Detta protokoll beskriver en metod för kemiska kindling med pentylenetetrazole och ger en musmodell av epilepsi. Detta protokoll kan också användas för att undersöka sårbarhet för beslag induktion och patogenes efter epileptiska anfall hos möss.
Pentylenetetrazole (PTZ) är en GABA-A-receptorantagonist. En intraperitoneal injektion av PTZ i ett djur inducerar en akut, svår beslag vid en hög dos, medan sekventiella injektioner av en subconvulsive dos har använts för utveckling av kemiska tändved, en epilepsi modell. En enda låg dos injektion av PTZ inducerar en mild beslag utan kramper. Dock minska repetitiva lågdos-injektioner av PTZ tröskeln för att framkalla en krampaktig beslag. Slutligen, kontinuerlig låg dos administrering av PTZ inducerar ett tonisk-kloniska anfall. Denna metod är enkel och allmänt tillämpliga på undersöka patofysiologin av epilepsi, som definieras som en kronisk sjukdom som innebär att upprepade anfall. Denna kemikalie som tändved protokoll orsakar upprepade krampanfall hos djur. Med den här metoden uppskattades sårbarhet för PTZ-medierad anfall eller graden av försämring av epileptiska anfall. Dessa fördelar har lett till användning av denna metod för screening antiepileptika och epilepsi-relaterade gener. Dessutom har denna metod använts för att undersöka nervcellskador efter epileptiska anfall eftersom de histologiska förändringar som observerats i hjärnan hos patienter med epilepsi visas också i hjärnan hos kemiska-tände djur. Sålunda, detta protokoll är nyttig för att bekvämt producera djurmodeller av epilepsi.
Epilepsi är en kronisk neurologisk sjukdom som kännetecknas av återkommande anfall och drabbar cirka 1% av personer. De bakomliggande mekanismerna epileptogenes och beslag generation epilepsi patienter klargöras inte fullt i kliniska studier. Därför krävs en lämplig djurmodell för att studera epilepsi1.
En mängd olika djurmodeller av epilepsi har använts att undersöka physiologyen av epilepsi och identifiera antiepileptika2,3. Bland dessa modeller är farmakologiska beslag induktion en vanlig metod som används för att generera en djurmodell för utredning av patologin vid epilepsi4. Metoden är billig och enkel. Elektrod-medlade fnöske är också en vanligt förekommande metod, men kostnaderna för detta förfarande är högre, och metoden kräver kirurgiska och elektriska färdigheter att framkalla upprepade anfall5.
Farmakologisk induktion är också fördelaktigt eftersom tidpunkten och antalet beslag styrs enkelt. Genetiska musmodeller som uppvisar spontana kramper används också i studien av epilepsi. Att förutsäga när och hur ofta kramper uppstår i dessa genetiska modeller kan dock omöjligt6. Ett övervakningssystem krävs att observera epileptiska beteendet hos genetiskt modifierade möss6.
Kainic syra, pilokarpin och pentylenetetrazole (PTZ) används allmänt som beslag-inducerande läkemedel7. Kainic syra är en agonist för glutamatreceptorer och pilokarpin aktiverar kolinerga receptorer. PTZ är en gamma-aminosmörsyra (GABA)-en receptorantagonist8. PTZ dämpar funktionen av hämmande synapser, vilket leder till ökad neuronal aktivitet. Denna förordning medför generaliserade anfall i djur9. En enda injektion av kainic syra och pilokarpin kan inducera akuta krampanfall, särskilt status epilepticus (SE)10,11 och kainic syra – eller pilokarpin-medierad SE främjar kronisk spontan och återkommande anfall12 , 13. elektroencefalografiska (EEG) inspelningar och beteendeanalys har antytt att spontan återkommande anfall iakttas en månad efter en enstaka injektion12,13. En enda injektion av en krampaktig dos av PTZ inducerar också akut anfall. Kronisk spontan kramper efter en enda injektion av PTZ är dock svårt att främja. Kronisk administrering av PTZ krävs för att framkalla upprepade anfall14. I endera metoden är generationen av repetitiva anfall kunna inducera en patologi som är mer liknande till det av mänskliga epilepsi än generationen av akut anfall. När det gäller PTZ, varje injektion väcker ett anfall, och beslag svårighetsgrad blir svårare i en stegvis sätt vid varje injektion. Slutligen inducerar en enda låg dos PTZ-injektion ett tonisk-kloniska anfall. I den här fasen väcker varje injektion svåra anfall. Dessutom ändra beslag latens och varaktighet också under loppet av injektionerna. Latensen till tonic beslag blir ofta kortare i den senare fasen av kindling15. Dessutom åtföljs beslag försämring av en långvarig beslag längd16. Utreda den molekylära mekanism som reglerar beslag svårighetsgraden, är latens och varaktighet användbar för screening antiepileptika17,18,19.
Kramper induceras ofta av en enda systemisk administrering av PTZ och återhämtningen är mycket snabb, inom 30 min4,5. Således är antalet anfall mer kontrollerbar i PTZ-kindling modellen. EEG-övervakning har emellertid förklarat att generaliserad spikar kan ses upp till 12 h efter PTZ-medierad beslag20. Djur bör därför helst förbli under observation för 24 h efter den myokloniska eller tonic beslag21 för mer exakt analys av mekanismerna som tändved.
Administrering av antiepileptiska läkemedel, såsom följden, valproat, fenobarbital, vigabatrin och retigabin3, före eller efter PTZ-injektion mildrar aggravationen av beslag allvarlighetsgrad3,22, 23. Likaså har knockoutmöss som saknar gener inblandade i beslag exacerbation, såsom matrix metalloproteinas-924, FGF-2225 och neuritin26, visat att uppvisa minskad beslag svårighetsgrad efter flera PTZ-injektioner. Dessutom observerar histopatologiska förändringar efter epileptiska anfall är möjlig med denna metod. Hos patienter med tinningloben epilepsi finns det typiska histologiska förändringar i hjärnan, såsom mossiga fiber groning27,28, onormal granule neuron migration29, astrogliosis30, neuronala cell död i hippocampus31,32och Hippocampus skleros33. Liknande förändringar observeras i epileptiska modell djur. Bland de tillgängliga metoderna är PTZ-medierad kemiska kindling en bra, reproducerbar och billig metod att producera en djurmodell av epilepsi. I en pilokarpin-medierad SE modell, anfallskontroll är svårt och många möss dör eller misslyckas med att utveckla SE34. Dödlighet och beslag svårighetsgrad är det däremot mer kontrollerbar i PTZ-modellen. Dessutom PTZ är billigare än kainic syra och färdigheter i mus hjärnkirurgi krävs inte för Läkemedelsverket.
Här presenterar vi ett brett tillgängligt protokoll för inrättandet av en farmakologisk djurmodell av epilepsi. PTZ-medierad kemiska kindling har en lång historia och är en allmänt vedertagen modell för att studera epilepsi41histopatologi och cellulär patologi. Den kemiska kindling modellen av epilepsi har granskats tidigare av Suzdak och Jansen, 199542. Farmakologiska beslag induktion, särskilt med PTZ, är en lätt och enkel metod för att framkalla svåra anfal…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete var delvis stöds av JSPS KAKENHI grant nummer 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536, och 17 K 07086, MEXT KAKENHI grant nummer 25110737 och 23110525, AMED Grant nummer JP18ek0109311, och SENSHIN medicinsk forskningsstiftelsen och Japan Epilepsi Research Foundation.
Pentylenetetrazole | Sigma-Aldrich | P6500 | |
Sodium chloride | MANAC | 7647-14-5 | |
Mouse | CLEA Japan | C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male | |
Syringe (1mL) | Terumo | SS-01T | |
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) | Terumo | NN-2719S | |
Weighing scale | Mettler | PE2000 | This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company. |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Sodium hydroxide | nacalai tesque | 31511-05 | |
Peristatic pump | ATTO | SJ1211 | |
Sucrose | nacalai tesque | 30404-45 | |
Microtome | Yamato | REM-700 | This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710 |
Microtome blade | Feather | S35 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
anti-synaptoporin antibody | Synaptic systems | 102 002 | |
anti-ZnT3 antibody | Synaptic systems | 197 002 | |
anti-doublecortin | Santa Cruz | sc-8066 | This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390). |
Contextual fear discrimination test apparatus | O'hara | ||
Three chamber test apparatus | Muromachi |