie van DNA kan worden beïnvloed door residuele fenol. - Winkel DNA bij-20 ° C of HincII behandeling voortzetten.
4. HincII behandeling en alkalische hydrolyse
- Digest 1 µg van DNA in een reactie mix 5 µL 10 x buffer 3.1, 1 µL (10 U) met HincII en nuclease-vrije H 2 O tot een eindvolume van 50 µL.
Opmerking: Om te bereiken optimale omstandigheden voor afbinding, tweede onderdeel synthese en PCR versterking, het kan noodzakelijk zijn verhogen de hoeveelheid invoer DNA als de verwachting is dat het DNA een zeer lage aantal ribonucleotides bevat. Ook kan het nodig zijn input DNA vermindert indien het aantal ribonucleotides zeer hoog is. - Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- HincII zuiveren DNA behandeld met paramagnetisch kralen.
Opmerking: Houd de buis deksels openen in de volgende stappen uit om de pellets niet te verstoren door het openen van de buizen.- Toevoegen 1,8 V van paramagnetisch kralen aan elk monster, meng zorgvuldig door pipetteren, en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten
- Een magnetische rack kunt pellet de kralen voor 5 minuten, haal hem eruit en vloeistof wordt weggeworpen.
- Wassen van de pellet met 150 µL van 70% ethanol (kamertemperatuur) voor ongeveer 30 s dan verwijderen en negeren het supernatant.
- Wassen de pellet met 200 µL van 70% ethanol (kamertemperatuur) voor ongeveer 30 s dan verwijderen en verwijder het supernatant.
Opmerking: Residuele ethanol kan worden verwijderd met een pipet 10 µL. Druppels kunnen worden gesponnen beneden kort tevoren. - Droog de monsters bij kamertemperatuur voor ongeveer 15-20 min.
Opmerking: De exacte tijd hangt af van de omvang van de kralen en de vorm van de pellet, dus de pellets moeten visueel worden gecontroleerd. - Buizen verwijderen uit het magnetische rek en elueer pellet in 45 µL EB, Meng door zorgvuldig pipetteren.
- Broeden voor 5 min dan pellet de kralen op het magnetische rek en het gebruik van 45 µL van gezuiverde DNA in stap 4.4.
- Toevoegen 5 µL van KOH (3 M) of KCl (3 M) tot het creëren van een totaal volume van 50 µL DNA.
Let op: 3 M KOH-oplossing is corrosief. Draag beschermende kleding en handschoenen. - Incubate voor 2 h bij 55 ° C in een kruising oven gevolgd door 5 min op ice.
Opmerking: Het wordt aanbevolen voor het uitvoeren van de KOH-behandeling in een oven in plaats van een blok van de verwarming te handhaven van een uniform verwarming van de buis en voorkoming van condensatie op de deksel. - Precipiteren DNA door toevoeging van 10 µL Natriumacetaat (3 M, pH = 5.2) en 125 µL koude 100% ethanol. Incubeer op ijs voor 5 min.
Let op: 100% ethanol is brandbaar en irritant. Opslaan in een geventileerde kast, dragen van beschermende kleding en handschoenen en blijf uit de buurt van vlammen. - GDNA pellet door centrifugatie bij 21.000 x g, 4 ° C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Wassen DNA pellet met 250 µL koude 70% EtOH, centrifugeer bij 21.000 x g, 4 ° C gedurende 5 minuten, en verwijder het supernatant.
Opmerking: Als u druppels, de buis kan omlaag worden gesponnen, kort weer en supernatant kan worden verwijderd met een pipet 10 µl. - Laat de pellet drogen in een open buis voor ongeveer 5-10 minuten totdat alle zichtbare vloeistof is verdampt.
- Laat DNA pellet los in 20 µL EB gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
5. 5´ einde fosforylatie
- bereiden de reactie mix voor elk monster tevoren tegensisting van 2,5 µL 10 x T4 polynucleotide kinase reactie buffer 1 µL (10 U) 3´-fosfatase-minus T4 polynucleotide kinase en 2.5 µL ATP (10 mM).
- Transfer 19 µL van elk DNA monster in een nieuwe 200 µL buis en denatureren voor 3 min op 85 ° C in een thermo-cycler.
- Cool DNA monsters op ijs en 6 µL van reactie mix toevoegen aan elk monster.
- Incubate reactie mixen bij 37 ° C gedurende 30 minuten en stop de reactie van de monsters bij 65 ° C gedurende 20 min. aan het broeden
- Zuiveren DNA als beschreven in 4.3, met behulp van 1,8 V van paramagnetisch parels maar Elueer in 14 µL EB.
6. afbinding ssDNA
- de reactie mix voorbereiden in elk monster vooraf bestaande uit 0,5 µL ATP (2 mM), 5 µL 10 x T4 RNA ligase reactie buffer, 5 µL CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), 0,5 µL ARC140 (100 µM), en 25 µL 50% PEG 8000. Meng goed door pipetteren.
Let op: CoCl 3 (NH 3) 6 is kankerverwekkend, sensibilisatie en gevaarlijk zijn voor het aquatisch milieu. Draag beschermende kleding en handschoenen. - Transfer 13 µL van gezuiverde DNA van 5.5 stap naar een nieuwe 200 µL buis en denatureren voor 3 min op 85 ° C in een thermo-cycler.
- Cool het DNA op ijs en voeg 36 µL van reactie mix aan elk monster, Meng door pipetteren, en spin down kort.
- Voeg 1 µL (10 U) van T4 RNA Ligase naar elke reactie, Meng door pipetteren, en spin down kort.
- De monsters bij kamertemperatuur incuberen in de donkere overnachting.
7. Tweede-onderdeel synthese
- zuiveren afgebonden DNA zoals beschreven in 4.3, maar gebruik van 0,8 V van paramagnetisch kralen, pellet de kralen voor 10 min en elueer in 20 µL EB.
Opmerking: Als gevolg van de hogere viscositeit van de afbinding reactie mix, is de eerste stap van de pelleting verlengd. - Transfer 20 µL van DNA-monster tot een nieuwe 200 µL PCR koker. Herhaal de stap van de zuivering met behulp van 0,8 V van paramagnetisch kralen na de fabrikant ' s specificaties en elueer in 14 µL EB.
- De reactie mix voorbereiden op elk monster vooraf bestaande uit 2 µL van 10 x T7 polymerase van DNA reactie buffer, 2 µL ARC76/77 (2 µM), 2 µL dNTPs (2 mM) en 0.8 µL BSA (1 mg/mL).
- Transfer 12,8 µL gezuiverd DNA tot een nieuwe 200 µL buis, denatureren voor 3 min op 85 ° C in een thermo-cycler.
- Afkoelen van het DNA op ijs en 6.8 µL van reactie mix aan elk monster, Meng door pipetteren spin down kort en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur toevoegen.
- 0.4 µL (4 U) T7 DNA polymerase toevoegen aan elke reactie en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuiveren DNA als beschreven in 4.3, met behulp van 0,8 V van paramagnetisch kralen en elueer in 11 µL EB.
8. PCR versterking en bibliotheek Quantitation
- voorbereiden de reactie mix voor elk monster in een nieuwe 200 µL buis vooraf bestaande uit 7,5 µL ARC49 (2 µM), 7,5 µL index primer (2 µM, uniek voor elk monster) en 25 µL 2 x warme start klaar mix.
- Voeg toe 10 µL van DNA-monster naar elke reactie. Versterken van de bibliotheek met behulp van de volgende voorwaarden: denatureren bij 95 ° C gedurende 45 s, gevolgd door 18 cycli van 98 ° C voor 15 s, 65 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s, eindigend met een definitieve rek bij 72 ° C gedurende 2 min. Hold monsters op 4 ° C na versterking.
- Zuiveren van Bibliotheken, zoals beschreven in 4.3, met behulp van 0,8 V van paramagnetisch kralen, en elueer in 20 µL TE buffer.
- Kwantificeren van bibliotheken met behulp van een reagens dsDNA kwantificatie, volgens de fabrikant ' s-specificaties (Zie de Tabel van de materialen).
- Opslaan van monsters bij-20 ° C of bibliotheek analyse voortzetten.
9. Bibliotheek analyse en samenbrengen
- bepalen de kwaliteit van elke bibliotheek en de raming van de omvang van de gemiddelde fragment met behulp van een systeem van digitale elektroforese.
Opmerking: De gemiddelde fragment grootte wordt beoordeeld door te schatten waar het oppervlak onder de kromme van de electropherogram is gehalveerd, rekening te houden met pieken van markeringen. Representatieve resultaten van geschikte bibliotheek profiles na KOH of KCl behandeling worden gegeven in figuur 2A. - Bereken de concentratie (nM) van de bibliotheken als:
(c/10 3) /(p*650)] * 10 9
waar c is de concentratie van de bibliotheek in ng/µL is en p de grootte van de gemiddelde fragment in bp, als geraamd in 9.1. - Pool gelijke molaire hoeveelheden van maximaal 24 bibliotheken versterkt met andere index inleidingen voor het rangschikken. Toevoegen TE buffer tot een eindvolume van 25 µL en concentratie van 10 nM.
Opmerking: Afhankelijk van het aantal bibliotheken om te worden samengevoegd, is het bedrag van DNA uit elke bibliotheek aangepast. Als inleidingsdimeer zijn aangetroffen in stap 9.1 als een duidelijke piek van ongeveer 130 bp, het eindvolume van het zwembad van de bibliotheek kan groter zijn dan 25 µL, omdat de zuivering wordt herhaald, zoals beschreven in 4.3, met behulp van 0,8 V van paramagnetisch kralen, en DNA wordt geëlueerd in 25 µL TE buf fer.- Bepalen de nieuwe bibliotheek zwembad concentratie met behulp van een reagens kwantificatie dsDNA volgens fabrikant ' s specificaties en de gemiddelde grootte piek zoals hierboven beschreven. Overgaan tot de sequentiebepaling en data analyse (artikelen 10 en 11).
10. Sequencing
- 75-base gekoppeld-einde sequencing uitvoeren op gebundelde bibliotheken 12.
11. gegevensanalyse
- Trim alle leesbewerkingen te verwijderen van de adapter sequenties, filteren op kwaliteit en lengte lezen.
Opmerking: Dit kan gebeuren met behulp van cutadapt 1.2.1 20 met de opdracht ' cutadapt -f fastq--wedstrijd-lezen-jokertekens--quiet -m 15 - q 10 - een NNNNNNN < bestand >', waarbij de NNNNNNN wordt vervangen door de werkelijke adapter volgorde en < bestand > is vervangen door de bestandsnaam fastq. - Verwijderen van stuurlieden van luidt dat werden weggegooid in de vorige stap met behulp van aangepaste scripts.
- Uitlijnen Mate 1 blijven paren aan een index met de volgorde van alle oligonucleotides worden gebruikt voor de bereiding van de bibliotheek (bijvoorbeeld met behulp van Bowtie 0.12.8 21 en de opdrachtregel opties - m1-v2). Negeren van alle paren met succesvolle afstemmingen.
- Uitlijnen resterende paren aan het organisme referentie genoom met Bowtie via de opdrachtregel opties - v2 -X 10000--beste.
- Kaart leest die span tussen de mitochondriale molecuul begin en het einde door het uitlijnen van Mate 1 van alle unaligned paren (met Bowtie via de opdrachtregel opties - v2).
- Bepalen het aantal 5´-uiteinden voor alle interne en gepaarde einde uitlijning. Verschuiven van de positie van deze door een base stroomopwaarts naar de positie waar de gehydrolyseerde ribonucleotides.
- Export uit het bestand bowtie gegevensindeling naar een bestandsindeling van de bedgraph met behulp van aangepaste scripts voor visualisatie gemeen genoom browsers. Normaliseren van de leest voor elk onderdeel te lezen per miljoen.
- Met behulp van de positie en de graven van het bedgraph-bestand, verwijst naar het genoom van het organisme om te bepalen van de identiteit van incorporated ribonucleotides.
Opmerking: Voor de menselijke mitochondriaal genoom leest van de regio's 16,200-300 en 5,747-5,847 voor elk onderdeel moet worden uitgesloten, omdat deze gebieden veel vrije 5´-uiteinden die niets met ribonucleotide opneming door DNA polymerase γ bevatten. - Verdelen van het totale luidt, niet met inbegrip van leest op de elf HincII-sites, met het gemiddelde aantal leest per HincII site om het aantal ribonucleotides per enkele streng pauze, (d.w.z. het aantal ribonucleotides per molecuul mitochondriale).
Representative Results
Ter illustratie van de methodologie zoals hierboven beschreven, representatieve gegevens werden gegenereerd analyseren van menselijke mitochondriaal DNA van HeLa cellen12. Figuur 2B toont de samengevatte leest op alle HincII sites in zware (HS) en lichte onderdeel (LS) van menselijke mtDNA na KCl behandeling (linker panelen). Ongeveer localiseren 70% van alle gedetecteerde 5´-uiteinden naar de cut-sites, tonen de hoge efficiëntie van de HincII spijsvertering. Behandeling van bibliotheken met KOH te hydrolyseren het DNA op ingesloten ribonucleotides vermindert het aantal leest op HincII plaatsen tot ongeveer 40% (figuur 2B, juiste panelen). Dit wordt verwacht, aangezien grote aantallen 5´-ends worden gegenereerd op de sites van ribonucleotide opneming, en is een indicatie van een voldoende kwaliteit van de bibliotheek. Figuur 2C illustreert de lokalisatie en de frequentie van 5´-ends (groen) nadat KCl behandeling en leest gegenereerd door HydEn-seq (magenta) na de behandeling van de KOH, opsporen van zowel vrije 5´-uiteinden en eindigt op ribonucleotides gegenereerd door alkalische hydrolyse. Vrije 5´-uiteinden en ribonucleotides aan de HS van menselijke mtDNA lokaliseren worden weergegeven in het linker paneel en die lokaliseren de LS worden weergegeven in het rechter paneel. Het relatieve aantal ruwe leest ribonucleotides (figuur 2D, bovenste deelvenster) of HincII websites (het onderste deelvenster) op de HS en LS van mtDNA tonen, respectievelijk, een 14-fold of 31-fold sterker dekking van de LS ten opzichte van de HS, terwijl een vergelijkbare bias was niet waargenomen voor nucleaire DNA. Dit strand-bias kan worden verklaard door het duidelijke verschil in samenstelling van de basis van de twee strengen en illustreert het belang van de normalisatie te lezen op HincII plaatsen.
Normaliseren lezen telt naar HincII geeft een kwantitatieve meting van het aantal ribonucleotides per mitochondriaal genoom (figuur 3A). Zoals geïllustreerd in figuur 3B, weergeven het luidt na KOH behandeling voor elke ribonucleotide genormaliseerd naar de samenstelling van de volgorde van elk onderdeel een verhouding anders dan 1, met vermelding van een niet-willekeurige verdeling van luidt suggereert een aparte ribonucleotide patroon en een bibliotheek van hoge kwaliteit. Die verhouding wordt beïnvloed door eerdere spijsvertering met HincII, verifiëren van het enzym decollete specificiteit. Normaliseren van de leest op de sites van de ingesloten ribonucleotides die op HincII decollete sites, alsmede op de inhoud van de nucleotide genoom, genereert een kwantitatieve meting van hoeveel van elke ribonucleotide zijn opgenomen per 1.000 complementaire basen ( Figuur 3 c).
Figuur 1: Schematische voor DNA verwerking en bereiding van de Library. (1) hele genomic DNA is gekloofd door HincII voor normalisatie in de daaropvolgende kwantificatie van ribonucleotides, het genereren van botte eindigt op HincII sites (zwarte pijlpunt). (2) het DNA wordt behandeld met KOH te hydrolyseren op ribonucleotide sites, wat leidt tot 2´, 3´-cyclische fosfaat (rode pentagon) aan 3´-uiteinden en vrije 5´-OH eindigt. (3) 5´-OH eindigt zijn phosphorylated door T4 Polynucleotide Kinase 3´-fosfatase-minus. (4) alle 5´-uiteinden een fosfaatgroep uitvoering als ligatuur zijn verbonden aan de ARC140 oligonucleotide door T4 RNA ligase. (5) het tweede deel wordt gesynthetiseerd met behulp van T7 Polymerase van DNA en de ARC76-77 oligonucleotides met willekeurige N6 reeksen. (6) de bibliotheek wordt versterkt door een Polymerase van DNA van HiFi-met behulp van ARC49 en een van de ARC78 te ARC107 index inleidingen met een unieke streepjescode voor multiplexing. (7) 5´-ends bevinden zich door gekoppeld-einde sequentiebepaling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: validering van methoden. (A) representatieve electropherograms gegenereerd met behulp van een geautomatiseerde elektroforese systeem om te bepalen van de kwaliteit van de gegenereerde bibliotheken behandeld met KOH of KCl. (B) Summarized signaal op HincII plaatsen in zware (HS) en lichte strand (LS) menselijke mtDNA na KCl (linker panelen) of KOH (juiste panelen) behandeling. (C) Circos figuur van vrije 5´-uiteinden (groen) en HydEn-Seq (vrije 5´-uiteinden en ribonucleotides, magenta) in HS (linkerdeel) en LS (rechtervenster) menselijke mtDNA. Pieken zijn genormaliseerd naar per miljoen leest en de maximale piek is aangepast aan het maximum aantal leest van de HydEn-seq-bibliotheek. (D) Summarized rauwe leest bij ribonucleotides (bovenste deelvenster) en HincII sites (lagere paneel) in zware (H) en licht (L) strand in menselijke mtDNA (Mito.) of in omgekeerde richting (RV) of forward (FW) strand in nucleaire (NOC). DNA. Cijfers B, C en D zijn aangepast van referentie12. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger resultaten. (A) de relatieve aantal ribonucleotides genormaliseerd naar leest op HincII sites voor KOH behandeld bibliotheken op de zware (H) of licht (L) strand. (B) verhouding van ribonucleotide identiteit aan mtDNA genoom compositie voor KOH behandeld (KOH) en gekloofd HincII met KOH behandeld (HincII + KOH) bibliotheken op de zware (H) of licht (L) onderdeel van mtDNA. (C) Ribonucleotide frequentie genormaliseerd naar 1,000 complementaire basen voor HincII en KOH behandeld bibliotheken op de zware (H) of licht (L) onderdeel van mtDNA. Cijfers zijn aangepast van referentie12. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Naam | Volgorde | |||
| ARC49 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC76 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N | |||
| ARC77 | AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C | |||
| ARC78 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC84 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC85 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC86 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC87 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA | |||
Tabel 1: Oligonucleotides. Vermeld de oligonucleotides voor HydEn-Seq. gebruikt zijn Vet geeft indexeren. * geeft een phosphorothioate band. ARC140 bevat een 5´-amino groep in plaats van een 5´-OH-groep, in combinatie met een linker C6. Deze wijziging vermindert de vorming van ARC140 concatemers tijdens de afbinding.
Discussion
Hier presenteren we een techniek om gelijktijdig kaart en kwantificeren van de ribonucleotides in gDNA en mtDNA in het bijzonder door de eenvoudige introductie van DNA decollete op volgorde specifieke locaties in het genoom als een toevoeging aan het gevestigde HydEn-seq-protocol. Terwijl deze studie concentreert zich op menselijke mtDNA, werd oorspronkelijk de HydEn-seq-methode ontwikkeld in Saccharomyces cerevisiae, ter illustratie van de methode vertaling naar andere organismen12,16.
Voor betrouwbare resultaten van deze aanpak, sommige kritische stappen dient te worden opgemerkt: (A) Aangezien sequencing adapters aan alle beschikbare 5´-einden afbinden, het is van cruciaal belang om te werken met zeer intact DNA. DNA worden geïsoleerd en bibliotheken moeten bij voorkeur plaatsvinden onmiddellijk na DNA isolatie of het DNA kan worden opgeslagen bij-20 ° C. Het is niet aanbevolen voor het opslaan van DNA in de koelkast voor een lange tijd of om het herhaaldelijk bevriezen en ontdooien het. (B) voor het genereren van geschikte bibliotheken met deze methode, is het van cruciaal belang voor het uitvoeren van de KOH-behandeling van het DNA in een incubatie-oven, in plaats van een blok van Verwarming, waarborging van homogene verwarming van de gehele monster en kwantitatieve hydrolyse. (C) Bovendien is het cruciaal voor controle van de kwaliteit van bibliotheken voor groeperen en rangschikken. Het DNA moet worden gekwantificeerd en geanalyseerd met behulp van een geautomatiseerde elektroforese systeem om voldoende hoeveelheden van bibliotheek DNA, passende fragment maten bevestigen en controleren voor inleidingsdimeer.
Voor een zinvolle data-analyse is het ook belangrijk op te merken dat de informatieve waarde van deze methode is afhankelijk van de nodige controles om de graven van de achtergrond en sequentie of strand vooroordelen te beoordelen. Regelmatig bereiken we de efficiëntie van een toewijzing in KCl monsters van bijna 70% wanneer slechts verteren met de reeks specifieke endonuclease (figuur 2B, linker panelen). Daarnaast is het belangrijk om te bevestigen dat de endonuclease behandeling is niet van invloed op de totale detectie van opgenomen ribonucleotides door het vergelijken van HincII behandeld en onbehandeld monsters (figuur 3B). In deze experimenten, zijn wij gewend HincII introduceren Sitespecifiek bezuinigingen, hoewel de enzymen van de beperking van andere hifi-kan ook worden gebruikt.
Het protocol kan worden aangepast aan het bestuderen van andere soorten DNA-letsels die kunnen worden verwerkt tot 5´-fosfaat of 5´-OH eindigt. De nauwkeurigheid van de resultaten is afhankelijk van het specifieke karakter van de verwerking en vereist geschikt besturingselementen (bijvoorbeeld, wild type of onbehandeld) voor verificatie. Bovendien, bij de aanpassing van deze methode naar andere toepassingen of voor gebruik met andere organismen, men moet overwegen dat de methode in haar huidige setup vereist ongeveer 1 microgram van DNA die is verwerkt in een bibliotheek. Aangezien het aantal einden afhankelijk van het aantal ingesloten ribonucleotides is, die afhankelijk is van het organisme of de mutant, monsters, met inbegrip van een lager aantal ribonucleotides zou vereisen meer input DNA voor het genereren van een voldoende aantal einden in de latere bibliotheek bouw. Op dezelfde manier als DNA-monsters een veel hoger aantal ribonucleotides hebben, zou het ook vereisen gebruikend minder input DNA voor optimale omstandigheden voor afbinding, tweede onderdeel synthese en PCR versterking. Het is opmerkelijk dat de bouw van de bibliotheek zoals beschreven in dit protocol ook gegevens met betrekking tot de nucleaire genoom gegenereerde (zoals weergegeven in figuur 2D) en alleen de data-analyse was gericht op het mtDNA. Dit illustreert dat grotere genomen met matig lagere ribonucleotide frequenties ook door deze methode zijn gevangen.
Bij het overwegen van deze methode, bepaalde beperkingen moeten rekening worden gehouden: Hoewel deze methode in theorie vrijwel elk organisme gelden, een geschikte referentiemiddelen genoom is noodzakelijk voor de uitlijning van leest. Bovendien vertegenwoordigen de resultaten van ons protocol de leest uit een groot aantal cellen. Specifieke ribonucleotide opneming patronen van een subset van de cellen niet kunnen worden geïdentificeerd door deze aanpak. Als ribonucleotides zijn toegewezen in grotere genomen met een zeer lage aantal ribonucleotides, het kan problematisch zijn te discrimineren ribonucleotides uit willekeurige nicks en passende controles zijn daarom nodig.
De methode die we beschrijven hier, breidt de technieken beschikbaar in vivo zoals HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, Pu-Seq18of19van de emRiboSeq. Deze benaderingen te profiteren van de ingesloten ribonucleotides gevoeligheid voor alkaline of RNase H2 behandeling, respectievelijk dienst Next-generation sequencing te identificeren ribonucleotides genoom-brede, waarmee hun toewijzing en de vergelijking van relatieve inwerken. Door de opeenvolging van DNA specifiek splijten, zoals hierboven beschreven, naast alkalische hydrolyse bij ingesloten ribonucleotides, kunnen het luidt voor ribonucleotides worden genormaliseerd naar die sites splijten, waardoor niet alleen de identificatie en toewijzing van ribonucleotides, maar ook hun kwantificatie voor elke DNA-molecule. De toepassing van onze techniek in het kader van ziekten aan de replicatie van DNA, gerelateerde DNA-herstel en TLS kon bieden een dieper begrip van de rol van ribonucleotides in onderliggende moleculaire mechanismen en de integriteit van het genoom in het algemeen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door Zweedse Onderzoeksraad (www.vr.se) verleent aan de ARC (2014-6466 en de Zweedse Stichting voor strategisch onderzoek (www.stratresearch.se) naar boog (ICA14-0060). Technische Universiteit Chalmers wordt financiële steun verleend aan MKME tijdens dit werk. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
| 10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0216L | |
| 1x PBS | Medicago | 09-9400-100 | dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 33539-1L-GL-R | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| 50 mL Centrifuge Tube | VWR | 525-0610 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP, 10 mM) | New England Biolabs | P0756S | dilute with EB to 2 mM |
| Agilent DNA 1000 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | referred to as EB |
| CleanPCR paramagnetic beads | CleanNA | CPCR-0050 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each) | New England Biolabs | N0447L | dilute with EB to 2 mM |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61965026 | |
| DynaMag 96 Side | Thermo Fisher | 12331D | |
| Ethanol 99.5% analytical grade | Solveco | 1395 | dilute with milliQ water to 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M) | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC | AppliChem | A6906,0125 | |
| Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6) | Sigma-Aldrich | H7891-5G | dissolve in nuclease-free H2O for 10 M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment. |
| HincII | New England Biolabs | R0103S | supplied with NEBuffer 3.1 |
| Hybridiser HB-1D | Techne | FHB4DD | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Kapa Biosystems | KK2602 | |
| Lysis buffer | 50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 µg/mL), 1% SDS | ||
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Microcentrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000014 | |
| Microcentrifuge MiniStar silverline | VWR | 521-2844 | |
| Multiply µStripPro 0.2 mL tube | Sarstedt | 72.991.992 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| Phenol – chloroform – isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 26764.232 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Potassium hydroxide (KOH) | VWR | 26668.296 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Refrigerated Centrifuge 4K15 | Sigma Laboratory Centrifuges | No. 10740 | |
| SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553-035 | |
| Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc) | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 27810.295 | dissolve in nuclease-free H2O for 5 M solution, sterile filter |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (3' phosphatase minus) | New England Biolabs | M0236L | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204L | supplied with PEG 8000 (50%) |
| T7 DNA Polymerase (unmodified) | New England Biolabs | M0274S | supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer |
| TE Buffer | Invitrogen | 12090015 | |
| ThermoMixer F2.0 | Eppendorf | 5387000013 |
References
- Traut, T. W. Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines. Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).
- McElhinny, S. A. N., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).
- Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta. DNA Repair. 12, 121-127 (2013).
- Potenski, C. J., Klein, H. L. How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells. Nucleic Acids Res. 42, 10226 (2014).
- Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors. Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).
- Ghodgaonkar, M. M., et al. Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair. Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).
- DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide. Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).
- Li, Y. F., Breaker, R. R. Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 '-hydroxyl group. J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).
- McElhinny, S. A. N., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).
- Berglund, A. K., et al. Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA. Plos Genet. 13, (2017).
- Brown, J. A., Suo, Z. C. Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases. Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair. Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved. Plos Genet. 7, (2011).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).
- Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat. Methods. 12, 251 (2015).
- Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq). Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).
- Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq. Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, (2009).
