Summary
Här beskriver vi en metod som är mottagliga för samtidigt kvantifiera och genome-wide karta ribonukleotider i mycket intakt DNA på single-nucleotide upplösning, kombinerar enzymatisk klyvning av genomisk DNA med alkalisk hydrolys och efterföljande 5´-slutet sekvensering.
Abstract
Etablerade metoder för att uppskatta antalet ribonukleotider närvarande i en genomet är begränsade till kvantitering av bolagiserade ribonukleotider använder kort syntetisk DNA-fragment eller plasmider som mallar och sedan extrapolera resultaten till hela genomet. Alternativt, antalet ribonukleotider närvarande i en genomet kan uppskattas med hjälp av alkaliska geler eller Southern blots. Senare i vivo metoder använder nästa generations sekvensering tillåta genome-wide kartläggning av ribonukleotider, ger position och identitet av inbäddade ribonukleotider. De tillåter dock inte kvantitering av antalet ribonukleotider som är införlivade med en arvsmassa. Här beskriver vi hur man samtidigt karta och kvantifiera antalet ribonukleotider som är införlivade med mänskligt mitokondrie DNA i vivo av nästa generations sekvensering. Vi använder mycket intakt DNA och införa sekvens specifik dubbel strand raster av smälta det med en Amiiiiin, därefter screening bolagiserade ribonukleotider med alkali. Genererade ändarna är sammanskrivna med adaptrar och dessa ändar är sekvenserade på en nästa generations sekvensering maskin. Det absoluta antalet ribonukleotider kan beräknas som antalet läsningar utanför webbplatsen erkännande per Genomsnittligt antal läsningar på webbplatsen erkännande för den sekvens specifika Amiiiiin. Detta protokoll kan också användas för att mappa och kvantifiera gratis nicks i DNA och tillåter anpassning att mappa andra DNA-skador som kan bearbetas till 5´-OH ändar eller 5´-fosfat ändar. Dessutom kan denna metod tillämpas på någon organism, med tanke på att en lämplig referens genomet är tillgängliga. Detta protokoll ger därför ett viktigt verktyg för att studera DNA-replikation, 5´-end bearbetning, DNA-skada och DNA-reparation.
Introduction
I en eukaryot cell är koncentrationen av ribonukleotider (rNTPs) mycket högre än koncentrationen av deoxyribonucleotides (dNTP)1. DNA-polymerases diskriminera ribonukleotider, men denna diskriminering är inte perfekt och, följaktligen, ribonukleotider istället för deoxyribonucleotides kan ingå i arvsmassan under DNA-replikation. Ribonukleotider kan vara de vanligaste icke-kanoniska nukleotider som införlivas i genomet2. De flesta av dessa ribonukleotider avlägsnas under Okazaki fragment mognad av RNase H2 initierade ribonucleotid excision reparation (RER) eller av topoisomeras 1 (ses i referens3). Ribonukleotider som inte kan avlägsnas bo stabilt inkorporerats i DNA2,4 och kan påverka det i både skadliga och nyttiga sätt (ses i granskade5). Förutom att kunna agera som positiva signaler, till exempel i parning typ byta Schizosaccharomyces pombe 6 och märkning av begynnande DNA-strängen under mismatch reparation (MMR)7,8, ribonukleotider påverkar den struktur9 och stabilitet av omgivande DNA på grund av 2´-hydroxylgruppen av deras ribos10, vilket resulterar i replikationsförmåga stress och arvsmassan instabilitet11. Överflödet av ribonukleotider i genomisk DNA (gDNA) och deras relevans i replikering och reparationsmekanismer samt följderna för genomet stabilitet, ger anledning att undersöka deras exakta förekomst och frekvens på ett sätt som genome-wide.
RNase H2 aktivitet har inte hittats i mänskliga mitokondrier och ribonukleotider tas därför inte effektivt i mitokondriellt DNA (mtDNA). Flera vägar är involverade i tillhandahållandet av nukleotider till mänskliga mitokondrier och för att undersöka om störningar i mitokondriell nukleotid poolen orsaka ett förhöjt antal ribonukleotider i mänskliga mtDNA, utvecklade vi ett protokoll för att kartlägga och kvantifiera dessa ribonukleotider i mänskliga mtDNA isolerade från fibroblaster, HeLa cells och patientens cell linjer12.
De flesta in vitro- metoder (ses i granskade13) för att bestämma DNA-polymerases selektivitet mot rNTPs är baserade på enstaka ribonucleotid införande eller primer filändelsen experiment där konkurrerande rNTPs ingår i reaktionen blanda, tillåter identifiering relativ kvantifiering av ribonucleotid införlivande i korta DNA-mallar. Kvantitativa metoder på korta sekvenser kan inte reflektera dNTP och rNTP pool vid cellulär koncentrationer och därför ge inblick i polymeras selektivitet men är av begränsad betydelse angående hela genomet. Det har visat att den relativa mängden ribonukleotider införlivas under replikering av en längre DNA-mall, till exempel en plasmid, kan visualiseras på en sekvensering gel med radiomärkt dNTP och screening DNA i en alkalisk miljö14. Dessutom har gDNA analyserats på södra blotting efter alkalisk hydrolys, så att strand-specifika sondering och bestämning av absoluta priser ribonucleotid införlivande i vivo15. Dessa synsätt tillåter en relativ jämförelse av inkorporering frekvens men ger ingen insyn i den positionen eller identitet av de inbyggda ribonukleotider. Nyare metoder för att analysera ribonucleotid innehållet i gDNA i vivo, som Hydén-Seq16, ribos-Seq17, Pu-Seq18eller emRiboSeq19, dra nytta av de inbäddade ribonukleotider' känslighet för alkaliska eller RNase H2 behandling, respektive, och anställa nästa generations sekvensering att identifiera ribonukleotider genome-wide. Dessa metoder ger inte inblick i absoluta inkorporering frekvensen av de upptäckta ribonukleotider. Genom att lägga till steget sekvens specifik enzymatisk klyvning till protokollet Hydén-seq, den metod som vi beskriver här bekvämt sträcker sig den informationen från en sekvensering strategi, som ger samtidig kartläggning och kvantifiering av inbäddade ribonukleotider12. Denna metod är tillämplig till praktiskt taget alla organism med tanke på att mycket intakt DNA extrakt kan genereras och en lämplig referens genomet är tillgängliga. Metoden kan anpassas till kvantifiera och bestämma placeringen av någon lesion som kan brytas ned av en nuclease och lämnar en 5´-fosfat eller en 5´-OH slutet.
För att kartlägga och kvantifiera ribonukleotider i genomisk DNA, metoden kombinerar klyvning av en sekvens specifika Amiiiiin och alkalisk hydrolys genererar 5´-fosfat slutar vid platser där sekvensen särskilt erkännande för Amiiiiin ligger och 5´- Åh slutar på positioner där ribonukleotider var belägna. Eftersom de genererade fria ändarna är därefter sammanskrivna med adaptrar och sekvenserade använder nästa generations sekvensering, är det viktigt att använda mycket intakt DNA och undvika slumpmässiga fragmentering under DNA extraktion och bibliotek förberedelse. Bedömningen av dessa läsningar normaliserade till läser på Amiiiiin klyvning platser tillåter en samtidig kvantifiering och kartläggning av de upptäckta ribonukleotider. Gratis 5´-avslutar upptäcks i kontroll experiment där alkalisk hydrolys av DNA ersättas med behandling med KCl. Förvärvade data ge inblick i ribonucleotid läge och kvantitet och gör analyser med avseende på ribonucleotid innehåll och inkorporering frekvens.
Protocol
detta protokoll beskrivs i figur 1 och inkluderar isolering av gDNA, matsmältningen med restriktionsenzym att kunna kvantifiera antalet ribonukleotider, behandling med alkali att hydrolysera phosphodiester obligationer av ribonukleotider införlivas de gDNA, fosforylering av gratis 5´-OH slutar, ssDNA ligering av adaptrar, andra strand syntes och PCR-amplifiering innan sekvensering.
1. adaptrar och Index Primers
- få ARC49, ARC140 oligonukleotider, ARC76/77, adapter och ARC78-ARC107 index primers (se tabell 1).
Obs: Oligonukleotider bör vara HPLC renas. ARC76/77 beställs som duplex. - Förbereda 100 µM stamlösningar av varje oligonukleotiden i Tris-EDTA (TE) buffert (se Tabell av material) och förvaras vid -20 ° C.
- Förbereda 10 µM lösningar av ARC67/77 och 2 µM lösningar av ARC49 och index primers genom spädning i eluering buffert (EB, se Tabell för material). Förvaras vid-20 ° C.
2. Tillväxt och skörd av celler
- växa HeLa cells i 70 mL Dulbecco ' s ändrad Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum i en 250 mL Spinner vid 37 ° C.
- Räkna antalet celler och samla 5 x 10 6 celler i en 50 mL tub, Centrifugera under 5 minuter vid 200 x g, och kasta bort supernatanten.
- Tvätta cellerna med 20 mL 1 x PBS, Centrifugera under 5 minuter vid 200 x g, och kasta bort supernatanten.
- Frysa pellets vid-20 ° C eller fortsätta med DNA rening.
3. DNA-rening och kvantitering
- rena gDNA med fenol-kloroform extraktion enligt beskrivningen nedan.
- Resuspendera cellerna i 2 mL lyseringsbuffert (se Tabell av material) och inkubera i 30 minuter vid 42 ° C på en värmeblocket.
FÖRSIKTIGHET: Lyseringsbuffert innehåller farliga komponenter. SDS lösningen är irriterande, proteinas K är allergiframkallande, irriterande och giftiga. Använd skyddskläder och skyddshandskar. - Dela upp provet i två 2 mL rör och tillsätt 1 volym (V) fenol-kloroform-isopentanol (25:24:1).
Varning: Fenol-kloroform-isopentanol är giftiga, mutagena, frätande och farligt för vattenmiljöer. Använda i dragskåp, bära skyddande kläder och handskar och kassera i särskilda fenol-kloroform avfall. - Mix av inversion för 30-60 s och Centrifugera under 5 minuter vid 15 000 x g rumstempererat.
Obs: Använd inte vortex DNA för att undvika att införa slumpmässiga strand raster, som skulle snedvrida resultaten. - Överför den övre, vattenhaltiga fasen till en ny 2 mL tub och tillsätt 1 V av fenol-kloroform-isopentanol (25:24:1).
- Mix av inversion och Centrifugera under 5 minuter vid 15 000 x g vid 4 ° C.
- Överföra övre, vattenhaltig fas för att en ny 2 mL rör och tillsätt 20 µL NaCl (5 M) och 1 V kalla isopropanol.
Varning: Isopropanol är brandfarligt, irriterande och giftiga. Förvara den i ett ventilerat skåp, bära skyddande kläder och handskar och hålla det borta från lågorna. - Blanda genom inversion och inkubera i minst 1 h vid -20 ° C.
- Centrifugera under 20 minuter vid 15 000 x g, 4 ° C och Kassera supernatanten.
- Tvätta DNA pelleten med 200 µL kallt 70% etanol, Centrifugera i 20 min vid 15 000 x g vid 4 ° C och Kassera supernatanten.
Varning: 70% etanol är brandfarliga och irriterande. Hålla fungerande lösning vid-20 ° C, annars store i ventilerade skåp, bär skyddande kläder och handskar och hålla det borta från lågorna. - Torka DNA pelleten i rumstemperatur i 20-25 min.
- Lös DNA pellets i 100 µL TE buffert och poolen proverna i en tub.
- Resuspendera cellerna i 2 mL lyseringsbuffert (se Tabell av material) och inkubera i 30 minuter vid 42 ° C på en värmeblocket.
- Kvantifiera DNA-koncentration med dsDNA kvantitering reagens enligt tillverkaren ' s specifikationer (se Tabell för material).
Obs: Använd en dsDNA kvantitering reagens, eftersom spektrofotometrisk DNA kvantifiering kan påverkas av kvarvarande fenol. - Butiken DNA vid-20 ° C eller fortsätta med HincII behandling.
4. HincII behandling och alkalisk hydrolys
- Digest 1 µg av DNA i en reaktion blandning innehållande 5 µL 10 x buffert 3.1, 1 µL (10 U) HincII och nuclease-fri H 2 O till en slutlig volym av 50 µL.
Obs: För att uppnå optimala förutsättningar för ligering, andra strand syntes och PCR-amplifiering, det kan vara nödvändigt att öka mängden input DNA om det förväntas att DNA innehåller ett mycket lågt antal ribonukleotider. Likaså kan det vara nödvändigt att minska ingående DNA om antalet ribonukleotider är mycket hög. - Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
- Rena HincII behandlade DNA med paramagnetiska pärlor.
Obs: Håll röret locken öppnar i följande steg för att inte störa pellets genom att öppna rören.- Lägg till 1,8 V av paramagnetiska pärlor till varje prov, blanda omsorgsfullt genom pipettering, och odla i rumstemperatur i 10 min.
- Använda en magnetisk rack till pellet pärlorna i 5 min, ta sedan bort och Kassera supernatanten.
- Tvätta pelleten med 150 µL 70% etanol (rumstemperatur) för ca 30 s och sedan ta bort och Kassera supernatanten.
- Tvätta pelleten med 200 µL av 70% etanol (rumstemperatur) för omkring 30 s sedan bort och kasta bort supernatanten.
Obs: Kvarstående etanol kan avlägsnas med 10 µL pipett. Droppar kan vara spunnen ner kort förhand. - Torra proverna i rumstemperatur i cirka 15-20 min.
Observera: Den exakta tidpunkten beror på volymen av pärlor och formen av pelleten, därför pellets bör kontrolleras visuellt. - Ta bort rören från magnetiska rack och eluera pelleten i 45 µL EB, mix av pipettering noggrant.
- Inkubera för 5 min sedan pellet pärlorna på det magnetiska racket och Använd 45 µL av renade DNA i steg 4.4.
- Tillsätt 5 µL KOH (3 M) eller KCl (3 M) till DNA att skapa en total volym på 50 µL.
Varning: 3 M KOH lösningen är frätande. Använd skyddskläder och skyddshandskar. - Inkubera för 2 h vid 55 ° C i en hybridisering ugnen följt av 5 min på ice.
Obs: Det rekommenderas att utföra KOH behandling i en ugn i stället för en värmeblocket att bibehålla en jämn uppvärmning av röret och förhindra kondens vid locket. - Fällningen DNA genom att lägga till 10 µL natriumacetat (3 M, pH = 5.2) och 125 µL kallt 100% etanol. Inkubera på is för 5 min.
Varning: 100% etanol är brandfarliga och irriterande. Lagra i ett ventilerat skåp, bära skyddande kläder och handskar och hålla borta från lågorna. - Pellet gDNA genom centrifugering vid 21 000 x g, 4 ° C i 5 min och kasta bort supernatanten.
- Tvätta DNA pelleten med 250 µL kallt 70% EtOH, Centrifugera 21 000 x g, 4 ° C i 5 minuter och kasta bort supernatanten.
Obs: Ta bort vattendroppar, röret kan vara spunnen ner kort igen och supernatanten avlägsnas med pipett 10 µl. - Låt pelleten torka i ett öppet rör i ca 5-10 min tills någon synlig vätska har avdunstat.
- Låta DNA pelleten lös i 20 µL EB i 30 min i rumstemperatur.
5. 5´ slutet fosforylering
- förbereda reaktionsblandning för varje prov i förväg nackdelarfintlig av 2,5 µL 10 x T4 polynucleotide Kinas reaktion buffert, 1 µL (10 U) 3´-fosfatas-minus T4 polynucleotide kinase och 2,5 µL ATP (10 mM).
- Överföra 19 µL av varje DNA prov till en ny 200 µL tub och denaturera för 3 min vid 85 ° C i en thermo-apparat.
- Cool DNA prover på is och tillsätt 6 µL reaktionsblandning i varje prov.
- Inkubera reaktion blandar vid 37 ° C i 30 min och stoppa reaktionen av ruvning proverna vid 65 ° C i 20 min.
- Rena DNA som beskrivs i 4.3, använder 1,8 V av paramagnetiska pärlor men eluera i 14 µL EB.
6. ssDNA Ligation
- förbereda reaktionsblandning för varje prov i förväg bestående av 0,5 µL ATP (2 mM), 5 µL 10 x T4 RNA ligase reaktion buffert, 5 µL CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), 0,5 µL ARC140 (100 µM), och 25 µL 50% PEG 8000. Blanda väl genom pipettering.
FÖRSIKTIGHET: CoCl 3 (NH 3) 6 är cancerframkallande, allergiframkallande och farliga för vattenmiljön. Använd skyddskläder och skyddshandskar. - Överföra 13 µL renade DNA från steg 5,5 till en ny 200 µL tub och denaturera för 3 min vid 85 ° C i en thermo-apparat.
- Cool DNA på is och tillsätt 36 µL reaktionsblandning till varje prov, blanda genom pipettering och snurra ner kort.
- Add 1 µL (10 U) T4 RNA Ligase till varje reaktion, blanda genom pipettering, och snurra ner kort.
- Inkubera proverna vid rumstemperatur i den mörka natten.
7. Andra-strand syntes
- rena sammanskrivna DNA som beskrivs i 4.3, men Använd 0,8 V av paramagnetiska pärlor, pellet pärlorna i 10 min och eluera i 20 µL EB.
Obs: På grund av den högsta viskositeten av ligering reaktion mixen, är det första pelleting steget förlängd. - Överföra 20 µL av DNA-prov till en ny 200 µL PCR-röret. Upprepa steget rening med 0,8 V av paramagnetiska pärlor efter tillverkaren ' s specifikationer och eluera i 14 µL EB.
- Förbereda reaktionsblandning för varje prov i förväg bestående av 2 µL 10 x T7 DNA-polymeras reaktion buffert, 2 µL ARC76/77 (2 µM), 2 µL dNTP (2 mM) och 0,8 µL BSA (1 mg/mL).
- Överföra 12,8 µL renade DNA till en ny 200 µL tub, denaturera för 3 min vid 85 ° C i en thermo-apparat.
- Cool DNA på is och tillsätt 6,8 µL reaktionsblandning till varje prov, blanda genom pipettering, snurra ner kort och inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Lägga till 0.4 µL (4 U) T7 DNA-polymeras i varje reaktion och inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Rena DNA som beskrivs i 4.3, med 0,8 V av paramagnetiska pärlor och eluera i 11 µL EB.
8. PCR-amplifiering och bibliotek kvantitering
- Förbered reaktion mixen för varje prov i en ny 200 µL tube i förväg bestående av 7,5 µL ARC49 (2 µM), 7,5 µL index primer (2 µM, unika för varje prov) och 25 µL 2 x varmstart redo blanda.
- Lägg till 10 µL av DNA-prov till varje reaktion. Förstärka biblioteket med följande villkor: denaturera vid 95 ° C i 45 s, följt av 18 cykler av 98 ° C för 15 s, 65 ° C i 30 s, 72 ° C under 30 s, slutar med en final töjning vid 72 ° C i 2 min. Håll prover vid 4 ° C efter amplifiering.
- Rena bibliotek som beskrivs i 4.3, med 0,8 V av paramagnetiska pärlor, och eluera i 20 µL TE buffert.
- Kvantifiera bibliotek med hjälp av en dsDNA kvantitering reagens, enligt tillverkaren ' s specifikationer (se Tabell för material).
- Lagra prover vid-20 ° C eller fortsätta med bibliotek analys.
9. Bibliotek analys och samåkning
- bestämma kvaliteten på varje bibliotek och uppskatta den genomsnittliga fragment storlek med hjälp av en digital electrophoresis system.
Obs: Den genomsnittliga fragment storleken bedöms genom att uppskatta där arean under kurvan för elektroferogram är halverad, bortsett från toppar från markörer. Representativa resultat av lämpliga bibliotek profiler efter KOH eller KCl behandling ges i figur 2A. - Beräkna koncentrationen (nM) av biblioteken som:
(c/10 3) /(p*650)] * 10 9
där c är koncentrationen av biblioteket i ng/µL och p är den genomsnittliga fragment storleken i bp, som uppskattade i 9,1. - Pool lika molar mängder upp till 24 bibliotek förstärks med olika index primers för sekvensering. Lägg TE buffert till en slutlig volym av 25 µL och koncentration av 10 nM.
Obs: Beroende på antalet bibliotek till poolas, justeras mängden DNA från varje bibliotek. Om primer dimerer upptäcktes i steg 9,1 som en distinkt topp ca 130 bp, den avslutande volymen i biblioteket poolen kan överstiga 25 µL, eftersom reningssteg upprepas som beskrivs i 4.3, med 0,8 V av paramagnetiska pärlor, och DNA elueras i 25 µL TE buf Fer.- Bestämma nya bibliotek pool koncentrationen med dsDNA kvantitering reagens enligt tillverkaren ' s specifikationer och genomsnittliga topp storlek som beskrivs ovan. Gå vidare till sekvensering och dataanalys (§§ 10 och 11).
10. Sekvensering
- utföra 75-base Parade-end sekvensering på poolade bibliotek 12.
11. dataanalys
- Trim alla läsningar ta bort adaptern sekvenser, filter för kvalitet och läsa längd.
Obs: Detta kan göras med kommandot cutadapt 1.2.1 20 ' cutadapt -f fastq--match-Läs-jokertecken--quiet -m 15 - q 10 - en Hej < fil >', där Hej ersätts med faktisk adapter sekvens och < fil > är ersättas med filnamnet fastq. - Ta bort kompisar läsningar som kasserats i föregående steg med anpassade skript.
- Justera Mate 1 återstående par till ett index som innehåller sekvensen av alla oligonukleotider används för bibliotek beredning (t.ex. med hjälp av Bowtie 0.12.8 21 och kommandoraden alternativ - m1-v2). Kassera alla par med framgångsrika linjeföring.
- Justera återstående par att organismen referens genomet med Bowtie med kommandoraden alternativ - v2 -X 10000--best.
- Karta läser som spänner mellan mitokondriell molekyl början och slutet genom att justera Mate 1 av alla oordnad (unaligned) par (med Bowtie med kommandoraden alternativ - v2).
- Bestämma antalet 5´-ändar för alla enkel- och Parade slutet linjeföring. Flytta placeringen av dessa genom en base uppströms till det läge där de hydrolyserat ribonukleotider var.
- Exportera data från filen bowtie format till en bedgraph format med anpassade skript för visualisering gemensamt genomet webbläsare. Normalisera läser om varje strand till läsningar per Mkr.
- Med position och räknas från den bedgraph filen, referera organism genomet sekvensen att fastställa identiteten på incorpderades ribonukleotider.
Obs: För det mänskliga mitokondriella genomet läser från regionerna 16,200-300 och 5 747-5,847 för varje del bör undantas eftersom dessa regioner innehåller många gratis 5´-avslutar orelaterade ribonucleotid införlivande av DNA-polymeras γ. - Dela upp den totala läser, inte inklusive läsningar på elva HincII platser, med det genomsnittliga antalet läsningar per HincII webbplats för att få antalet ribonukleotider per enda strand paus, (dvs. antalet ribonukleotider per mitokondriell molekyl).
Representative Results
Illustrera den metod som beskrivs ovan, representativa data genererades analysera mänskligt mitokondrie-DNA från HeLa celler12. Figur 2B visar den summerade läser på alla HincII webbplatser i tunga (HS) och ljus strand (LS) av mänskliga mtDNA efter KCl behandling (vänster paneler). Omkring lokalisera 70% av alla upptäckta 5´-avslutar till cut-platser, vilket visar den höga verkningsgraden av HincII matsmältningen. Behandling av bibliotek med KOH att hydrolysera DNA på inbäddade ribonukleotider minskar antalet läsningar på HincII platser till ca 40% (figur 2B, rätt panelerna). Detta är förväntat eftersom ett stort antal 5´-avslutar genereras på platser ribonucleotid bolagsordning, och är vägledande av tillfredsställande kvalitet för bibliotek. Figur 2 c illustrerar lokalisering och frekvensen av 5´-avslutar (grön) efter KCl behandling och läser genereras av Hydén-seq (magenta) efter KOH behandling, upptäcka både gratis 5´-avslutar och slutar som genereras på ribonukleotider av alkalisk hydrolys. Gratis 5´-avslutar och ribonukleotider lokalisera till HS av mänskliga mtDNA visas i den vänstra panelen och de lokalisera till LS visas i den högra panelen. Det relativa antalet raw-läsningar ribonukleotider (figur 2D, övre panelen) eller HincII webbplatser (nedre panel) på HS och LS av mtDNA Visa, respektive, en 14-faldigt eller 31-fold starkare täckning av LS i förhållande till HS, medan en liknande bias inte observerades för Nuclear DNA. Denna strand bias kan förklaras med den distinkta skillnaden i bas sammansättning av de två delarna och illustrerar vikten av normalisering till läsningar på HincII platser.
Normalisera Läs räknar till HincII ger ett kvantitativt mått på antalet ribonukleotider per mitokondriella genomet (figur 3A). Som illustreras i figur 3B, Visa läser efter KOH behandling för varje ribonucleotid normaliserade sekvens sammansättningen av varje strand förhållandet annorlunda än 1, som anger ett icke-slumpmässigt distribution av läser tyder på en distinkt ribonucleotid mönster och en hög bibliotek kvalitet. Detta förhållande påverkas inte av tidigare matsmältningen med HincII, verifiera enzymets klyvning specificitet. Normalisera läser på platserna för inbäddade ribonukleotider till de på HincII klyvning platser samt genomet nukleotid innehållet, genererar ett kvantitativt mått på hur många av varje ribonucleotid ingår per 1.000 kompletterande baser ( Figur 3 c).
Figur 1: Schematisk för DNA bearbetning och bibliotek beredning. (1) hela genomiskt DNA är klyvs av HincII för normalisering i efterföljande kvantitering av ribonukleotider, generera trubbiga ändar på HincII platser (svart pil). (2) DNA behandlas med KOH att hydrolysera på ribonucleotid platser, leder till 2´, 3´-cykliska fosfat (röda pentagon) på 3´-avslutar och gratis 5´-OH slutar. (3) 5´-OH ändar är fosforyleras av T4 Polynucleotide Kinase 3´-fosfatas-minus. (4) alla 5´-avslutar bär en fosfatgrupp är sammanskrivna till den ARC140 oligonukleotiden av T4 RNA ligase. (5) den andra delen syntetiseras med T7 DNA-polymeras och de ARC76-77 oligonukleotider innehållande slumpmässiga N6 sekvenser. (6) bibliotek förstärks av en HiFi-DNA-polymeras som med ARC49 och en av ARC78 till ARC107 index primers som innehåller en unik streckkod för multiplexering. (7) 5´-ändar som ligger i parad-end sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: metod validering. (A) representativa elektroferogrammen genereras med hjälp av ett automatiserat electrophoresis system för att avgöra kvaliteten på genereras bibliotek behandlas med KOH eller KCl. (B) Statistikberäknade signal på HincII platser i tunga (HS) och ljus strand (LS) mänskliga mtDNA efter KCl (vänster paneler) eller KOH (rätt panelerna) behandling. (C) Circos figur av gratis 5´-avslutar (grön) och från Hydén-Seq (gratis 5´-avslutar och ribonukleotider, magenta) i HS (till vänster) och LS (höger panel) mänskliga mtDNA. Topparna är normaliserad till per miljon läsningar och högsta toppen justeras till det maximala antalet läsningar av Hydén-seq biblioteket. (D) Statistikberäknade raw läser ribonukleotider (övre panelen) och HincII platser (nedre panel) i tunga (H) och ljus (L) strand i mänskliga mtDNA (Mito.) eller bakåt (RV) eller framåt (FW) strand i nukleära (Nuc). DNA. Bild B, C och D är anpassade från referens12. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa resultat. (A) relativt antal ribonukleotider normaliserade till läsningar på HincII platser för KOH behandlas bibliotek på tunga (H) eller ljus (L) strand. (B) förhållandet mellan ribonucleotid identitet till mtDNA genomets sammansättning för KOH behandlas (KOH) och HincII klyvs med KOH behandlas (HincII + KOH) bibliotek på tunga (H) eller lätt (L) strand av mtDNA. (C) ribonucleotid frekvens normaliserade till 1.000 kompletterande grunder för HincII och KOH behandlas bibliotek på tunga (H) eller ljus (L) strand av mtDNA. Siffrorna är anpassade från referens12. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Sekvens | |||
| ARC49 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC76 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N | |||
| ARC77 | AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C | |||
| ARC78 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC84 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC85 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC86 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC87 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA | |||
Tabell 1: oligonukleotider. Listas de oligonukleotider används för Hydén-följande punkter Fet ansikte indikerar indexering. * anger en phosphorothioate obligation. ARC140 innehåller en 5´-amino grupp istället för en 5´-OH grupp, i kombination med en C6 länkare. Denna ändring minskar bildandet av ARC140 concatemers under ligering.
Discussion
Här presenterar vi en teknik för att mappa och kvantifiera ribonukleotider i gDNA och mtDNA i synnerhet, av den enkla införandet av DNA klyvning på sekvens specifika platser i genomet som ett tillägg till protokollet Hydén-seq etablerade samtidigt. Medan denna studie fokuserar på människors mtDNA, ursprungligen utvecklades Hydén-seq metoden i Saccharomyces cerevisiae, illustrera metodens översättning till andra organismer12,16.
För tillförlitliga resultat från detta synsätt, vissa kritiska steg bör noteras: (A) eftersom sekvensering adaptrar ligera till alla tillgängliga 5´-avslutar, är det viktigt att arbeta med mycket intakt DNA. DNA bör isoleras och bibliotek bör helst göras omedelbart efter DNA isolering eller DNA kan förvaras vid-20 ° C. Det rekommenderas inte att lagra DNA i kylen för länge eller för att frysa och Tina den upprepade gånger. (B) för att generera lämplig bibliotek med denna metod, är det viktigt att utföra KOH behandling av DNA i ugn inkubation, snarare än en värmeblocket, säkerställa enhetlig värmning av hela provet och kvantitativa hydrolys. (C) Dessutom är det viktigt att kontrollera kvaliteten på bibliotek innan sammanslagning och sekvensering. DNA ska kvantifieras och analyseras med en automatiserad electrophoresis system för att säkerställa tillräckliga mängder av bibliotek DNA, bekräfta lämplig fragment storlekar och kontrollera för primer dimerer.
För en meningsfull analys är det också viktigt att notera att informativa värdet av denna metod är beroende av lämpliga kontroller för att bedöma bakgrund räknas och sekvens eller strand fördomar. Rutinmässigt uppnår vi en kartläggning effektivitet i KCl prover av nära 70% när bara smälta med den sekvens specifika Amiiiiin (figur 2B, vänster paneler). Dessutom är det viktigt att bekräfta att Amiiiiin behandlingen inte påverkar totalt detektion av bolagiserade ribonukleotider genom att jämföra HincII behandlade och obehandlade prover (figur 3B). I dessa experiment, har vi använt HincII för att införa platsspecifika nedskärningar, även om andra HiFi-restriktionsenzym kunde också användas.
Protokollet kan anpassas att studera andra typer av DNA-skador som kan bearbetas till 5´-fosfat eller 5´-OH slutar. Noggrannheten i resultaten är beroende av specificiteten av bearbetning och kräver lämpliga kontroller (t.ex. vildtyp eller obehandlad) för verifiering. Dessutom när anpassa metoden till andra program eller för användning med andra organismer, bör man överväga att metoden i sin nuvarande setup kräver ca 1 µg av DNA som bearbetas till ett bibliotek. Eftersom antalet ändar är beroende av antalet inbäddade ribonukleotider, som varierar beroende på organismen eller mutant, prover inklusive ett lägre antal ribonukleotider skulle kräva mer ingång DNA för att generera ett tillräckligt antal slutar i den efterföljande bibliotek konstruktion. Likaså om DNA-prover har ett mycket högre antal ribonukleotider, skulle det också kräva använder mindre ingående DNA för att erhålla optimala förhållanden för ligering, andra strand syntes och PCR-amplifiering. Det är anmärkningsvärt att biblioteket byggandet som beskrivs i detta protokoll genereras också uppgifter som omfattar det nukleära genomet (som visas i figur 2D) och endast dataanalys var inriktad på mtDNA. Detta illustrerar att större genomen med måttligt lägre ribonucleotid frekvenser fångas även av denna metod.
När man överväger denna metod, vissa begränsningar bör beaktas: även om denna metod, i teorin, bör tillämpas praktiskt taget alla organism, en lämplig referens genomet är nödvändigt för uppriktning av läsningar. Resultat från våra protokoll representerar dessutom läser från ett stort antal celler. Specifika ribonucleotid inkorporering mönster av en delmängd av celler inte kan identifieras genom denna strategi. Om ribonukleotider mappas i större genom med ett mycket lågt antal ribonukleotider, det kan vara svårt för att diskriminera ribonukleotider från slumpmässiga nicks och lämpliga kontroller behövs därför.
Den metod som vi beskriver här, sträcker sig de tillgängliga i vivo teknikerna såsom Hydén-Seq16, ribos-Seq17, Pu-Seq18eller emRiboSeq19. Dessa metoder utnyttjar den inbäddade ribonukleotider känslighet för alkaliska eller RNase H2 behandling, respektive, anställa nästa generations sekvensering att identifiera ribonukleotider genome-wide, som gör deras kartläggning och jämförelse av relativa inkorporering. Genom att klyva DNA-sekvensen specifikt, enligt ovan, förutom alkalisk hydrolys på inbäddade ribonukleotider, kan läser för ribonukleotider normaliseras till webbplatserna klyvning, möjliggör inte bara identifiering och kartläggning av ribonukleotider, men också deras kvantifiering för varje DNA-molekylen. Tillämpningen av vår teknik i samband med sjukdomar relaterade till DNA-replikation, DNA-reparation och TLS kan ge en djupare förståelse av rollen som ribonukleotider i underliggande molekylära mekanismer och genomet integritet i allmänhet.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöds av Vetenskapsrådet (www.vr.se) beviljar ARC (2014-6466 och Stiftelsen för strategisk forskning (www.stratresearch.se) till ARC (ICA14-0060). Chalmers tekniska högskola gett ekonomiskt stöd till MKME under detta arbete. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
| 10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0216L | |
| 1x PBS | Medicago | 09-9400-100 | dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 33539-1L-GL-R | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| 50 mL Centrifuge Tube | VWR | 525-0610 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP, 10 mM) | New England Biolabs | P0756S | dilute with EB to 2 mM |
| Agilent DNA 1000 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | referred to as EB |
| CleanPCR paramagnetic beads | CleanNA | CPCR-0050 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each) | New England Biolabs | N0447L | dilute with EB to 2 mM |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61965026 | |
| DynaMag 96 Side | Thermo Fisher | 12331D | |
| Ethanol 99.5% analytical grade | Solveco | 1395 | dilute with milliQ water to 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M) | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC | AppliChem | A6906,0125 | |
| Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6) | Sigma-Aldrich | H7891-5G | dissolve in nuclease-free H2O for 10 M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment. |
| HincII | New England Biolabs | R0103S | supplied with NEBuffer 3.1 |
| Hybridiser HB-1D | Techne | FHB4DD | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Kapa Biosystems | KK2602 | |
| Lysis buffer | 50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 µg/mL), 1% SDS | ||
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Microcentrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000014 | |
| Microcentrifuge MiniStar silverline | VWR | 521-2844 | |
| Multiply µStripPro 0.2 mL tube | Sarstedt | 72.991.992 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| Phenol – chloroform – isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 26764.232 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Potassium hydroxide (KOH) | VWR | 26668.296 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Refrigerated Centrifuge 4K15 | Sigma Laboratory Centrifuges | No. 10740 | |
| SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553-035 | |
| Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc) | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 27810.295 | dissolve in nuclease-free H2O for 5 M solution, sterile filter |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (3' phosphatase minus) | New England Biolabs | M0236L | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204L | supplied with PEG 8000 (50%) |
| T7 DNA Polymerase (unmodified) | New England Biolabs | M0274S | supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer |
| TE Buffer | Invitrogen | 12090015 | |
| ThermoMixer F2.0 | Eppendorf | 5387000013 |
References
- Traut, T. W. Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines. Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).
- McElhinny, S. A. N., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).
- Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta. DNA Repair. 12, 121-127 (2013).
- Potenski, C. J., Klein, H. L. How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells. Nucleic Acids Res. 42, 10226 (2014).
- Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors. Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).
- Ghodgaonkar, M. M., et al. Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair. Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).
- DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide. Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).
- Li, Y. F., Breaker, R. R. Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 '-hydroxyl group. J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).
- McElhinny, S. A. N., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).
- Berglund, A. K., et al. Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA. Plos Genet. 13, (2017).
- Brown, J. A., Suo, Z. C. Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases. Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair. Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved. Plos Genet. 7, (2011).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).
- Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat. Methods. 12, 251 (2015).
- Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq). Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).
- Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq. Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, (2009).
