Summary
Det här protokollet beskriver tillverkning av en liten, ready-to-use kassett som kan tillämpas för visuell identifiering av flera nucleic syror i en enda, test som är lätt att använda. I denna metod användes en kapillär matris för multiplex och högeffektiva påvisande av GMO mål.
Abstract
Flera mål, kort tid och resurs-prisvärda metoder för detektion av flera nukleinsyror i en enda, enkel att använda test är mycket angeläget i sjukdomsdiagnos, mikrobiell övervakning, spårning av genetiskt modifierad organism (GMO), och Kriminalteknisk analys. Vi har tidigare beskrivit den plattform som kallas lugn (Capillary Array-baserade Loop-medierad isotermiska förstärkning för Multiplex visuell identifiering av nukleinsyror). Häri, beskriver vi förbättrad tillverkning och prestanda processer för den här plattformen. Vi tillämpar här, en liten, ready-to-use kassett som monteras av kapillär matris för multiplex visuell identifiering av nukleinsyror. Kapillär matrisen är förbehandlade till ett hydrofoba och hydrofil mönster innan fastställande loop-medierad isotermiska amplifiering (lampa) primer satser i kapillärerna. Efter monteringen av lastning adaptern, lampa reaktionsblandningen läses in och isoleras i varje kapillär, på grund av kapillär kraft av en enda pipettering steg. LAMPAN reaktionerna utförs parallellt i kapillärerna. Resultatet avläses visuellt av belysning med en handhållna UV ficklampa. Använder denna plattform, demonstrera vi övervakning av 8 ofta förekommer element och gener i GMO prov med hög specificitet och känslighet. Sammanfattningsvis, är den plattform som beskrivs häri avsett att underlätta upptäckt av flera nukleinsyror. Vi tror att det kommer att vara allmänt tillämpliga på områden där det krävs hög genomströmning nukleinsyra analys.
Introduction
Billig, snabb och lätt att använda system för samtidiga detektion av flera nukleinsyror är i akut behov av ett brett utbud av fält, t ex klinisk diagnostik1,2,3, GMO upptäckt4, 5,6, mikrobiell övervakning7,8,9, forensisk analys10,11och särskilt point-of-care tester (POCTs), där resurser är vanligtvis begränsad12,13,14.
Polymeras-kedjereaktion (PCR), inklusive dess härledda metoder realtids-PCR och multiplex PCR, är den mest allmänt tillämpad tekniken för detektering i dessa fält. Men dessa metoder vanligtvis identifieras endast ett mål i en test15 och de kräver elektricitet och sofistikerade professionell utrustning.
En annan lovande teknik för att upptäcka nukleinsyror är Loop-medierad isotermiska amplifiering (lampa), som beskrevs först år 200016. LAMPAN är en högeffektiv DNA detektionsmetod. Teoretiskt kan det förstärka från 1 kopia till 109 kopior av amplikoner inom en timme, alla utförs vid en konstant temperatur, (dvs.mellan 60-65 ° C). Framgångsrika förstärkning kommer att producera en stor mängd de olösliga biprodukt pyrofosfat och orsaka en förändring i grumlighet17, vilket direkt kan observeras med blotta ögat. En färgförändring kan också observeras genom tillsats av metalljoner eller fluorescerande färgämnen som Calcein18, nukleinsyra dye19och hydroxyl naftol blå20. På grund av fördelarna med hög känslighet och bekvämlighet drift, som lampa allmänt används i nukleinsyra upptäckt.
För närvarande finns det främst två strategier för multiplex lampa analyser. En är att utföra flera lampa analyser genom att ha flera lampa primer sätter i en tub21,22,23. Dock skulle multiplicityen och förstärkning effektivitet begränsas av den inneboende störningar och konkurrensen bland olika primer uppsättningar. Dessutom kan det vara svårt att identifiera olika lampa produkter i samma reaktion. En annan strategi är baserad på fysisk isolering. Olika primer uppsättningar var isolerade i enskilda miniatyriserade fack, och flera lampa reaktioner utförs sedan samtidigt24,25. Dessa tillvägagångssätt, som baseras i allmänhet på mikroflödessystem chip, ger en möjlig lösning för hög genomströmning lampa reaktioner. Tillverkning av marker och multiplex före beläggning av primer uppsättningar är dock komplicerat, vilket kan öka kostnaderna och minska reproducerbarhet.
Ett fåtal studier har nyligen beskrivit högpresterande lampa reaktioner i kapillärerna till förbifartsleden den komplicerade fabrication mikroflödessystem marker och har uppnått låg kostnad upptäckt26,27. Dock när det gäller hög genomströmning analys är dessa kapillärer liknar miniatyrversioner av PCR-strip rör, eftersom de prover och reaktion reagenser (inklusive de olika primer uppsättningarna) måste vara individuellt beredd och levereras till olika reaktion enheter inom kapillärer. För att uppnå parallella och multiplex analys, krävs ytterligare utrustning, till exempel en flerkanalig sprutpump, för parallella lastning av prover eller reagenser.
För att övervinna de begränsningar som är associerade med de nuvarande metoderna för multiplex upptäckt av nukleinsyror, har vi utvecklat en miniatyriserade plattform som kombinerar visual lampa teknik med en kapillär array. Denna plattform är flera mål, kompakt, låg kostnad och enkel att använda28. Häri, beskriver vi detaljerna för hur fabricera kapillär matrisen och utföra lampa reaktionerna i matrisen. Protokollet beskrivs här har standardiserats med genetiskt modifierad organism (GMO) upptäckt som modell. Allt kan detta protokoll också användas i hög genomströmning upptäckt av andra nukleinsyra mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: detta protokoll förutsätter att rostfritt stål mögel bär formen för önskade mikro-kanaler och lastning adapter redan har gjorts (3D filer finns som kompletterande filer 1 och 2. ). Protokollet förutsätter också att växten DNA isolering redan har utförts.
1. tillverkning av kapillär arraybaserade Ready-to-use kassett
- rengöra rostfritt stål mögel.
- Tvätta rostfritt stål mögel av tvättmedel, etanol och avjoniserat vatten att avlägsna de potentiella föroreningarna. Torrt mögel genom kväve.
- Ren kapillärerna
- bära skyddsglasögon, lab enhetliga och kemiska skyddshandskar.
- Plats kapillärer till en bägare. Ren kapillärerna med 30 mL aceton för 5 min att ta bort organiskt material och sedan tvätta kapillärerna med avjoniserat vatten.
Försiktighet: Hantera aceton i ett dragskåp. - Häll 10 mL H 2 O 2 i bägaren och tillsätt därefter 30 mL H 2 så 4 in i H 2 O 2 med sakta skakar för att förhindra överhettning. Kontrollera att lösningen (piranha lösning) helt täcker kapillärerna i minst 30 min.
Varning: Var försiktig vid hantering av piranha lösning (H 2 SO 4 h 2 O 2 = 3: 1, v/v) . Om piraya lösningen spills, tvätta bort lösningen snabbt med en stor mängd vatten och torka med hushållspapper.
Obs: Noggrann rengöring av kapillärer är en av de viktigaste punkterna att säkerställa framgång för lampa reaktionen. Det är nödvändigt att skaka syra cylindern under reningsprocessen bort bubblorna i kapillärerna och ren tiden kan även utökas när det krävs. - Tvätta bort piranha lösningen med en stor mängd vatten. Tvätta kapillärer med etanol och avjoniserat vatten för 5 min varje. Torka kapillärerna i torkugn.
- Häll Polydimetylsiloxan (PDMS)
- vikt ut PDMS bas och bota reagenser med förhållandet 1:1 i en 50 mL tub. Typiskt, blanda 5 g av elastomer bas till 5 g av elastomer härdare.
- Rör blandningen grundligt i ca 5 min med en glasstav. Placera röret med PDMS i en vakuum glaskupa för 30 min för avgasning.
- Häll PDMS långsamt in i cylindern av rostfritt stål mögel. Tillåta PDMS att bota för 3 h i torkugn vid 60 ° C
Obs: var noga med att undvika luftbubblor när hälla PDMS. Efter hälla PDMS, låt den stå i 5 min för naturliga avlägsnande av bubblorna ur PDMS.
- Ta bort mögel från PDMS
- efter härdning av PDMS, ta bort formen genom att dra ut formen med cylinder. Ta bort PDMS från cylindern genom att skära marginalen av mögel med en skalpell.
- Tvätta PDMS tre gånger med etanol och avjoniserat vatten. Torr i PDMS stöd med kväve.
- Behandla det lägre ytbehandlar av PDMS stöd vara hydrofoba. Blöt PDMS stöd i en super hydrofoba päls för 1 s. torr det under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Infoga kapillären i PDMS stöd
- Infoga rengjorda 4 mm kapillärerna in i hål i PDMS stöd och lämna 0,5 mm i kapillärerna utanför den övre ytan av PDMS stöd. Se till att ändarna av kapillärer är på samma nivå.
- Behandla utsidan av kapillärerna och ovansidan av PDMS stöd vara hydrofoba.
- Lägg till 15 µL Super hydrofoba pälsen på ovansidan av PDMS stöd. Observera att beläggningen omedelbart sprider sig över hela den övre ytan (inklusive ovansidan av PDMS stöd och de yttersta ytorna av den exponerade delen av kapillärerna) av kapillär kraft.
- Luft torka Super hydrofoba modifierade kapillär matrisen.
- Fix primer till kapillär array
- förbereda primer lösning. Vikt ut 0,65 g chitosan (molekylformel: (C 6 H 11 nr 4) n) och Lös det till 50 mL avjoniserat vatten genom att justera pH till 4,5-5,5 med ättiksyra att uppnå en chitosan koncentration av 1,3%. Förbereda primer komponenter mix enligt tabell 1. Se kompletterande Tabell1 för grundfärger
- lägga till 1.6 µL av blandningen av en uppsättning grundfärger att fylla en motsvarande kapillär kapillär matrisens enligt en fördesignad.
Obs: De återstående två tomma kapillärerna sattes som negativa kontroller. - Förankra matrisen i en transparent väl av en vanlig platt bottenplattan med 96 brunnar och torka matrisen vid 60 ° C i minst 2 h.
| lampa primer infästningsdetaljer mix (startkoncentration) | volym (μl) |
| ddH 2 O | 17,0 |
| Chitosan (1,3%) | 1.0 |
| FIP/BIP primer (20 μM) | 2.0/2.0 |
| LoopF/LoopB primer (20 μM) | < td > 1.0/1.0|
| F3/B3 primer (20 μM) | 0,5/0,5 |
| totala volymen | 25,0 |
tabell 1: komponenter i lampan primer fastställande reagenser. Komponenterna i lampa primer fastställande mix listas i den vänstra kolumnen i tabellen, och volymen av varje komponent finns i den högra kolumnen.
- montera kassetten enligt följande. Sätta en lastning adapter på toppen av förankrade array. Se till att skålen av adaptern bara täcker de utsatta delarna av alla tio kapillärer (se figur 1).
figur 1: Den Kassett tillverkning och montering. (en) rostfritt mögel och PDMS stöd. Formen består av 3 delar: cylinder, dam styrelsen och pelaren plattan. (b) schematiskt av PDMS stöd tillverkning och montering av kapillär kassetten. Hela processen innehåller 5 steg: 1. PDMS hälla, 2. mögel borttagning, 3. kapillär infoga och ytbeläggning, 4. primer fastställande och 5. kassetten förankring. 1. Häll PDMS i cylindern av mögel; 2. Tryck ut dam styrelsen att ta bort mögel från PDMS stöd; 3. coat ner ytan av PDMS stöd och sedan infoga kapillärerna i PDMS stödja, slutligen bestryka den övre ytan av PDMS stöd och utsatt kapillärer. Den tjocka blå linjen indikerar Super hydrofoba Rock; 4. Ladda primer i enskilda kapillärerna; 5. förankra kapillär matrisen i en enda plattan med 96 brunnar och installera ett prov som laddar adapter på den. Detaljerna har beskrivits i protokollet steg 1,1-1,9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. prestanda av lampa reaktion i kapillär matris
- förbereda reaktionsblandning
- förbereda lampa reaktion mixen enligt T kan 2.
- Lägg till reagenser till blandningen enligt den valda ordern, liksom i tabell 2, och vortex reaktionsblandningen för 5 s efter tillägger calcein. Försiktigt iVert röret 20 gånger efter Bst polymeras läggs.
| lampa komponenter (ursprunglig koncentration) | volym (μl) |
| ddH 2 O | 11,6 |
| MgSO 4 (100 mM) | 2.0 |
| dNTP (25 mM) | 1.4 < t d > |
| betain (5 M) | 4.0 |
| buffert (10 x) | 2.5 |
| Calcein (1.25 mM) | 0,5 |
| MnCl 2 (25 mM) | 0,5 |
| Bst < märka > polymeras (8 U/μL) | 1,5 |
| växt DNA (10 ng/μl) | 1,0 |
| totala volym | 25,0 |
Tabell 2: Reaktion systemet av den kapillära array-lampan. Komponenterna i systemets reaktion av kapillär array lampa komponenter anges i vänstra kolumnen, och volymen av varje komponent visas i den högra kolumnen.
- Ladda reagenser och försegla kassett
- reaktionsblandningen pipett 20 µL lampa med en standard 100 µL tip. Sätt spetsen i öppningen av lastning adaptern att låsa den. Injicera försiktigt reaktionsblandningen i skålen av adapter; reaktionsblandningen kommer snabbt fylla skålen och fyll sedan kapillärerna automatiskt genom kapillär kraft.
- Ta bort adaptern med låst spetsen och täta brunnen av en PCR-kompatibel genomskinlig försegling film.
Obs: Endast kapillärerna röra reaktionsblandningen i hydrofil skålen kunde fyllas. Kontrollera så att ovansidan av alla kapillärerna är av samma höjd (se figur 2).
figur 2: Diagram över provet-lastning med lastning nätadaptern. Bilden visar inläsningen anställa blå lösning som ett exempel. Sätt spetsen i inloppet och injicera provet i adaptern långsamt och ta bort adaptern med låst spets. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Inkubera kapillär matrisen i en inkubator vid 63 ° C under 1 h.
3. resultat avläsning och analys av Data
- Hämta bilder av fluorescens utsläpp.
- Fixa ett UV-filter på ovansidan av en liten handhållen UV LED ficklampa att filtrera det synliga ljuset.
- Excitera den dissocierade calcein avge fluorescens med UV ficklampa. Fånga bilder från toppen av kapillär matrisen av antingen en digital kamera eller en smartphone.
- När du tar en bild, se till att kameran är inzoomad på området av kapillärerna som möjligt att få hög kvalitet, tydliga bilder.
- Analysera resultaten
- Öppna programvaran bild av bildanalys och välj sedan " bild > mögel > gråskala > Ja " och " bild > mögel > 16-bitars > Ja ". Välj " filen > Spara som > format > TIFF " att konvertera bilden till 16-bitars TIFF-format.
- Extrahera värdet av fluorescensintensiteten
- Öppna programvaran microarray analys. Dra 16-bitars TIFF format bilden till gränssnittet för programvaran och välj sedan våglängden " 532 nm " och en färg av " gröna " att visa bilden.
- Skapa ett nytt block att lokalisera fluorescens signalen från kapillärerna. Välj " verktyg > nya block " och ange antalet kolumner och rader som " 1; 1 " och " 2; 5 " i den ' block ' och ' funktioner ' gränssnitt separat.
- Höger klicka och välj " funktioner " modell och sedan justera läge och diameter för att passa området fluorescens i kapillärerna. Välj " analysera " extrahera värdet av fluorescensintensiteten.
- Välj " filen > Spara inställningar som " att spara block dokument och välj " filen > Spara resultaten som " att spara fluorescensen intensitet resultat. Beräkna SNR för att definiera om lampan utförs framgångsrikt i kapillärerna.
Obs: Signaler i kapillärerna erhölls genom inspelning grå värdena av ställen och signal till brus förhållande (SNRs) definieras som förhållandet mellan medelvärdena för förgrunden signaler av målen till genomsnittliga medelvärdena för förgrunden signaler av två negativa kontroller. Cutoff att fastställa positiva signaler angavs som SNR > 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna metod är det viktigt att förhindra korskontaminering mellan olika kapillärerna under provet lastning. För detta ändamål infördes chitosan, som kunde behålla primers i enskilda kapillärerna. För att testa om det fungerade eller inte, fast vi pre ADH1 (endogena Referensgenen majs) primer i kapillär kassett med mönster av ”T” och ”U”, som illustreras i figur 3a. Som förväntat, endast de kapillärer som innehöll primern sätter visar positiva signaler (figur 3b).
Figur 3: exempel på kapillär resultatet. (en) layouten för kapillär matrisen. De gröna prickar indikerar att ADH-1 primer uppsättningar korrigeras före i kapillärerna. (b), fluorescerande fotografier av de två kapillära matriserna efter lampan. Den gröna färgen fram positiva lampa förstärkning. Testet utfördes i två exemplar. Framgångsrika förstärkning bara presenteras i primer-fasta kapillärer och utan kontaminering bland tomma kapillärer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att ytterligare utvärdera möjligheten att övervaka GMO, vi valde sju vanliga transgena element som täcker ~ 75% av de kommersialiserade GMO händelserna (dvsP-CaMV35S, bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos och nptII) (figur 4, layout) som motsvara antalet kapillärer 1-7, och en endogen Referensgenen för majs (ADH1). För att visa denna metod, tre GM händelser specificitet var (MON863, MON89034 och 59122) valts och tillämpas på lugnet. För att analysera resultaten, fluorescens bilder togs av kameran och analyseras enligt beskrivningen i protokollstegen. Förväntade resultat erhölls för alla tester (figur 4). Till exempel för GM-majs MON863, positiva signaler erhölls för kapillärerna 1, 6, 7 och 8, som motsvarar mål P-CaMV35S, T-nos, nptII och endogena Referensgenen ADH1, respektive.
Figur 4: specificiteten för övervakning GMO. Detektion av olika DNA-prover, dvsMON863, MON89034, 59122, blandning av alla de ovanstående tre GM evenemang (GMO mix), icke-GM-majs och rent vatten (ingen mall styrning, NTC). 1 - 8: kapillärer före fast med lampa primer uppsättningar av P-CaMV35S, bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos, nptII, och ADH-1, individuellt. 9 - 10, två no-primer kontroller. Testet utfördes i två exemplar och vi fann att alla resultat överensstämde med förväntningar. Se kompletterande tabell2 för dataanalys vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
För att testa prestanda för vår metod i en verklig värld ansökan, valdes två praktiska majs prover för analys av lugn. Sedan jämfördes resultaten med realtids PCR och resultaten var konsekvent (figur 5, kompletterande tabell2)
Figur 5: resultaten av tester två majs prover. 1 - 8: kapillärer före fast med lampa primer uppsättning P-CaMV35S, bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos, nptII, och ADH-1, individuellt. 9 - 10, två no-primer kontroller. Testet utfördes i två exemplar sedan resultaten jämfördes med realtids-PCR och resultaten överensstämde. Se kompletterande tabell3 för jämförelse resultat. Se kompletterande tabell2 för dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Tabell1: lista av lampa primer sekvenser. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Tabell2: dataanalys lampans array experiment. Grön färg kodade cellerna i tabellen indikerar det positiva resultatet. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Tabell3: realtids PCR resultat rapportering formulär. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LUGN plattformen visat här, som kombinerar lampa tekniken med en kapillär array, möjliggör samtidiga detektion av flera GMO-relaterade gen mål i en enda, mycket effektiv och lätt att använda test.
För att framgångsrikt utföra multiplex lampa reaktionerna i kassett, måste tre kritiska punkter märkas. För det första, att uppnå samma höjd för den övre sidan av kapillärerna och hydrofil och hydrofoba mönstret av kapillär matrisen är avgörande för samtidigt laddar reagenser i alla kapillärerna. Kapillärerna bör anpassas av en tallrik efter första isättning i PDMS stöd att se till att alla av dem kan röra laddade reaktionsblandningen i skålen av lastning adaptern. Vid behandling av kapillär matrisen med Super hydrofoba pälsen, Tillåt inte pälsen att suga in den inre ytan av kapillärerna. Behandla den yttre ytan av kapillärerna genom att bara ladda pälsen på ovansidan av toppen PDMS stöd, vilket gör att beläggningen att sprida sig till den yttre ytor av de övre delarna av kapillärerna. Om det händer ibland att inte alla kapillärerna är fyllda med reagenser, kan det vara klokt att läsa in reagens direkt till en specifik kapillär.
För det andra, var försiktig med utarbetandet av lampa reagenser. Hela processen bör försiktigt och snabbt utföras på isen, på grund av den relativt låga reaktion temperaturen av lampa och bräckligheten i det Bst polymeraset. Det är tillrådligt att skaka reaktionsröret med lampa blandningen försiktigt i stället för vortexa röret våldsamt efter tillägger Bst -polymeras. En olämplig hantering kan orsaka reaktionen. I detta experiment, ADH1 (endogena Referensgenen majs) är inställt som positiv kontroll och två kapillärer utan primers är som Tom kontroller. Om lampan blandningen hanteras korrekt, den positiva kontrollen skulle visa grön och blankprovet skulle förbli oförändrad efter testet utförs.
För det tredje på grund av den höga verkningsgraden lampa reaktion, kan falsk positiv eller kvarstående kontaminering inträffa om det finns ett spår mängd DNA amplikon i miljön. Därför alltid komma ihåg att operativa processer före reaktion och efter reaktion bör vara strikt åtskilda i olika områden och lampa produkterna ska vara tätt förslutna och kasseras efter analys. Dessutom bör ett blankprov fastställas för att indikera en tillräcklig prestanda av lampan.
Intimt, är lugn en universell flera mål nukleinsyra detektionsmetod med god flexibilitet och utbyggbarhet. LAMPA reaktioner utförs i kapillärerna kan lätt ersättas av andra typer av isotermiska förstärkning metoder, såsom rullande cirkel amplifiering (RCA)29, och recombinase polymeras amplifiering (RPA)30. Det kan också tillämpas inom andra upptäckt områden, såsom patogen upptäckt27 och sjukdom diagnos31.
I nuvarande form av denna metod, även om primer uppsättningar korrigeras före med chitosan, behövs processen för lampa blandningsförberedelsen fortfarande när provet utförs, vilket sänker enkelheten i metoden. För att åtgärda detta, skulle vi försöka förspänning alla reagenser av lampa i kapillären och sedan Pipettera provet i kassetten. En annan begränsning för vår metod kan vara avsaknaden av nukleinsyra utvinning, men vi utvecklar nu en mobilbaserad maskin som skulle kombinera utvinning av nukleinsyror, automatisk bild tar och dataanalys att uppnå en verklig ”prov- och resultat-out ”metoden.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat lugn plattformen genom att integrera multiplex lampa med en kapillär array. Som en allmän nukleinsyra detektionsmetod, kan lugn också ha potential i ett brett utbud av andra program för analys av nukleinsyra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Studien var delvis finansierad av National Natural Science Foundations av Kina bidrag (31370813, 3147670, 31670831 och 31600672,), nationella transgena växter särskild fond (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), Program för nya århundradet utmärkt talanger i Universitet, viktiga forsknings- och utvecklingsprojekt i Kina (2016YFA0500601) och Kina postdoktorala Science Foundation (2016M 591667).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1. 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how? J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
