Summary

Pentylenetetrazole-inducerad Kindling musmodell

Published: June 12, 2018
doi:

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för kemiska kindling med pentylenetetrazole och ger en musmodell av epilepsi. Detta protokoll kan också användas för att undersöka sårbarhet för beslag induktion och patogenes efter epileptiska anfall hos möss.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) är en GABA-A-receptorantagonist. En intraperitoneal injektion av PTZ i ett djur inducerar en akut, svår beslag vid en hög dos, medan sekventiella injektioner av en subconvulsive dos har använts för utveckling av kemiska tändved, en epilepsi modell. En enda låg dos injektion av PTZ inducerar en mild beslag utan kramper. Dock minska repetitiva lågdos-injektioner av PTZ tröskeln för att framkalla en krampaktig beslag. Slutligen, kontinuerlig låg dos administrering av PTZ inducerar ett tonisk-kloniska anfall. Denna metod är enkel och allmänt tillämpliga på undersöka patofysiologin av epilepsi, som definieras som en kronisk sjukdom som innebär att upprepade anfall. Denna kemikalie som tändved protokoll orsakar upprepade krampanfall hos djur. Med den här metoden uppskattades sårbarhet för PTZ-medierad anfall eller graden av försämring av epileptiska anfall. Dessa fördelar har lett till användning av denna metod för screening antiepileptika och epilepsi-relaterade gener. Dessutom har denna metod använts för att undersöka nervcellskador efter epileptiska anfall eftersom de histologiska förändringar som observerats i hjärnan hos patienter med epilepsi visas också i hjärnan hos kemiska-tände djur. Sålunda, detta protokoll är nyttig för att bekvämt producera djurmodeller av epilepsi.

Introduction

Epilepsi är en kronisk neurologisk sjukdom som kännetecknas av återkommande anfall och drabbar cirka 1% av personer. De bakomliggande mekanismerna epileptogenes och beslag generation epilepsi patienter klargöras inte fullt i kliniska studier. Därför krävs en lämplig djurmodell för att studera epilepsi1.

En mängd olika djurmodeller av epilepsi har använts att undersöka physiologyen av epilepsi och identifiera antiepileptika2,3. Bland dessa modeller är farmakologiska beslag induktion en vanlig metod som används för att generera en djurmodell för utredning av patologin vid epilepsi4. Metoden är billig och enkel. Elektrod-medlade fnöske är också en vanligt förekommande metod, men kostnaderna för detta förfarande är högre, och metoden kräver kirurgiska och elektriska färdigheter att framkalla upprepade anfall5.

Farmakologisk induktion är också fördelaktigt eftersom tidpunkten och antalet beslag styrs enkelt. Genetiska musmodeller som uppvisar spontana kramper används också i studien av epilepsi. Att förutsäga när och hur ofta kramper uppstår i dessa genetiska modeller kan dock omöjligt6. Ett övervakningssystem krävs att observera epileptiska beteendet hos genetiskt modifierade möss6.

Kainic syra, pilokarpin och pentylenetetrazole (PTZ) används allmänt som beslag-inducerande läkemedel7. Kainic syra är en agonist för glutamatreceptorer och pilokarpin aktiverar kolinerga receptorer. PTZ är en gamma-aminosmörsyra (GABA)-en receptorantagonist8. PTZ dämpar funktionen av hämmande synapser, vilket leder till ökad neuronal aktivitet. Denna förordning medför generaliserade anfall i djur9. En enda injektion av kainic syra och pilokarpin kan inducera akuta krampanfall, särskilt status epilepticus (SE)10,11 och kainic syra – eller pilokarpin-medierad SE främjar kronisk spontan och återkommande anfall12 , 13. elektroencefalografiska (EEG) inspelningar och beteendeanalys har antytt att spontan återkommande anfall iakttas en månad efter en enstaka injektion12,13. En enda injektion av en krampaktig dos av PTZ inducerar också akut anfall. Kronisk spontan kramper efter en enda injektion av PTZ är dock svårt att främja. Kronisk administrering av PTZ krävs för att framkalla upprepade anfall14. I endera metoden är generationen av repetitiva anfall kunna inducera en patologi som är mer liknande till det av mänskliga epilepsi än generationen av akut anfall. När det gäller PTZ, varje injektion väcker ett anfall, och beslag svårighetsgrad blir svårare i en stegvis sätt vid varje injektion. Slutligen inducerar en enda låg dos PTZ-injektion ett tonisk-kloniska anfall. I den här fasen väcker varje injektion svåra anfall. Dessutom ändra beslag latens och varaktighet också under loppet av injektionerna. Latensen till tonic beslag blir ofta kortare i den senare fasen av kindling15. Dessutom åtföljs beslag försämring av en långvarig beslag längd16. Utreda den molekylära mekanism som reglerar beslag svårighetsgraden, är latens och varaktighet användbar för screening antiepileptika17,18,19.

Kramper induceras ofta av en enda systemisk administrering av PTZ och återhämtningen är mycket snabb, inom 30 min4,5. Således är antalet anfall mer kontrollerbar i PTZ-kindling modellen. EEG-övervakning har emellertid förklarat att generaliserad spikar kan ses upp till 12 h efter PTZ-medierad beslag20. Djur bör därför helst förbli under observation för 24 h efter den myokloniska eller tonic beslag21 för mer exakt analys av mekanismerna som tändved.

Administrering av antiepileptiska läkemedel, såsom följden, valproat, fenobarbital, vigabatrin och retigabin3, före eller efter PTZ-injektion mildrar aggravationen av beslag allvarlighetsgrad3,22, 23. Likaså har knockoutmöss som saknar gener inblandade i beslag exacerbation, såsom matrix metalloproteinas-924, FGF-2225 och neuritin26, visat att uppvisa minskad beslag svårighetsgrad efter flera PTZ-injektioner. Dessutom observerar histopatologiska förändringar efter epileptiska anfall är möjlig med denna metod. Hos patienter med tinningloben epilepsi finns det typiska histologiska förändringar i hjärnan, såsom mossiga fiber groning27,28, onormal granule neuron migration29, astrogliosis30, neuronala cell död i hippocampus31,32och Hippocampus skleros33. Liknande förändringar observeras i epileptiska modell djur. Bland de tillgängliga metoderna är PTZ-medierad kemiska kindling en bra, reproducerbar och billig metod att producera en djurmodell av epilepsi. I en pilokarpin-medierad SE modell, anfallskontroll är svårt och många möss dör eller misslyckas med att utveckla SE34. Dödlighet och beslag svårighetsgrad är det däremot mer kontrollerbar i PTZ-modellen. Dessutom PTZ är billigare än kainic syra och färdigheter i mus hjärnkirurgi krävs inte för Läkemedelsverket.

Protocol

Alla experimentella rutiner godkändes av djur vård och användning kommittén av den Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science. Postnatal 8 – 16 veckor gamla möss rekommenderas. Någon inavlade stam är godtagbart för experimentet. C57BL/6 möss är mer motståndskraftiga mot PTZ, medan BALB/c och schweiziska albino möss är mer känsliga för PTZ. C57BL/6 användes i denna studie. Sårbarhet för PTZ beror också på åldern av musen. Jämfört med yngre möss, är äldre möss mer refraktära mot PTZ-<sup cl…

Representative Results

Repetitiva injektion av PTZ inducerar en ökning i beslag svårighetsgrad. Sex C57BL/6 möss behandlades med PTZ, och en annan 6 möss behandlades med koksaltlösning som en kontrollgrupp. PTZ-dosen var 35 mg/kg och 10 injektioner gavs. Beslag Poäng ökade gradvis med PTZ-injektioner, medan inga anfall eller onormala beteenden var framkallat av saltlösning injektioner (figur 2). ANOVA följt av Bonferroni test visade en signifikant skillnad mellan den PTZ-b…

Discussion

Här presenterar vi ett brett tillgängligt protokoll för inrättandet av en farmakologisk djurmodell av epilepsi. PTZ-medierad kemiska kindling har en lång historia och är en allmänt vedertagen modell för att studera epilepsi41histopatologi och cellulär patologi. Den kemiska kindling modellen av epilepsi har granskats tidigare av Suzdak och Jansen, 199542. Farmakologiska beslag induktion, särskilt med PTZ, är en lätt och enkel metod för att framkalla svåra anfal…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete var delvis stöds av JSPS KAKENHI grant nummer 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536, och 17 K 07086, MEXT KAKENHI grant nummer 25110737 och 23110525, AMED Grant nummer JP18ek0109311, och SENSHIN medicinsk forskningsstiftelsen och Japan Epilepsi Research Foundation.

Materials

Pentylenetetrazole Sigma-Aldrich P6500
Sodium chloride MANAC 7647-14-5
Mouse CLEA Japan C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL) Terumo SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) Terumo NN-2719S
Weighing scale Mettler PE2000 This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium hydroxide nacalai tesque 31511-05
Peristatic pump ATTO SJ1211
Sucrose nacalai tesque 30404-45
Microtome Yamato REM-700 This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade Feather S35
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
anti-synaptoporin antibody Synaptic systems 102 002
anti-ZnT3 antibody Synaptic systems 197 002
anti-doublecortin Santa Cruz sc-8066 This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus O'hara
Three chamber test apparatus Muromachi

References

  1. Löscher, W., Brandt, C. Prevention or Modification of Epileptogenesis after Brain Insults: Experimental Approaches and Translational Research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
  2. Loscher, W. Animal Models of Seizures and Epilepsy: Past, Present, and Future Role for the Discovery of Antiseizure Drugs. Neurochem Res. , (2017).
  3. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  4. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  5. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. . Models of Seizures and Epilepsy. , xvii (2006).
  6. Yang, Y., Frankel, W. N. Genetic approaches to studying mouse models of human seizure disorders. Adv Exp Med Biol. 548, 1-11 (2004).
  7. Leite, J. P., Garcia-Cairasco, N., Cavalheiro, E. A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res. 50 (1-2), 93-103 (2002).
  8. Squires, R. F., Saederup, E., Crawley, J. N., Skolnick, P., Paul, S. M. Convulsant potencies of tetrazoles are highly correlated with actions on GABA/benzodiazepine/picrotoxin receptor complexes in brain. Life Sci. 35 (14), 1439-1444 (1984).
  9. Tourov, A., et al. Spike morphology in PTZ-induced generalized and cobalt-induced partial experimental epilepsy. Funct Neurol. 11 (5), 237-245 (1996).
  10. Furtado Mde, A., Braga, G. K., Oliveira, J. A., Del Vecchio, F., Garcia-Cairasco, N. Behavioral, morphologic, and electroencephalographic evaluation of seizures induced by intrahippocampal microinjection of pilocarpine. Epilepsia. 43, 37-39 (2002).
  11. Hosford, D. A. Animal models of nonconvulsive status epilepticus. J Clin Neurophysiol. 16 (4), 306-313 (1999).
  12. Medina-Ceja, L., Pardo-Pena, K., Ventura-Mejia, C. Evaluation of behavioral parameters and mortality in a model of temporal lobe epilepsy induced by intracerebroventricular pilocarpine administration. Neuroreport. , (2014).
  13. Bragin, A., Azizyan, A., Almajano, J., Wilson, C. L., Engel, J. Analysis of chronic seizure onsets after intrahippocampal kainic acid injection in freely moving rats. Epilepsia. 46 (10), 1592-1598 (2005).
  14. Schmidt, J. Changes in seizure susceptibility in rats following chronic administration of pentylenetetrazol. Biomed Biochim Acta. 46 (4), 267-270 (1987).
  15. Angelatou, F., Pagonopoulou, O., Kostopoulos, G. Changes in seizure latency correlate with alterations in A1 adenosine receptor binding during daily repeated pentylentetrazol-induced convulsions in different mouse brain areas. Neuroscience Letters. 132 (2), 203-206 (1991).
  16. Löscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 50 (1), 105-123 (2002).
  17. Ilhan, A., Iraz, M., Kamisli, S., Yigitoglu, R. Pentylenetetrazol-induced kindling seizure attenuated by Ginkgo biloba extract (EGb 761) in mice. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 30 (8), 1504-1510 (2006).
  18. Emami, S., Kebriaeezadeh, A., Ahangar, N., Khorasani, R. Imidazolylchromanone oxime ethers as potential anticonvulsant agents: Anticonvulsive evaluation in PTZ-kindling model of epilepsy and SAR study. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (2), 655-659 (2011).
  19. Klitgaard, H. Levetiracetam: The Preclinical Profile of a New Class of Antiepileptic Drugs?. Epilepsia. 42, 13-18 (2001).
  20. Kellinghaus, C., et al. Dissociation between in vitro and in vivo epileptogenicity in a rat model of cortical dysplasia. Epileptic Disord. 9 (1), 11-19 (2007).
  21. Koutroumanidou, E., et al. Increased seizure latency and decreased severity of pentylenetetrazol-induced seizures in mice after essential oil administration. Epilepsy Res Treat. 2013, 532657 (2013).
  22. Krall, R. L., Penry, J. K., White, B. G., Kupferberg, H. J., Swinyard, E. A. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening. Epilepsia. 19 (4), 409-428 (1978).
  23. White, H. S. Preclinical development of antiepileptic drugs: past, present, and future directions. Epilepsia. 44, 2-8 (2003).
  24. Mizoguchi, H., et al. Matrix metalloproteinase-9 contributes to kindled seizure development in pentylenetetrazole-treated mice by converting pro-BDNF to mature BDNF in the hippocampus. J Neurosci. 31 (36), 12963-12971 (2011).
  25. Lee, C. H., Umemori, H. Suppression of epileptogenesis-associated changes in response to seizures in FGF22-deficient mice. Front Cell Neurosci. 7, 43 (2013).
  26. Shimada, T., Yoshida, T., Yamagata, K. Neuritin Mediates Activity-Dependent Axonal Branch Formation in Part via FGF Signaling. J Neurosci. 36 (16), 4534-4548 (2016).
  27. Parent, J. M., et al. Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci. 17 (10), 3727-3738 (1997).
  28. Sutula, T., He, X. X., Cavazos, J., Scott, G. Synaptic reorganization in the hippocampus induced by abnormal functional activity. Science. 239 (4844), 1147-1150 (1988).
  29. Parent, J. M., Elliott, R. C., Pleasure, S. J., Barbaro, N. M., Lowenstein, D. H. Aberrant seizure-induced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy. Ann Neurol. 59 (1), 81-91 (2006).
  30. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  31. Arzimanoglou, A., et al. Epilepsy and neuroprotection: an illustrated review. Epileptic Disord. 4 (3), 173-182 (2002).
  32. Represa, A., Niquet, J., Pollard, H., Ben-Ari, Y. Cell death, gliosis, and synaptic remodeling in the hippocampus of epileptic rats. Journal of Neurobiology. 26 (3), 413-425 (1995).
  33. Blumcke, I. Neuropathology of focal epilepsies: a critical review. Epilepsy Behav. 15 (1), 34-39 (2009).
  34. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 102 (3), 153-159 (2012).
  35. Nokubo, M., et al. Age-dependent increase in the threshold for pentylenetetrazole induced maximal seizure in mice. Life Sci. 38 (22), 1999-2007 (1986).
  36. Ferraro, T. N., et al. Mapping Loci for Pentylenetetrazol-Induced Seizure Susceptibility in Mice. The Journal of Neuroscience. 19 (16), 6733-6739 (1999).
  37. Kosobud, A. E., Cross, S. J., Crabbe, J. C. Neural sensitivity to pentylenetetrazol convulsions in inbred and selectively bred mice. Brain Res. 592 (1-2), 122-128 (1992).
  38. Shimada, T., Takemiya, T., Sugiura, H., Yamagata, K. Role of Inflammatory Mediators in the Pathogenesis of Epilepsy. Mediators of Inflammation. 2014, 1-8 (2014).
  39. Itoh, K., et al. Magnetic resonance and biochemical studies during pentylenetetrazole-kindling development: the relationship between nitric oxide, neuronal nitric oxide synthase and seizures. Neuroscience. 129 (3), 757-766 (2004).
  40. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
  41. Bialer, M., White, H. S. Key factors in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 68-82 (2010).
  42. Suzdak, P. D., Jansen, J. A. A review of the preclinical pharmacology of tiagabine: a potent and selective anticonvulsant GABA uptake inhibitor. Epilepsia. 36 (6), 612-626 (1995).
  43. Seyfried, T. N., Glaser, G. H. A review of mouse mutants as genetic models of epilepsy. Epilepsia. 26 (2), 143-150 (1985).
  44. Upton, N., Stratton, S. Recent developments from genetic mouse models of seizures. Current Opinion in Pharmacology. 3 (1), 19-26 (2003).
  45. Rao, M. S., Hattiangady, B., Reddy, D. S., Shetty, A. K. Hippocampal neurodegeneration, spontaneous seizures, and mossy fiber sprouting in the F344 rat model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Res. 83 (6), 1088-1105 (2006).
  46. Hellier, J. L., Patrylo, P. R., Buckmaster, P. S., Dudek, F. E. Recurrent spontaneous motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate: assessment of a rat model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 31 (1), 73-84 (1998).
  47. Turski, L., et al. Seizures produced by pilocarpine: neuropathological sequelae and activity of glutamate decarboxylase in the rat forebrain. Brain Res. 398 (1), 37-48 (1986).
  48. Itoh, K., Watanabe, M. Paradoxical facilitation of pentylenetetrazole-induced convulsion susceptibility in mice lacking neuronal nitric oxide synthase. Neuroscience. 159 (2), 735-743 (2009).
  49. Deng, Y., Wang, M., Wang, W., Ma, C., He, N. Comparison and Effects of Acute Lamotrigine Treatment on Extracellular Excitatory Amino Acids in the Hippocampus of PTZ-Kindled Epileptic and PTZ-Induced Status Epilepticus Rats. Neurochemical Research. 38 (3), 504-511 (2013).
  50. Kupferberg, H. Animal models used in the screening of antiepileptic drugs. Epilepsia. 42, 7-12 (2001).
  51. Berg, A. T., Plioplys, S. Epilepsy and autism: is there a special relationship?. Epilepsy Behav. 23 (3), 193-198 (2012).
  52. Robinson, S. J. Childhood epilepsy and autism spectrum disorders: psychiatric problems, phenotypic expression, and anticonvulsants. Neuropsychol Rev. 22 (3), 271-279 (2012).
  53. Tuchman, R. Autism and Cognition Within Epilepsy: Social Matters. Epilepsy Curr. 15 (4), 202-205 (2015).
  54. Takechi, K., Suemaru, K., Kiyoi, T., Tanaka, A., Araki, H. The alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptor modulates autism-like behavioral and motor abnormalities in pentylenetetrazol-kindled mice. Eur J Pharmacol. 775, 57-66 (2016).
  55. Abdel-Zaher, A. O., Farghaly, H. S. M., Farrag, M. M. Y., Abdel-Rahman, M. S., Abdel-Wahab, B. A. A potential mechanism for the ameliorative effect of thymoquinone on pentylenetetrazole-induced kindling and cognitive impairments in mice. Biomed Pharmacother. 88, 553-561 (2017).
  56. Jia, F., et al. Effects of histamine H(3) antagonists and donepezil on learning and mnemonic deficits induced by pentylenetetrazol kindling in weanling mice. Neuropharmacology. 50 (3), 404-411 (2006).
  57. Pahuja, M., Mehla, J., Reeta, K. H., Tripathi, M., Gupta, Y. K. Effect of Anacyclus pyrethrum on pentylenetetrazole-induced kindling, spatial memory, oxidative stress and rho-kinase II expression in mice. Neurochem Res. 38 (3), 547-556 (2013).

Play Video

Cite This Article
Shimada, T., Yamagata, K. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J. Vis. Exp. (136), e56573, doi:10.3791/56573 (2018).

View Video