Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å bestemme protein halv-bor i enkelt levende tilhenger celler, puls merking og fluorescens tidsinnstilt bildebehandling SNAPIN-tag fusion proteiner.
Abstract
Proteiner er i en dynamisk tilstand av syntese og nedbrytning og halv-livet kan justeres i ulike situasjoner. Men mest brukte tilnærminger til å bestemme protein half-life er begrenset til befolkningen gjennomsnitt fra lysed celler eller krever bruk av protein syntese hemmere. Denne protokollen beskriver en metode for å måle protein halv-bor i enkelt levende tilhenger celler, bruke SNAPIN-tag fusion proteiner i kombinasjon med fluorescens time-lapse mikroskopi. Noen protein rundt smeltet sammen til en SNAPIN-kode kan bindes covalently av et lysstoffrør, celle permeable fargestoff som er koblet til en benzylguanine derivat, og forfallet av befolkningen merket protein kan overvåkes etter bleke av gjenværende fargestoffet. Etterfølgende cellen sporing og kvantifisering av integrert fluorescens intensiteten over tid resultater i en eksponensiell decay kurve for hver merkede celle, slik at bfu protein fornedrelse i enkeltceller ved montering kurve. Denne metoden gir et estimat for mangfold i halv-bor i en befolkning på kulturperler celler, som ikke kan lett bli vurdert av andre metoder. Tilnærmingen presenteres her gjelder alle typer kulturperler tilhenger celler som uttrykker et protein rundt smeltet sammen til en SNAPIN-kode. Her bruker vi musen embryonic stem (ES) celler dyrket på E-cadherin-belagt celle kultur plater for å illustrere hvordan enkelt celle fornedrelse priser proteiner med et bredt spekter av halveringstid kan bestemmes.
Introduction
Det er velkjent at mobilnettet proteiner gjennomgår omfattende omsetning, syntese og nedbrytning priser blir bestemt for hver protein med fysiologiske regulering. Protein fornedrelse priser har tradisjonelt vært målt med bulk metoder som radioaktivt puls chase analyse, eller involverer protein syntese hemmere som gapestokk1. Flere nylig, stabil isotop merking med aminosyrer i cellekultur (SILAC) i kombinasjon med massespektrometri er etablert for å kvantifisere protein omsetning på en global skala2. Men disse metodene er begrenset av befolkningen gjennomsnitt, og informasjon om celle-til-celle variasjon er derfor tapt. Videre kan ikke forbigående endringer i protein fornedrelse som er usynkronsierte over befolkningen cellen identifiseres.
Alternativt kan protein halv-liv også fastslås ved fluorescens-baserte tilnærminger, som ofte har fordelen av å gi encellede oppløsning. For eksempel har et photoactivatable grønne fluorescerende protein (paGFP) blitt brukt til å bestemme Oct4 half-life i tidlige pattedyr embryoet3. En annen metoden å overvåke protein forfall i levende celler er bruken av en SNAPIN-kode i kombinasjon med fluorescens tidsinnstilt bildebehandling. SNAPIN-koden er en mutert versjon av DNA reparasjon enzym O6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) som spesielt reagerer med benzylguanine (BG) derivater, som kan kobles til molekylær sonder4,5, 6. derfor alle SNAPIN-tag fusion protein kan bli irreversibelt merket med et fluorescerende, celle permeable fargestoff. Puls merking av et protein rundt smeltet i SNAPIN-koden, etterfulgt av bleke den gjenværende fargestoff, tillater for overvåking nedbrytning av befolkningen merket protein og dermed for å bestemme protein half-life. SNAPIN-koder har blitt brukt for puls-jage merking av proteiner og for å bestemme protein halv-bor i tilhenger celle kultur og i vivo5,7,8,9. Et stort utvalg av SNAPIN-tag underlag dekker brukte lysstoffrør spectra er kommersielt tilgjengelig, slik at utvalget av optimal farge for hvert bruksområde. Dermed kan SNAPIN-koder også brukes for multicolor bildebehandling i kombinasjon med andre fluorescerende fusion proteiner eller fargestoffer. Celle-ugjennomtrengelig fargestoffer er egnet for merking av membran-bundet proteiner, mens celle-permeable fargestoffer gjelder for overvåking av både intracellulær og membran-bundet proteiner. Videre noen av disse sonder exhibit nesten ingen basale fluorescens og bare starte utsendt et sterkt fluorescerende signal ved binding til en SNAPIN-tag10.
Denne protokollen beskriver hvordan du angir nedbrytning av ulike proteiner av interesse i enkeltceller benytter en SNAPIN-tag. Bruker her vi denne metoden musen embryonic stem (ES) celler kultivert på E-cadherin, men det bør være mulig å bruke den med en tilhenger kulturperler celle type. Vi viser at pulsen merking av SNAPIN-tag fusion proteiner etterfulgt av fluorescens tidsinnstilt bildebehandling kan bestemme enkeltcelle halv-livet av rundt og gir et estimat for celle til celle variasjon av halv-bor i en befolkningen i kulturperler celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: I denne studien E14 ES celle linjen ble brukt. Men er denne protokollen direkte gjelder alle andre mus ES celle linjen uttrykke et protein rundt smeltet sammen til en SNAPIN-kode, enten ved merking endogene protein eller overuttrykte. For eksempel vises i resultatinndelingen doxycycline-induserbart SNAPIN-tag fusion linjer ble brukt (SNAPIN-tag smeltet til følgende proteiner: Nanog, Oct4, Srsf11, eller fluorescerende proteiner mOrange2 og sfGFP og satt under kontroll av en Doxycycline-induserbart promoter. Se11 for ytterligere informasjon om plasmider brukt for generering av doxycycline-induserbart SNAPIN-tag fusion cellelinjer). Doxycycline-induserbart systemet kan være spesielt nyttig, som gjør det mulig for tett kontroll tidsberegningen og intensiteten i uttrykket av protein av interesse. C-terminalen plassering av SNAPIN-koden anbefales, som endrer N-terminalen aminosyresekvens er mer sannsynlig å endre halveringstiden av målet protein (N-end regel12).
1. E-cadherin belegg og celle såing
- Generere en ES cellen linje uttrykke et protein rundt smeltet til SNAPIN-tag4.
- Lag 100 mm celle kultur retter med 4 mL 0,1% gelatin (utvannet i fosfat bufret saltvann (PBS) uten Ca2 +/Mg2 +) for 1 h. fjerne gelatin og la tørke for 1 h. Bruk umiddelbart eller lagre belagt retter for opptil 2 måneder.
- Vokse celle linjen av interesse i ES celle kultur medium (Glasgow Minimum viktig Medium, supplert med 10% ES celle kvalifisert fosterets bovin serum, 2 mM natrium pyruvate, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1% penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin, 100 µM 2- mercaptoethanol, leukemi hemmende faktor (LIF), 3 µM CHIR99021 og 0,8 µM PD184352) gelatin-belagt retter på 37 ° C og 5% CO2 for 2 dager fram en samløpet av 10-20 Mio celler per fat.
Merk: Her LIF ble produsert av forbigående hva HEK 293T celler, etterfulgt av supernatant samling og filtrering. Hvert sett med LIF ble testet for dens potensial for å opprettholde pluripotency, men konsentrasjonene var ikke bestemt. Men rekombinant LIF er også kommersielt tilgjengelig og konsentrasjonen brukte for musen ES cellekultur er 1000 enheter/mL13. - Coat en 96-brønns plate egner seg for tenkelig med 30 µL av rekombinant mus E-cadherin Fc chimera protein (E-cad-Fc) per brønn (5 ng/µL, fortynnet i PBS med Ca2 +/Mg2 +. Bruk lager konsentrasjoner av 100 ng/µL, lagret på-80 ° C). Unngå omfattende pipettering, som E-cad-Fc er svært skjøre. Inkuber ved 37 ° C i 1,5 t.
Merk: Avhengig av mikroskopet, andre formater kan brukes. - Sug opp E-cad-Fc, vask en gang med 100 µL av PBS med Ca2 +/Mg2 +og legge 100 µL av forvarmes ES celle kultur medium.
- Vask cellene rundt med 5 mL PBS uten Ca2 +/Mg2 +. Sug opp og legge 2 mL Trypsin-EDTA 0,25%. Inkuber for 4 min på 37 ° C. Legge til 4 mL ES celle kultur medium, resuspend og spinne ned 1000 x g for 4 min. leveringstanken nedbryting og resuspend pellet i 2 mL frisk ES celle kultur medium.
Merk: PBS uten Ca2 +/Mg2 + bør brukes for vask cellene før trypsinization for å fjerne Ca2 + ioner, som kreves for celleadhesjon. E-cad-Fc fortynning og belegg (trinn 1.4), kan du bruke PBS med Ca2 +/Mg2 +, siden vedheft av ES celler til E-cad-Fc belagt retter er derimot Ca2 +-avhengige14. - Fortynn resuspended celler 1:10 i 1 mL av ES celle kultur medium og telle, bruke en telling kammer (Last 10 µL for et kammer 0,1 mm dybde).
- Frø 30.000 celler/cm2 i E-cad-Fc belagt tenkelig plate. Fyll opp til 200 µL per brønn med ES celle kultur medium. For doxycycline-induserbart cellelinjer, indusere med en passende dose doxycycline (Optimaliser dose og timing av induksjon på forhånd. Cellelinjer her ble behandlet med 500 ng/mL doxycycline 24 timer før imaging). Ruge på 37 ° C og 5% CO2 og fortsett med pulsen merking og imaging 24 timer etter celle seeding.
2. puls merking av SNAPIN-koden
Merk: For protein forfall eksperimenter er det viktig å bruke en tilstrekkelig SNAPIN fargestoff konsentrasjon. Konsentrasjonen bør være høy nok til å gi et lys signal i begynnelsen av den time-lapse, som fluorescensen vil avta over tid. Imidlertid kan bruker for høy fargestoff konsentrasjoner forårsake gjenværende fargestoff blir igjen i medium eller i cellene selv etter vask. Gratis fargestoff kan deretter binde til nylig produsert SNAPIN-tag molekyler i løpet av filmen, som vil forvrenge forfallet kurve. Observerte fluorescens signalet avhenger av egenskapene til fargestoff, celle linjen brukes, i tillegg til hvilket uttrykk tilsvarende protein. Derfor er det avgjørende å optimalisere fargestoff konsentrasjonen ved å teste ulike fortynninger, fra fortynning foreslått for levende celle bildebehandling av produsenten. For denne studien, ble en langt rødt fluorescerende underlaget brukt. En optimal konsentrasjon av 12 nM ble fastslått for doxycycline-induserbart overuttrykte linjer.
- Fortynne SNAPIN-fargestoff til riktig konsentrasjonen i forvarmes ES celle kultur medium. Bruke en pipette forsiktig fjerne mediet fra cellene tidligere seeded i 96-brønnen platen og legge 50 µL utvannet SNAPIN fargestoff per brønn. Inkuber i 30 min på 37 ° C.
- Sug opp utvannet fargestoff med en pipette og vask 3 x med 200 µL av forvarmes PBS (uten Ca2 +/Mg2 +). Legge til 200 µL av ES celle kultur medium og ruge i 15 min på 37 ° C.
- Gjenta de forrige vaskemaskin to ganger mer.
Merk: Omfattende vask er viktig for å fjerne en ubundet fargestoff. Gjentatte vask trinnene med PBS fjerne gjenværende ekstracellulære fargestoff i medium, mens 15 min incubations sikre robust merking av SNAPIN-tag fusion proteiner før du starter tenkelig eksperimentet. Men fremgangsmåten vask av mild pipettering og ikke bruker en automatisk aspirator, som cellene seeded på E-cad-Fc pleier å løsne lett. - Legge til 200 µL Imaging medium. Redusere fluorescens bakgrunnen, bruker fenol red fri medium (supplert med 10% ES celle kvalifisert fosterets bovin serum, 2 mM natrium pyruvate, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1% penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin, 100 µM 2-mercaptoethanol, LIF, 3 µM CHIR99021 og 0,8 µM PD184352).
3. time-lapse mikroskopi
- Bruk en microscope egnet til live bildebehandling, slik at temperaturstyrte og CO2. Angi temperaturen til 37 ° C og CO2 til 5% før bruk og la equilibrate 1-2 h.
- Plasser platen i mikroskopet og finne steder egnet for bildebehandling. Velg flekker hvor cellene er jevnt fordelt, men ikke altfor tett, som dette vil lette analysen. Justere antall valgte stedene å antall celler kreves for analysen. I denne studien ble 3-5 spots per celle linje registrert.
- Velg målsettingen. En 20 X-målet er passer ES celler.
- Velg belysning innstillingene for fluorescerende kanalen eller skal registreres. Justere laser makt og eksponering i henhold til intensiteten av fluorescens signalet fra cellene rundt. Sørg for å få et sterkt signal om første, siden det vil redusere i løpet av filmen, men unngå laser makt over 30% for å minimere Phototoksisitet og photobleaching. For denne studien, en eksitasjon filter 632/22 nm (bølgelengde/Båndpassdesign), utslipp filteret i 679/34 nm (bølgelengde/Båndpassdesign), laser makt av 10% og eksponering av 100 ms ble brukt.
- Velg imaging intervaller og varigheten av time-lapse forsøket. Proteiner med forventet halv-liv 2-20 h, Velg oppkjøpet ganger 12-24 h med tidsintervaller på 15 min. For shorter-lived proteiner, redusere intervallene og oppkjøp ganger, longer-lived proteiner økning tilsvarende.
- Starte imaging.
4. image bearbeiding og analyse
- Samle ervervet bildene som en bunke i tiff-format. Bruk FIJI programvare15for ytterligere behandling og analyse. Hvis time-lapse dataene ikke samles som en stabel av mikroskopet, åpne alle rammene av time-lapse eksperimentet i programvaren (enten ved å klikke fil | Åpne... eller dra og slippe de tilsvarende filene på verktøylinjen) og klikk Image | Stabler | Bilder til stakken.
- Bruk funksjonen trekk fra bakgrunnen for å fjerne bakgrunnen fra alle bilder i stakken. Gjør Klikk prosess | Trekke fra bakgrunnen. Velg rullende ballen radius i popup-vinduet. Bruk en radius som er minst størrelsen på cellene fotografert. Du kan bruke bakgrunnen subtraksjon til alle celler i stakken, velge Ja i den prosessen stabel? popup-vindu.
- Velg en celle rundt og tegn en region av interesse (ROI) rundt ved hjelp av verktøylinjen. For kjernefysisk signaler, bruke Oval markeringen ved første klikke kategorien tilsvarende på verktøylinjen og deretter klikke på kjernen av interesse og justere ellipsen rundt elementet. Cytoplasmatiske signaler eller veldig tett områder bruke Frihånd utvalget skal kunne følge nøye celle konturene. Unngå inkludert for store områder av bakgrunn, selv om det ikke er nødvendig å følge celle konturene nettopp på grunn av den påfølgende subtraksjon av alle pikslene (trinn 4.8-4,9).
- Legge til regionen rundt Avkastningen manager ved å klikke analyser | Verktøy | ROI manager | Legge til, eller ved å trykke T på tastaturet.
- Fortsette til den neste rammen ved å flytte kategorien i vinduet stabel eller ved å trykke SKIFT + < på tastaturet, gjenta tidligere handlinger. Følg cellen rundt i løpet av filmen og Legg til Avkastningen av hver ramme ROI manager. Lagre siste Avkastningen angi for hver merkede celle ved å klikke flere | Lagre... i Avkastningen manager.
Merk: Etter celledelinger, spore både datter celler separat og summere deres integrert intensiteter etter bakgrunn subtraksjon (se trinnene 4.6-4,9) å gjøre rede for protein fortynning under celledeling. Lagre den avkastning sett for begge datter celler. - Når cellen rundt spores gjennom hele filmen, klikker du mål, å hente verdier for mener intensiteten og på ROIs. Kopiere fått verdier til et elektronisk regnearkprogram og beregne rå integrert intensiteten i cellen for hver-punkt som følger:
hvor menercer mener intensiteten ogområdeCområdet tilsvarende Avkastningen. - For å beregne lokale bakgrunnen, legger du til en avkastning nær cellen av interesse for hvert tidsrom. Unngå inkludert alle mobilnettet fluorescens signal. Bruk en sirkulær avkastning som er omtrent på størrelse med en celle og flytte eller krympe det tilsvarende hvis nødvendig, f.eks om nabokommunene cellene forstyrre. Gå frem som beskrevet tidligere med mobilnettet avkastning for å få en bakgrunn ROI satt og kopier målt intensitetsverdiene til regnearket.
- For å få en bakgrunn-korrigert verdi for integrert intensiteten av cellen, først beregne integrert intensiteten av bakgrunnen for hvert tidspunkt:
der menerBG er mener intensiteten av bakgrunnen signalet og områdeC er området av Avkastningen rundt cellen. Ikke bruk området bakgrunnen avkastning, med mindre begge områdene har samme størrelse. - Beregn den endelige bakgrunn-trukket integrert intensiteten av cellen for hvert punkt:
- For å normalisere enkeltcelle forfall kurvene, dele intensitetsverdien av hvert tidspunkt intensitetsverdien for første gang-punktet.
Merk: Montering kurve (se trinn 4.11) kan enten utføres på hver eneste celle eller befolkningsgjennomsnittet. En normalisering kreves hvis en populasjon basert gjennomsnitt beregnes for å unngå skjevheter fra forskjellige fluorescens intensiteter mellom celler. Normalisering sikrer dermed at hver celle bidrar med samme vekt til den siste forfall kurven. I tillegg kan normalisering være nyttig å visualisere enkeltcelle henfall uavhengig av deres absolutte fluorescens intensiteter (se Tallene 3A-3 C). Men hvis bare én celle halv-livet er bestemt og data er ikke gjennomsnitt, normalisering trinn kan utelate og montering kurve kan utføres direkte på rådataene. - Bruk et passende bueverktøyet for estimering protein halveringstiden. I denne studien ble MATLAB kurven passende verktøykassen 3.4.1 brukt, som er plassert som standard i delen Apps av MATLAB-grensesnittet. Importere fluorescens intensiteten og verdier fra elektroniske regnearket i MATLAB ved å klikke på kategorien Importer Data åpne kurven passende verktøykassen og velg tidspunkt og fluorescens forfall dataene i X-data og Y data kategorien Velg Egendefinert formel i montering kurve kategorien og angi formelen for en eksponensiell decay:
hvor f (t) er fluorescens intensiteten på et gitt tidspunkt, en innledende intensiteten og b forfallet rate. I Anfall alternativer... kategorien, Velg 0 for nedre grense for både en og b. De beregnede verdiene for en og b vises i resultatvinduet. Beregne halveringstiden som følger:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beskrevet protokollen gir et estimat på celle til celle variasjonen i half-life for enhver gitt protein smeltet sammen til en SNAPIN-kode. Bruk av rekombinant E-cadherin-Fc for belegg av tenkelig platen tillater enkeltcelle oppløsning i ES celler som ellers vokser i koloniene. Enkeltceller kan spores separat i løpet av filmen ( figur 1A).
For å bestemme protein halveringstiden for hver enkelt celle, er det avgjørende å måle integrerte, bakgrunn-trukket SNAPIN-tag fluorescens signalet over tid ( figur 1B), med oppsummering integrert intensiteten av både datter celler i tilfelle av divisjoner. Dette resulterer i en eksponensiell decay kurve for hver celle som forfallet rate og dermed halveringstiden kan hentes av kurven montering ( figur 1 c). Hvis en gjennomsnittlig forfallet kurve beregnes, bør viktigere enkeltcelle spor normaliseres til den første rammen å sikre at hver celle har samme vekt i gjennomsnitt, til tross for antatte forskjeller i første fluorescens intensitet mellom celler.
Tilstrekkelig fargestoff konsentrasjonen avhenger av fargestoff og celle linje brukes, og dermed skal være optimalisert for hvert eksperiment. For å illustrere dette, viser figur 2 forfall kurvene i ulike konsentrasjoner av langt rødt fluorescerende underlaget brukes for alle eksperimentene vist her, testet på doxycycline induserbart SNAPIN-tag fusion cellen linje. En innledende fargestoff konsentrasjon av 3 µM ble valgt i henhold til produsentens instruksjoner og en seriell fortynning av 1:3 ble utført fram en konsentrasjon av 1.4 nM. For de to høyeste konsentrasjonene signalet reduseres ikke, mens den observerte nedgangen er eksponentiell for konsentrasjoner under 111 nM. En optimal konsentrasjon av 12 nM fargestoff ble valgt for videre studier, siden det sikret minimale mengder gjenværende fargestoff igjen i mediet etter vask, men signalet var fortsatt lyst nok å observere klart forfalle kurver for en rekke doxycycline induserbart linjer.
Tall 3A - 3C Vis representant resultater, inkludert enkeltcelle henfall og befolkningen gjennomsnitt, for 3 proteiner med forskjellige gjennomsnittlig halv-liv: pluripotency forbundet transkripsjonsfaktorer Nanog (gjennomsnittlig half-life 2.9 h) og Oct4 (gjennomsnitt Half-Life: 4.8 h), og mye lenger levde pre-mRNA behandling faktor Srsf11 (gjennomsnittlig half-life 25.3 h). Boxplots ( figur 3D) representerer halv-livet Hentet fra enkelt celle forfall kurver ved montering kurve og illustrerer heterogenitet halv-liv for tre proteiner.
Figur 1 : Time-lapse oppkjøp og analyse
A: rekke representant bilder viser forfallet av fluorescens i celler puls merket med SNAP fargestoff. Celle linje: doxycycline induserbart TRE3G-Oct4-SNAPtag, indusert med 500 ng/mL doxycycline 7T før bildebehandling.
B: film analyse og beregning av integrert intensitet. Jegc: integrert intensiteten av cellen, jegBG: integrert intensiteten i bakgrunnen, jegC-BG: bakgrunn-korrigert integrert intensitet.
C: eksponentiell kurve passende utført i MATLAB. Eksempel på en enkeltcelle forfall sporing, tilsvarende passer og de resulterende anslagene for parameterne forfall en og b. Halveringstiden er beregnet som følger: t1/2 = ln (2) /b. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Optimalisering av fargestoff konsentrasjonen.
Fluorescens forfallet av celler puls merket med ulike konsentrasjoner SNAPIN fargestoff. En seriell fortynning av fargestoffet fra 3 µM ble utført. Sporene er gjennomsnitt 5 celler hver, normalisert til den første rammen og sporet for 12 h. celle linje: doxycycline induserbart TRE3G-sfGFP-mOrange2-SNAPtag-PEST indusert med 500 ng/mL doxycycline 24 timer før bildebehandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Enkelt celle variasjon av halv-liv for ulike SNAPIN-merket kandidat proteiner.
A-C: Encellede henfall (lys blå) og befolkningen gjennomsnitt (mørk blå) for doxycycline induserbart Nanog-, Oct4- og Srsf11-SNAPIN-tag fusion proteiner.
D: halv-livene til enkeltceller som ble beregnet ved eksponentiell kurve passer for hver eneste celle. Boxplots vises i loggen2 skala. Boksene viser den interquartile rekkevidden (IQR), svart linje angir medianen. Kinnskjegg representerer de laveste og høyeste verdiene, unntatt outliers (svarte prikker), som er definert som verdier avvikende mer enn 1,5 x fra IQR. N = 20 celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest avgjørende skrittet når benytter en SNAPIN-tag for å overvåke protein forfallet er å sikre at ingen gjenværende ubundet fargestoff står i medium eller i cellene etter vasking, ellers det kan binde til nylig produsert SNAPIN-tag molekyler senere i løpet av eksperimentet og der Eby kompromiss forfallet kurve. Dette er på den ene siden av nøye utfører alle trinnene som beskrives vask. På den annen side, bør fargestoff konsentrasjonen holdes så lavt som mulig, mens du fremdeles er i et område som gir mulighet for å få et godt signal til støyforhold. Som vist i figur 2, skal fargestoff konsentrasjonen være optimalisert for hvert eksperiment tester forskjellige fortynninger. I vårt tilfelle har doxycycline induserbart celle linjene relativt høy uttrykk nivåer, slik at du bruker en lav fargestoff konsentrasjon.
Denne protokollen beskriver en generell tilnærming for å kvantifisere protein fornedrelse i enkeltceller av time-lapse fluorescens tenkelig og ulike aspekter av protokollen kan endres, avhengig av eksperimentelle forhold og målet med tilhørende eksperiment. Protein fornedrelse følger hovedsakelig en første ordre eksponensiell decay. For protein har henfall vist her, R2 verdiene av passer var ganske høy (0,95-0,99) og bruker multi-exponentials ikke forbedret passer. Men hvis fått resultatene fra enkelt eksponentiell passer ikke tilfredsstillende, passende multi-exponentials kan være vurdert, hvilket kunne innbære eksistensen av flere merket protein subpopulasjoner råtnende med ulike priser. Videre innebærer våre bildet analyse rørledning betydelig manuelt arbeid, som bare er mulig hvis begrenset antall celler er analysert. For høyere antall celler anses en mer automatisert tilnærming. Ulike automatiserte verktøy har blitt utviklet i de siste årene, som gir mulighet for segmentering og større sporingsnumre celler16,17. Bevegelsen av celler og hyppige celledelinger er imidlertid utsatt for forårsake segmentering feil og utfordrende. I tillegg når imaging protein henfall reduseres fluorescens signalet over tid, gjør valg av en terskel for segmentering enda vanskeligere. Dermed bør sporingsverktøy være nøye testet før implementert for denne protokollen, som segmentering feil kan forvrenge dataene betraktelig. Dessuten, kan en annen bakgrunn subtraksjon metode anses, avhengig av ervervet bildene. Her bruker vi FIJIS rullende ballen korreksjon, som passer for jevnt opplyst bilder med ganske tynt seeded celler. Men, spesielt hvis bilder har ujevne belysning, mer spesialisert bakgrunn subtraksjon metoder kan være brukt18,19.
En begrensning å vår tilnærming er varigheten av time-lapse opptakene som kan analyseres. For relativt kortvarige proteiner er en tid for ervervelse av ca 12t tilstrekkelig. For longer-lived proteiner, som for eksempel Srsf11, er utføre en kurve passer på en gang rekke 12t mulig. Det er imidlertid viktig å huske at den eksponentielle passer kan være mindre presise for longer-lived proteiner, anskaffelsestiden og tenkelig intervaller bør økes ut som. Hvis rask sykling celler er blir fotografert, vil lengre oppkjøpet tid komplisere analysen, på grunn av økende antall datter celler som skal analyseres. Igjen, i dette tilfellet en mer automatisert analyse pipeline kan være nyttig. Dessuten, når du bruker SNAPIN-tag fusion proteiner for å bestemme protein forfall priser, bør muligheten for SNAPIN-koden endre halveringstiden av endogene protein vurderes. I celle linjene her ser vi ingen bevis for slike effekter, som bestemt halv-livet av Oct4 og Nanog grad samsvarer publiserte verdier3,20,21,22. Ytterligere utelukke en effekt av SNAPIN-koden på protein fornedrelse, spesielt når ingen data på half-life er tilgjengelige, ville ett alternativ være å blokkere proteinsyntese ved gapestokk og utføre vestlige blots på ulike tidspunkt bruker et antistoff anerkjenne endogene protein, og direkte sammenligne forfallet av SNAPIN-merket kandidat protein med ukodede endogene versjon.
Mest tidligere publiserte data på protein half-life er basert på bulk biokjemiske eksperimenter, hovedsakelig tid-retters western blot eksperimenter på hemming av proteinsyntese av gapestokk. Men denne tilnærmingen gir ikke enkeltcelle oppløsning og tidsmessige oppløsningen er lav på grunn av begrenset tid-poeng som kan tas i betraktning. I kontrast, vår encellede tilnærming krever ikke bruk av protein syntese hemmere og kan identifisere celle til celle variasjoner i protein fornedrelse priser. Det kan også identifisere potensielle subpopulasjoner av celler med forskjellige halv-liv, som kan være spesielt interessant for etterforskningen av heterogeneously uttrykt proteiner. Enda en fordel av vår metode er muligheten til å i sili synkronisere cellene og derfor overvåke forbigående endringer i half-life, for eksempel hele cellen syklus. Men krever SNAPIN-tag teknologien generering av en tilsvarende SNAPIN-merket celle linje, som kan være den største ulempen. Viktigst, kan vår tilnærming også brukes til endogenously merket proteiner9. Som nevnt ovenfor vi ikke følger noen bevis for SNAPIN-koden endre endogene protein halveringstiden for proteiner vi har studert, antyder at nøyaktigheten av SNAPIN-tag tilnærming er i samme område som andre metoder.
Metoden som presenteres her vil være nyttig for ulike applikasjoner. Viktigst, gir det mulighet å studere celle til celle variasjon i halv-liv for alle SNAPIN-tag fusion protein rundt. Det er flere andre koder tilgjengelig (for eksempel CLIP-tag23 eller Halo-tag24) som Arbeidsprinsipp er den samme. Puls merking og vaske den gjenværende fargestoff vil føre til en forfallet kurve, som tillater å bestemme protein half-life, mens forlate fargestoff i medium (ved en ligand som er ikke-fluorescerende med mindre bundet til koden) gjør det mulig langsiktige avbildning av et protein rundt. På grunn av det store utvalget av tilgjengelige fluorescerende ligander, kan SNAPIN-koden derfor kombineres med andre koder eller flere andre fluorescently merket molekyler, slik at for å bruke teknikken i ulike sammenhenger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Time-lapse mikroskopi eksperimenter ble utført på den Biomolecular Screening anlegg (BSF), EPFL. Vi takker Marc Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) for videography og redigering av filmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | - | - | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | - | - | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | - | - | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | - | |
| Microsoft Excel | Microsoft | - |
References
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).
- Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).
- Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).
- Bojkowska, K., et al.
- Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells. Methods. 120, 65-75 (2017).
- Komatsu, T., et al. Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method. J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).
- Deluz, C., et al. A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation. Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).
- Varshavsky, A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis. Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).
- Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing. PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).
- Nagaoka, M., et al. E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation. PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).
- Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings. Methods. 85, 3-11 (2015).
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Comm. 8, (2017).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation. Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).
- Lin, Y., et al. Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells. Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).
- Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation. J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
