Pentylenetetrazole-indusert Kindling musemodell

Summary

Dette beskriver en metode for kjemiske kindling med pentylenetetrazole og gir en musemodell av epilepsi. Denne protokollen kan også brukes til å undersøke å anfall induksjon og patogenesen etter epileptiske anfall i mus.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) er en GABA-A reseptor antagonist. En intraperitoneal injeksjon av PTZ i et dyr induserer en akutt, alvorlig beslag på en høy dose, mens sekvensiell injeksjoner av en subconvulsive dose har blitt brukt for utvikling av kjemisk veden, en epilepsi modell. En enkelt lavdose injeksjon av PTZ induserer en mild anfall uten kramper. Imidlertid redusere repeterende lavdose injeksjoner av PTZ terskelen å fremkalle et convulsive anfall. Til slutt, kontinuerlig lavdose administrasjon av PTZ induserer en alvorlig tonisk-kloniske anfall. Denne metoden er enkel og allment gjeldende undersøke i Patofysiologien ved epilepsi, som er definert som en kronisk sykdom som involverer gjentatte beslag. Dette kjemikaliet veden protokollen forårsaker repeterende beslag i dyr. Med denne metoden ble å PTZ-mediert anfall eller graden av forverring av epileptiske anfall anslått. Disse fordelene har ført til bruk av denne metoden for screening anti-epileptisk narkotika og epilepsi-relaterte gener. Dessuten, er denne metoden brukt til å undersøke neuronal skade etter epileptiske anfall fordi histologiske endringer observert i hjernen til epileptiske pasienter vises også i hjernen til kjemisk-opptent dyr. Dermed er denne protokollen nyttig for praktisk produserer dyr modeller av epilepsi.

Introduction

Epilepsi er en kronisk nevrologisk lidelse som kjennetegnes av tilbakevendende beslag og påvirker ca 1% av folk. De underliggende mekanismene epileptogenesis og beslag generasjon i epilepsi pasienter kan ikke være fullt avklart i kliniske studier. Derfor kreves en passende dyr modell for studiet av epilepsi¹.

En rekke dyr modeller av epilepsi har blitt brukt til å undersøke fysiologi av epilepsi og identifisere anti-epileptisk narkotika^2,3. Blant disse modellene er farmakologiske anfall induksjon en felles metode som brukes til å generere en dyr modell for etterforskningen av patologi epilepsi⁴. Denne metoden er billig og enkel. Elektroden-mediert veden er også en vanlig metode, men kostnadene ved denne prosedyren er høyere, og metoden krever kirurgisk og elektriske ferdigheter å indusere repeterende beslag⁵.

Farmakologiske induksjon er også en fordel fordi tidsberegningen og antallet beslag er enkelt kontrolleres. Genetisk musen modeller som viser spontan beslag brukes også i studiet av epilepsi. Forutsi når og hvor ofte beslag oppstår i disse genetiske modellene kan imidlertid være umulig⁶. Et overvåkingssystem er krevde å observere epileptiske atferden til genmodifiserte mus⁶.

Kainic acid, pilokarpin og pentylenetetrazole (PTZ) er mye brukt som anfall-inducing narkotika⁷. Kainic syre er en Agonistiske for glutamat reseptorer pilokarpin aktiverer cholinergic reseptorer. PTZ er en gamma aminobutyric syre (GABA)-reseptor antagonist⁸. PTZ undertrykker funksjon hemmende synapser, fører til økt neuronal aktivitet. Denne forskriften forårsaker generalisert beslag i dyr⁹. En enkelt injeksjon kainic syre og pilokarpin kan forårsake akutt beslag, særlig statusen epilepticus (SE)^10,11 og kainic syre – eller pilokarpin-mediert SE fremmer kronisk spontan og tilbakevendende beslag^{12 , 13}. electroencephalographic (EEG) opptak og atferdsanalyse har indikert at spontan tilbakevendende beslag er observert en måned etter en enkelt injeksjon^12,13. En enkelt injeksjon av en convulsive dose PTZ også induserer akutt anfall. Kronisk spontan beslag etter en enkelt injeksjon av PTZ er imidlertid vanskelig å fremme. Kronisk administrasjon av PTZ er nødvendig å indusere repeterende beslag¹⁴. I disse metodene er generering av repeterende beslag stand til å indusere en patologi mer lik som menneskelige epilepsi enn generasjon akutt beslag. Ved PTZ, hver injeksjon fremkaller et anfall, og anfall alvorlighetsgrad blir mer alvorlig på en gradvis måte med hver injeksjon. Til slutt, en enkelt lavdose PTZ injeksjon induserer en alvorlig tonisk-kloniske anfall. I denne fasen fremkaller hver injeksjon alvorlig anfall. I tillegg endre anfall ventetid og varighet også løpet av injeksjoner. Ventetiden til tonic anfall blir ofte kortere i den siste fasen av veden¹⁵. Videre er anfall forverring ledsaget av en langvarig anfall varighet¹⁶. Gransker molekylær mekanismen regulere anfall alvorlighetsgraden, er ventetid og varighet nyttig for screening anti-epileptisk narkotika^17,18,19.

Beslag er vanligvis forårsaket av en enkelt systemisk administrasjon av PTZ og utvinning er veldig rask, innenfor 30 min^4,5. Dermed er antallet beslag mer controllable i PTZ-kindling modellen. Imidlertid har EEG overvåking indikert at generalisert toppene kan bli sett opp til 12 h etter PTZ-mediert anfall²⁰. Derfor bør dyr helst være under observasjon for 24 timer etter myoclonic eller tonic anfall²¹ for mer presise analyse av kindling mekanismer.

Administrasjonen av anti-epileptisk stoffer som ethosuximide, valproate, fenobarbital, vigabatrin og retigabine³, før eller etter PTZ injeksjon begrenser forverring av de anfall alvorsgrad^{3,22, 23}. Tilsvarende vist knockout mus at mangel gener involvert i beslag forverring, som matrise metalloproteinase-9²⁴, FGF-22²⁵ og neuritin²⁶, seg å ha redusert anfall alvorlighetsgrad etter flere PTZ injeksjoner. I tillegg observere histopathological endringer etter epileptiske anfall er mulig med denne metoden. Hos pasienter med tinninglappen epilepsi er det typisk histologiske endringer i hjernen, som mosegrodd fiber spirende^27,28, unormal granule Nevron migrasjon²⁹, astrogliosis³⁰, neuronal celle død i hippocampus^31,32og hippocampus sklerose³³. Lignende endringer er observert i epileptiske modell dyr. Blant de tilgjengelige metodene er PTZ-mediert kjemiske veden en god, reproduserbare og rimelig metode for å produsere en dyr modell av epilepsi. I en pilokarpin-mediert SE modell, beslag er vanskelig og mange mus dø eller unnlater å utvikle SE³⁴. I kontrast, er dødelighet og beslag alvorlighetsgraden mer controllable i PTZ modellen. Dessuten PTZ er billigere enn kainic syre, og ferdigheter i musen hjernekirurgi kreves ikke for narkotika administrasjon.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Animal Care og bruk komiteen av de Tokyo Metropolitan Institutt for medisinsk vitenskap. Postnatal 8 – 16-uke-gamle mus anbefales. Innavlet belastning er akseptabelt for eksperimentet. C57BL/6 mus er mer motstandsdyktig mot PTZ, mens BALB/c og sveitsiske albino mus er mer følsomme for PTZ. C57BL/6 ble brukt i denne studien. Sårbarhet for PTZ avhenger også en alder av musen. Sammenlignet med yngre mus, er eldre mus mer gjenstridig å PTZ35. Antall …

Representative Results

Repeterende injeksjon av PTZ induserer en økning i beslag alvorlighetsgrad. Seks C57BL/6 mus ble behandlet med PTZ, og en annen 6 mus ble behandlet med saltvann som en kontrollgruppe. PTZ dosen var 35 mg/kg, og 10 injeksjoner ble administrert. Anfall score gradvis økt med PTZ injeksjoner, mens ingen anfall eller unormal atferd ble vekket av saltvann injeksjoner (figur 2). ANOVA etterfulgt av Bonferroni test viste en signifikant forskjell mellom gruppen PTZ-…

Discussion

Her presenterer vi en allment tilgjengelig protokoll for etablering av en farmakologisk dyr modell av epilepsi. PTZ-mediert kjemiske kindling har en lang historie og aksepterte modell for studiet av epilepsi⁴¹histopatologi og cellular patologi. Kjemisk kindling modell av epilepsi er anmeldt tidligere Suzdak og Jansen, 1995⁴². Farmakologiske anfall induksjon, spesielt med PTZ, er en lett og enkel metode for fremkaller alvorlig anfall. Endringer i injeksjon dosen korrelerer m…

Materials

Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi