Pentylenetetrazole-inducerad Kindling musmodell

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för kemiska kindling med pentylenetetrazole och ger en musmodell av epilepsi. Detta protokoll kan också användas för att undersöka sårbarhet för beslag induktion och patogenes efter epileptiska anfall hos möss.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) är en GABA-A-receptorantagonist. En intraperitoneal injektion av PTZ i ett djur inducerar en akut, svår beslag vid en hög dos, medan sekventiella injektioner av en subconvulsive dos har använts för utveckling av kemiska tändved, en epilepsi modell. En enda låg dos injektion av PTZ inducerar en mild beslag utan kramper. Dock minska repetitiva lågdos-injektioner av PTZ tröskeln för att framkalla en krampaktig beslag. Slutligen, kontinuerlig låg dos administrering av PTZ inducerar ett tonisk-kloniska anfall. Denna metod är enkel och allmänt tillämpliga på undersöka patofysiologin av epilepsi, som definieras som en kronisk sjukdom som innebär att upprepade anfall. Denna kemikalie som tändved protokoll orsakar upprepade krampanfall hos djur. Med den här metoden uppskattades sårbarhet för PTZ-medierad anfall eller graden av försämring av epileptiska anfall. Dessa fördelar har lett till användning av denna metod för screening antiepileptika och epilepsi-relaterade gener. Dessutom har denna metod använts för att undersöka nervcellskador efter epileptiska anfall eftersom de histologiska förändringar som observerats i hjärnan hos patienter med epilepsi visas också i hjärnan hos kemiska-tände djur. Sålunda, detta protokoll är nyttig för att bekvämt producera djurmodeller av epilepsi.

Introduction

Epilepsi är en kronisk neurologisk sjukdom som kännetecknas av återkommande anfall och drabbar cirka 1% av personer. De bakomliggande mekanismerna epileptogenes och beslag generation epilepsi patienter klargöras inte fullt i kliniska studier. Därför krävs en lämplig djurmodell för att studera epilepsi¹.

En mängd olika djurmodeller av epilepsi har använts att undersöka physiologyen av epilepsi och identifiera antiepileptika^2,3. Bland dessa modeller är farmakologiska beslag induktion en vanlig metod som används för att generera en djurmodell för utredning av patologin vid epilepsi⁴. Metoden är billig och enkel. Elektrod-medlade fnöske är också en vanligt förekommande metod, men kostnaderna för detta förfarande är högre, och metoden kräver kirurgiska och elektriska färdigheter att framkalla upprepade anfall⁵.

Farmakologisk induktion är också fördelaktigt eftersom tidpunkten och antalet beslag styrs enkelt. Genetiska musmodeller som uppvisar spontana kramper används också i studien av epilepsi. Att förutsäga när och hur ofta kramper uppstår i dessa genetiska modeller kan dock omöjligt⁶. Ett övervakningssystem krävs att observera epileptiska beteendet hos genetiskt modifierade möss⁶.

Kainic syra, pilokarpin och pentylenetetrazole (PTZ) används allmänt som beslag-inducerande läkemedel⁷. Kainic syra är en agonist för glutamatreceptorer och pilokarpin aktiverar kolinerga receptorer. PTZ är en gamma-aminosmörsyra (GABA)-en receptorantagonist⁸. PTZ dämpar funktionen av hämmande synapser, vilket leder till ökad neuronal aktivitet. Denna förordning medför generaliserade anfall i djur⁹. En enda injektion av kainic syra och pilokarpin kan inducera akuta krampanfall, särskilt status epilepticus (SE)^10,11 och kainic syra – eller pilokarpin-medierad SE främjar kronisk spontan och återkommande anfall^{12 , 13}. elektroencefalografiska (EEG) inspelningar och beteendeanalys har antytt att spontan återkommande anfall iakttas en månad efter en enstaka injektion^12,13. En enda injektion av en krampaktig dos av PTZ inducerar också akut anfall. Kronisk spontan kramper efter en enda injektion av PTZ är dock svårt att främja. Kronisk administrering av PTZ krävs för att framkalla upprepade anfall¹⁴. I endera metoden är generationen av repetitiva anfall kunna inducera en patologi som är mer liknande till det av mänskliga epilepsi än generationen av akut anfall. När det gäller PTZ, varje injektion väcker ett anfall, och beslag svårighetsgrad blir svårare i en stegvis sätt vid varje injektion. Slutligen inducerar en enda låg dos PTZ-injektion ett tonisk-kloniska anfall. I den här fasen väcker varje injektion svåra anfall. Dessutom ändra beslag latens och varaktighet också under loppet av injektionerna. Latensen till tonic beslag blir ofta kortare i den senare fasen av kindling¹⁵. Dessutom åtföljs beslag försämring av en långvarig beslag längd¹⁶. Utreda den molekylära mekanism som reglerar beslag svårighetsgraden, är latens och varaktighet användbar för screening antiepileptika^17,18,19.

Kramper induceras ofta av en enda systemisk administrering av PTZ och återhämtningen är mycket snabb, inom 30 min^4,5. Således är antalet anfall mer kontrollerbar i PTZ-kindling modellen. EEG-övervakning har emellertid förklarat att generaliserad spikar kan ses upp till 12 h efter PTZ-medierad beslag²⁰. Djur bör därför helst förbli under observation för 24 h efter den myokloniska eller tonic beslag²¹ för mer exakt analys av mekanismerna som tändved.

Administrering av antiepileptiska läkemedel, såsom följden, valproat, fenobarbital, vigabatrin och retigabin³, före eller efter PTZ-injektion mildrar aggravationen av beslag allvarlighetsgrad^{3,22, 23}. Likaså har knockoutmöss som saknar gener inblandade i beslag exacerbation, såsom matrix metalloproteinas-9²⁴, FGF-22²⁵ och neuritin²⁶, visat att uppvisa minskad beslag svårighetsgrad efter flera PTZ-injektioner. Dessutom observerar histopatologiska förändringar efter epileptiska anfall är möjlig med denna metod. Hos patienter med tinningloben epilepsi finns det typiska histologiska förändringar i hjärnan, såsom mossiga fiber groning^27,28, onormal granule neuron migration²⁹, astrogliosis³⁰, neuronala cell död i hippocampus^31,32och Hippocampus skleros³³. Liknande förändringar observeras i epileptiska modell djur. Bland de tillgängliga metoderna är PTZ-medierad kemiska kindling en bra, reproducerbar och billig metod att producera en djurmodell av epilepsi. I en pilokarpin-medierad SE modell, anfallskontroll är svårt och många möss dör eller misslyckas med att utveckla SE³⁴. Dödlighet och beslag svårighetsgrad är det däremot mer kontrollerbar i PTZ-modellen. Dessutom PTZ är billigare än kainic syra och färdigheter i mus hjärnkirurgi krävs inte för Läkemedelsverket.

Protocol

Alla experimentella rutiner godkändes av djur vård och användning kommittén av den Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science. Postnatal 8 – 16 veckor gamla möss rekommenderas. Någon inavlade stam är godtagbart för experimentet. C57BL/6 möss är mer motståndskraftiga mot PTZ, medan BALB/c och schweiziska albino möss är mer känsliga för PTZ. C57BL/6 användes i denna studie. Sårbarhet för PTZ beror också på åldern av musen. Jämfört med yngre möss, är äldre möss mer refraktära mot PTZ-<sup cl…

Representative Results

Repetitiva injektion av PTZ inducerar en ökning i beslag svårighetsgrad. Sex C57BL/6 möss behandlades med PTZ, och en annan 6 möss behandlades med koksaltlösning som en kontrollgrupp. PTZ-dosen var 35 mg/kg och 10 injektioner gavs. Beslag Poäng ökade gradvis med PTZ-injektioner, medan inga anfall eller onormala beteenden var framkallat av saltlösning injektioner (figur 2). ANOVA följt av Bonferroni test visade en signifikant skillnad mellan den PTZ-b…

Discussion

Här presenterar vi ett brett tillgängligt protokoll för inrättandet av en farmakologisk djurmodell av epilepsi. PTZ-medierad kemiska kindling har en lång historia och är en allmänt vedertagen modell för att studera epilepsi⁴¹histopatologi och cellulär patologi. Den kemiska kindling modellen av epilepsi har granskats tidigare av Suzdak och Jansen, 1995⁴². Farmakologiska beslag induktion, särskilt med PTZ, är en lätt och enkel metod för att framkalla svåra anfal…

Materials

Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi