Summary
Det här protokollet beskriver en metod för att bestämma protein halveringstider i enda levande vidhäftande celler, med hjälp av puls märkning och fluorescens time-lapse avbildning av SNAPIN-tag fusionsproteinerna.
Abstract
Proteiner är i ett dynamiskt tillstånd av syntes och nedbrytning och deras halveringstider kan justeras under olika omständigheter. Men vanligaste metoder för att bestämma protein halveringstid är antingen begränsat till befolkningen medelvärden från lyserat celler eller kräva användning av proteinhämmare syntes. Det här protokollet beskriver en metod att mäta protein halveringstider i enda levande vidhäftande celler, med hjälp av SNAPIN-tag fusionsproteinerna i kombination med time-lapse fluorescensmikroskopi. Något protein sevärdheter smält till en SNAPIN-tagg kan vara kovalent bundna av ett fluorescerande, cell genomsläpplig färgämne som är kopplat till ett benzylguanine derivat och sönderfallet av befolkningens märkta proteinet kan övervakas efter bortspolning av kvarvarande färgämnet. Efterföljande cell tracking och kvantifiering av integrerade fluorescensintensiteten över tid resulterar i en exponentiell förruttnelse kurva för varje spårad cell, vilket möjliggör att bestämma protein nedbrytningshastigheten i enstaka celler genom kurva montering. Denna metod ger en uppskattning för heterogena halveringstider i en population av odlade celler, som enkelt inte kan bedömas med andra metoder. Den strategi som presenteras här är tillämplig på alla typer av odlade vidhäftande celler som uttrycker ett protein av intresse smält till en SNAPIN-tagg. Här använder vi mus embryonala stamceller (ES) celler odlas på E-cadherin-coated cell kultur plattor för att illustrera hur enda cell nedbrytning priser av proteiner med ett brett spektrum av halveringstider kan bestämmas.
Introduction
Det är väl känt att cellproteiner genomgår omfattande omsättning, med syntes och nedbrytning priser att vara specifika för varje protein och fysiologiska regleras. Traditionellt varit protein nedbrytningshastigheten mätas med bulk metoder, såsom radioaktivt puls chase analys, eller berör proteinsyntes-hämmare såsom Kungliga Automobilklubben1. Mer nyligen, stabil isotop märkning med aminosyror i cellkultur (SILAC) i kombination med masspektrometri har fastställts för att kvantifiera protein omsättningen på en global skala2. Men dessa metoder är begränsade av befolkningen i genomsnitt och information om cell till cell variabilitet är därför förlorade. Dessutom kan inte övergående förändringar i proteinnedbrytning som är osynkroniserade i cell befolkningen identifieras.
Alternativt, protein halveringstider kan också bestämmas genom fluorescens-baserat tillvägagångssätt, som ofta har fördelen av att ge enskild cell lösning. En photoactivatable grönt fluorescerande protein (paGFP) har exempelvis använts för att fastställa Oct4 halveringstid i den tidiga däggdjur embryo3. En annan metod att övervaka protein förfall i levande celler är användningen av en SNAPIN-tagg i kombination med fluorescens time-lapse imaging. SNAPIN-taggen är en mutant version av DNA-reparation enzym O6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) som reagerar specifikt med benzylguanine (BG) derivat, som kan kopplas till molekylär sonder4,5, 6. därför alla SNAPIN-tag fusionsprotein irreversibelt kan märkas med en fluorescerande, cell genomsläpplig färg. Pulse märkning av ett protein av intresse smält SNAPIN-etiketten, följt av bortspolning av kvarvarande färgämnet, tillåter för övervakning nedbrytningen av märkta proteinet befolkningen och därmed bestämma protein halveringstid. SNAPIN-Taggar har använts framgångsrikt för puls-chase märkning av proteiner och för att bestämma protein halveringstider i anhängare cell kultur och i vivo5,7,8,9. En stor mängd olika SNAPIN-tag substrat som täcker vanligen används fluorescerande spectra är kommersiellt tillgängliga, möjliggör val av optimal färgen för varje specifik applikation. SNAPIN-taggar kan således även användas för multicolor imaging i kombination med andra fluorescerande fusionsproteinerna eller färgämnen. Cell-impermeable färgämnen är lämplig för märkning av membran-bundna proteiner, cell-permeable färgämnen är tillämpliga för övervakning både intracellulära och membran-bundna proteiner. Dessutom några av dessa sonder uppvisar nästan ingen basala fluorescens och bara börja avger en stark fluorescerande signal vid bindning till en SNAPIN-tag10.
Det här protokollet beskriver hur man mäter nedbrytningshastigheten av olika proteiner av intresse i enstaka celler med hjälp av en SNAPIN-tagg. Vi tillämpa här denna metod på mus embryonala stamceller (ES) celler odlade på E-cadherin, men det bör vara möjligt att använda den med någon vidhäftande odlade celltyp. Vi visar att puls märkning av SNAPIN-tag fusionsproteinerna följt av fluorescens time-lapse imaging tillåter för att bestämma de enda cell halveringstid av olika proteiner av intresse och ger en uppskattning för cell till cell variabilityen av halveringstider i en befolkningen i odlade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: I denna studie användes den E14 ES cellinje. Detta protokoll är dock direkt tillämplig på alla andra musen ES cellinje som uttrycker ett protein av intresse smält till en SNAPIN-tagg, antingen genom att tagga det kroppsegna proteinet eller med överuttryck. För de exempel som visas i resultatavsnittet, doxycyklin-inducerbara SNAPIN-tag fusion cellinjer användes (SNAPIN-tag smält till de följande proteinerna: Nanog, Oct4, Srsf11, eller till fluorescerande proteiner mOrange2 och sfGFP och sätta under kontroll av en doxycyklin-inducerbara arrangören. Se11 för ytterligare information på de plasmider som används för generering av doxycyklin-inducerbara SNAPIN-tag fusion cellinjer). Doxycyklin-inducerbara systemet kan vara särskilt användbart, eftersom det tillåter för att ordentligt kontrollera tidpunkten och intensitet i uttrycket av proteinet av intresse. C-terminal positionering av SNAPIN-etiketten rekommenderas, som att byta den N-terminalen aminosyrasekvens är mer benägna att förändra halveringstiden för målproteinet (N-end regel12).
1. E-cadherin beläggning och cell seedning
- Generera en ES-cellinje som uttrycker ett protein av intresse smält till SNAPIN-tag4.
- Coat 100 mm cell kultur rätter med 4 mL 0,1% gelatin (utspädd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan Ca2 +/Mg2 +) för 1 h. ta bort gelatin och låt torka för 1 h. användning omedelbart eller lagra de belagda rätterna för upp till 2 månader.
- Växer cellinje sevärdheter i ES cellodlingsmedium (Glasgow minst viktigt Medium, kompletterat med 2 mM natrium pyruvat, 1% penicillin/streptomycin, 1% icke-essentiella aminosyror, 10% ES cell-kvalificerade fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 µM 2- merkaptoetanol, leukemi hämmande faktor (LIF), 3 µM CHIR99021 och 0,8 µM PD184352) gelatin-belagd rätter på 37 ° C och 5% CO2 för 2 dagar tills de når en sammanflödet av 10-20 miljoner celler per maträtt.
Obs: Här, LIF producerades av övergående transfection HEK 293T celler, följt av supernatanten samling och filtrering. Varje sats av LIF testades för sin potential att upprätthålla pluripotens, men koncentrationerna bestämdes inte. Dock rekombinant LIF är också kommersiellt tillgänglig och den koncentration som vanligen används för mus ES cellkultur är 1000 enheter/mL13. - Coat en plattan med 96 brunnar passar imaging med 30 µL av rekombinant mus E-cadherin Fc chimera protein (E-cad-Fc) per brunn (5 ng/µL, utspädd i PBS med Ca2 +/Mg2 +. Använd lager koncentrationer av 100 ng/µL, lagras vid-80 ° C). Undvika omfattande pipettering, som E-cad-Fc är mycket bräcklig. Inkubera vid 37 ° C i 1,5 h.
Obs: Beroende på mikroskopet, andra format kan användas. - Aspirera E-cad-Fc, tvätta en gång med 100 µL av PBS med Ca2 +/Mg2 +och tillsätt 100 µL av pre värmde ES cellodlingsmedium.
- Tvätta cellerna av intresse med 5 mL PBS utan Ca2 +/Mg2 +. Aspirera och tillsätt 2 mL av Trypsin-EDTA 0,25%. Inkubera i 4 min vid 37 ° C. Tillsätt 4 mL ES cellodlingsmedium, Omsuspendera och snurra ner vid 1000 x g i 4 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 2 mL färsk ES cellodlingsmedium.
Obs: PBS utan Ca2 +/Mg2 + bör användas för att tvätta cellerna innan trypsinization för att ta bort Ca2 + joner, som krävs för celladhesion. Däremot för de E-cad-Fc utspädning och beläggning (steg 1.4), använder PBS med Ca2 +/Mg2 +, sedan adhesionen av ES-celler till E-cad-Fc belagda rätter är Ca2 +-beroende14. - Späd den återsuspenderade celler 1:10 i 1 mL ES cellodlingsmedium och räkna, använda en räknande kammare (belastning 10 µL för en kammare av 0,1 mm djup).
- Utsäde 30 000 celler/cm2 i E-cad-Fc belagd imaging plate. Fyll upp till 200 µL per brunn med ES cellodlingsmedium. För doxycyklin-inducerbara cellinjer, framkalla med en lämplig dos av doxycyklin (optimera dosen och tidpunkten för induktion i förväg. De cellinjer som används här behandlades med 500 ng/mL doxycyklin 24 h innan imaging). Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 och fortsätt med pulsen märkning och imaging 24 h efter cell sådd.
2. puls märkning av SNAPIN-taggen
Obs: För protein decay experiment är det viktigt att använda en lämplig SNAPIN dye koncentration. Koncentrationen bör vara tillräckligt hög för att ge en ljus signal i början av den time-lapse, som fluorescensen minskar över tiden. Dock kan med för hög dye koncentrationer orsaka kvarstående dye lämnas på medellång eller i cellerna även efter tvätt. Gratis färgämnet kan därefter binda till nyproducerade SNAPIN-tag molekyler under loppet av filmen, som kommer att snedvrida decay kurvan. Observerade fluorescens signalen beror på egenskaperna för färgen, den cellinje som används, samt uttryck nivån av motsvarande protein. Därför är det avgörande att optimera dye koncentrationen genom att testa olika spädningar, start från den utspädning som föreslås för levande cell imaging av tillverkaren. För denna studie användes en mån fluorescerande substrat. En optimal koncentration av 12 nM bestämdes för doxycyklin-inducerbara överuttryck cellinjer.
- Späd SNAPIN färgämnet i lämpliga koncentrationen i förväg värmde ES cellodlingsmedium. Använd en pipett för att försiktigt ta bort mediet från cellerna tidigare seedade i plattan med 96 brunnar och tillsätt 50 µL utspädda SNAPIN dye per brunn. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
- Sug upp det utspädda färgämnet med en pipett och tvätta 3 x med 200 µL före värmde PBS (utan Ca2 +/Mg2 +). Tillsätt 200 µL av ES cellodlingsmedium och inkubera i 15 minuter vid 37 ° C.
- Upprepa stegen två gånger mer tvätt.
Obs: Omfattande tvätt är viktigt för att ta bort eventuella obundet färgämne. Upprepade tvättar stegen med PBS ta bort kvarvarande extracellulära färgämnet i medium, de 15 min inkubationer säkerställa robust märkning av SNAPIN-tag fusionsproteinerna före start imaging experimentet. Dock utför tvätt steg av mild pipettering och Använd inte en automatisk insugningsventil, eftersom cellerna seedade på E-cad-Fc tenderar att lossa lätt. - Tillsätt 200 µL av imaging medium. Att minska fluorescens bakgrunden, använda fenolrött gratis medium (kompletteras med 10% ES cell-kvalificerade fetalt bovint serum, 2 mM natrium pyruvat, 1% icke-essentiella aminosyror, 1% penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin, 100 µM 2-merkaptoetanol, LIF, 3 µM CHIR99021 och 0,8 µM PD184352).
3. time-lapse mikroskopi
- Använda ett mikroskop som är lämplig för levande imaging, att tillåta kontrollerad temperatur och CO2. Ställ in temperaturen till 37 ° C och CO2 till 5% tidigare använda och temperera för 1-2 h.
- Placera plattan i mikroskopet och hitta ställen lämplig för avbildning. Välj ställen där cellerna är jämnt fördelade, men inte alltför tät, eftersom detta kommer att underlätta analysen. Justera antalet valda ställen att antalet celler som krävs för analysen. I denna studie registrerades 3-5 ställen per cell fodrar.
- Välj målet. Ett 20 X-objektiv är lämplig för storleken på ES-celler.
- Välj belysning inställningar för de fluorescerande kanalerna skall registreras. Justera lasereffekt och exponering enligt intensiteten av fluorescens signalen från cellerna av intresse. Se till att få en stark initial signal, eftersom det kommer att minska under loppet av filmen, men undvika laser befogenheter högre än 30% för att minimera fototoxicitet och fotoblekning. För denna studie, en excitationsfilter 632/22 nm (våglängd/bandpass), utsläpp filter av 679/34 nm (våglängd/bandpass), lasereffekt 10% och exponering tid 100 MS användes.
- Välj imaging intervaller och varaktigheten av time-lapse experimentet. För proteiner med beräknade halveringstider för 2-20 h, välja anskaffningstid på 12-24 h med tidsintervaller på 15 min. För äggpredatorn proteiner, minska mellanrum och förvärvet gånger, 297Uuo proteiner ökning med detta.
- Starta imaging.
4. bild bearbetning och analys
- Samla de förvärvade bilderna som en stapel i tiff-format. För vidare bearbetning och analys, använda de FIJI programvara15. Om time-lapse data inte samlas som en stack av Mikroskop mjukvaran, öppna alla ramar av time-lapse experiment i programvaran (antingen genom att klicka på filen | Öppna... eller dra och släppa motsvarande filer i verktygsfältet) och klicka på bild | Stackar | Bilder att stapla.
- Använd funktionen subtrahera bakgrunden bort bakgrunden från alla bilder i bunten. Så, klicka processen | Subtrahera bakgrunden. Välj den rullande boll radien i popup-fönstret. Använd en radie som är minst storleken på de celler som avbildas. Om du vill använda bakgrunden subtraktionen till alla celler i stacken, Välj Ja i den processen stacken? popup-fönster.
- Markera en cell av intresse och rita en region av intresse (ROI) runt den med hjälp av verktygsfältet. För nukleära signaler, Använd ovala markeringen genom att första Klicka på den motsvarande fliken i verktygsfältet och sedan klicka på kärnan av intresse och justera ovalen runt den. För cytoplasmiska signaler eller mycket täta regioner använda freehand markeringen för att kunna nära följa cell konturerna. Undvika alltför stora regioner av bakgrund, även om det inte är nödvändigt att följa cell konturerna just på grund av den efterföljande subtraktionen av alla bakgrundspixlar (steg 4,8-4,9).
- Lägg till regionen av intresse till ROI manager genom att klicka analysera | Verktyg | ROI manager | Lägg till, eller genom att trycka på T på tangentbordet.
- Gå vidare till nästa bildruta genom att flytta fliken i fönstret stack eller genom att trycka på SKIFT + < på tangentbordet, sedan upprepa tidigare åtgärder. Följ cellen av intresse under hela filmen och lägga till ROI för varje bildruta i ROI chefen. Spara sista ROI ange för varje spårad cell genom att klicka på fler | Spara... i ROI chefen.
Obs: Efter celldelningar, spåra båda dottercellerna separat och summerar sin integrerade intensiteter efter bakgrunden subtraktion (se stegen 4.6-4.9) för att redovisa protein utspädning under celldelningen. Spara de ROI uppsättningarna för båda dottercellerna. - När cellen sevärdheter spåras genom hela filmen, klicka på åtgärd, för att erhålla värden för medelvärdet intensiteten och området av ROIs. Kopiera de erhållna värdena till en elektronisk kalkylprogram och beräkna raw integrerad intensiteten i cellen för varje tidpunkt enligt följande:
där menarcär den genomsnittliga intensiteten ochområdeCområdet av motsvarande ROI. - Lägga till en ROI nära cellen av intresse för varje tidsram för att uppskatta lokala bakgrunden. Undvika att någon cellulära fluorescens-signal. Använda en cirkulär ROI som är ungefär storleken på en cell och flytta eller krympa det med detta om det behövs, t.ex. om angränsande celler. Fortsätt som beskrivet tidigare med cellulära ROI för att få en bakgrund ROI ställa och kopiera uppmätta intensitetsvärdena till kalkylbladet.
- För att få en bakgrund-korrigerade värde för integrerad intensiteten i cellen, först beräkna integrerad intensiteten i bakgrunden för varje tidpunkt:
där menarBG är genomsnittliga intensiteten av bakgrund signal och områdeC är området av ROI omger cellen. Använd inte området i bakgrunden ROI, såvida inte båda områdena har samma storlek. - Beräkna slutligt bakgrund-subtraheras integrerad intensiteten i cellen för varje tidpunkt:
- För att normalisera den enda cell sönderfall kurvor, dela intensitetsvärdet för varje tidpunkt av intensitetsvärdet för den första tid-punkten.
Obs: Den kurva-monteringen (se steg 4.11) kan antingen utföras på varje enskild cell eller på genomsnittet i befolkningen. En normalisering krävs om en population baserad medelvärdet beräknas för att undvika fördomar från olika fluorescens stödnivåer mellan celler. Normaliseringen därigenom säkerställer att varje cell bidrar med samma vikt i slutligt förfall kurvan. Dessutom kan normalisering vara användbart att visualisera de enda cell sönderfall oberoende av deras absoluta fluorescens stödnivåer (se Figurerna 3A-3 C). Men om bara encelliga halv-liv bestäms och data inte är i genomsnitt, steget normalisering kan utelämnas och kurva montering kan utföras direkt på rådata. - För uppskattning av protein halveringstiden, verktyget en kurva montering. I denna studie användes MATLAB kurvan passande verktygslåda 3.4.1, som ligger som standard i avsnittet appar av MATLAB användargränssnittet. Importera fluorescensintensiteten och tidsvärden från det elektroniska kalkylbladet i MATLAB genom att klicka på fliken Importera Data öppna kurvan passande verktygslådan och välj de tidpunkter och fluorescens decay data i X data och Y data tab. välja Anpassade ekvation i kurva montering fliken och ange ekvationen för en exponentiell förruttnelse:
där f(t) fluorescensintensiteten vid en viss tid-punkt, en inledande intensiteten och b andelen förfall. I Passar alternativ... fliken, Välj 0 för den nedre gränsen för både a och b. De uppskattade värdena för a och b visas då i resultatfönstret. Beräkna halveringstiden enligt följande:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskrivs ger en uppskattning av cell-till-cell variabiliteten i halveringstiden för något visst protein smält till en SNAPIN-tagg. Användning av rekombinanta E-cadherin-Fc för beläggning av bildbehandling plattan möjliggör enda cell upplösning i ES-celler, som annars växer i kolonier. Enstaka celler kan spåras separat under hela filmen ( figur 1A).
För att bestämma protein halveringstiden för varje enskild cell, är det viktigt att mäta integrerade, bakgrund-subtraheras SNAPIN-tag fluorescens signalen över tiden ( figur 1B), med sammanfatta båda dottercellerna i integrerade stödnivåerna fall av divisioner. Detta resulterar i en exponentiell förruttnelse kurva för varje cell, där andelen förfall och därmed halveringstiden kan utvinnas av kurva montering ( figur 1 c). Ännu viktigare, om en genomsnittlig decay kurva beräknas, bör enda cell spår normaliseras till den första bildrutan så att varje cell har samma vikt på genomsnittet, trots förmodad skillnader i inledande fluorescensintensiteten mellan celler.
Adekvat dye koncentrationen beror på vilken typ av färg och cellinje används, och således bör optimeras för varje experiment. För att illustrera detta, visar diagram 2 den förfalla kurvor av olika koncentrationer av den mån fluorescerande substrat som används för alla experiment visas här, testade på en doxycyklin inducerbara SNAPIN-tag fusion cellinje. En inledande dye koncentration av 3 µM valdes enligt tillverkarens anvisningar och en seriell utspädning av 1:3 utfördes tills de når en koncentration av 1.4 nM. För de två högsta koncentrationerna signalen minskar inte, observerade förfalla är exponentiell för koncentrationer under 111 nM. En optimal koncentration av 12 nM färgämne valdes för ytterligare experiment, sedan det garanteras minimala mängder av kvarvarande färgämne kvar i mediet efter tvätt, men signalen var fortfarande tillräckligt ljust för att iaktta tydliga förfalla kurvor för en mängd doxycyklin inducerbara cellinjer.
Diagram 3A - 3C visar representativa resultat, inklusive den enda cell sönderfall och befolkningen medelvärden, för 3 proteiner med olika genomsnittliga halveringstider: pluripotency associerade transkriptionsfaktorer Nanog (Genomsnittlig halveringstid 2.9 h) och Oct4 (genomsnittlig halveringstid: 4,8 h), och den mycket längre bodde pre-mRNA behandlingen faktor Srsf11 (Genomsnittlig halveringstid 25,3 h). Boxplots ( figur 3D) representerar de halveringstider som erhålls från den enda cell sönderfall kurvor genom kurva montering och illustrera heterogena halveringstider för de tre proteinerna.
Figur 1 : Time-lapse förvärv och analys
A: serie representativa bilder visar förfalla av fluorescens i celler pulse märkt med SNAP färgämne. Cellinje: doxycyklin inducerbara TRE3G-Oct4-SNAPtag, inducerad med 500 ng/mL doxycyklin 7 h innan imaging.
B: film analys och beräkning av integrerade intensitet. Jagc: integrerad intensiteten i cellen, jagBG: integrerad intensiteten i bakgrunden, jagC-BG: bakgrundskorrigerade integrerade intensitet.
C: exponentiell kurva montering utförs i MATLAB. Exempel på en enda cell sönderfall trace, motsvarande passformen och de resulterande uppskattningarna för parametrarna förfall en och b. Halveringstiden beräknas enligt följande: t1/2 = ln (2) b. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Optimering av färgämne koncentrationen.
Fluorescens förfalla av celler puls märkt med olika koncentrationer av SNAPIN färgämne. En seriell utspädning av färgen från 3 µM utfördes. Spåren är medelvärden av 5 celler varje, normaliserade till den första bildrutan och spåras för 12 h. cellinje: doxycyklin inducerbara TRE3G-sfGFP-mOrange2-SNAPtag-PEST, inducerad med 500 ng/mL doxycyklin 24 h innan imaging. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Single cell variabilityen av halveringstider för olika SNAPIN-taggade kandidat proteiner.
A-C: Single-cell sönderfall (ljusblå) och befolkningen medelvärden (mörkblå) för doxycyklin inducerbara Nanog-, Oct4- och Srsf11-SNAPIN-tag fusionsproteinerna.
D: halveringstider för enskilda celler, som beräknades genom exponentiell kurva passande för varje enskild cell. Boxplots visas i2 logskala. Rutorna visar interkvartilintervall (IQR), den svarta linjen visar medianen. Morrhåren representerar de lägsta och högsta värden, exklusive de extremvärden (svarta prickar), som definieras som värden avviker mer än 1,5 x från IQR. N = 20 celler varje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest avgörande steget när du använder en SNAPIN-tag för att övervaka protein förfall är att säkerställa att inga kvarvarande obundet färgämne är kvar på medellång eller i cellerna efter tvätt, inget annat det kan binda till nyligen producerade SNAPIN-tag molekyler senare i samband med experiment och ther Eby kompromiss decay kurvan. Detta är å ena sidan uppnås genom att noggrant utföra alla steg som beskrivs tvätt. Däremot, bör färgämne koncentrationen hållas så låg som möjligt, medan det fortfarande är i ett område som tillåter för att få en bra signal-brus-förhållande. Som visas i figur 2, bör färgämne koncentrationen optimeras för varje experiment genom att testa olika spädningar. I vårt fall har doxycyklin inducerbara cell raderna relativt höga nivåer, vilket möjliggör för att använda en låg dye koncentration.
Det här protokollet beskriver en allmän metod för att kvantifiera proteinnedbrytning i enstaka celler genom time-lapse fluorescens imaging och olika aspekter av protokollet kan ändras, beroende på de experimentella förhållandena och målet med motsvarande experimentera. Proteinnedbrytning följer oftast en första order exponentiell förruttnelse. För protein förbättrats sönderfaller visas här, R2 värden passar var ganska höga (0,95-0,99) och använder multi-exponentials inte avsevärt passar. Men om de erhållna resultaten från enkel exponentiell passar inte är tillfredsställande, passande multi-exponentialfunktioner kan vara ansett, vilket skulle innebära förekomsten av flera märkta proteinet subpopulations förfalla med olika priser. Dessutom innebär vår bild analys pipeline omfattande manuellt arbete, som bara är möjlig om begränsat antal celler analyseras. För större antal celler, bör en mer automatiserad metod övervägas. Olika automatiserade verktyg har utvecklats under de senaste åren, som möjliggör segmentera och större söknummer celler16,17. Men är rörelsen av cellerna och täta celldelningar utmanande och benägna att orsaka segmentering fel. Dessutom när imaging protein sönderfaller, minskar fluorescens signalen över tiden, vilket gör valet av en tröskel för segmentering ännu svårare. Således, spårningsverktyg bör noggrant testas innan de genomförs för detta protokoll, som segmentering fel kan förvränga data betydligt. Dessutom bör en annan bakgrund subtraktion metod övervägas, beroende på kvaliteten på de förvärvade bilderna. Här använder vi Fijis rullande boll korrigering, som är lämplig för jämnt belysta bilder med ganska glest seedade celler. Särskilt om bilder lider ojämn belysning, kan mer specialiserade bakgrund subtraktion metoder emellertid tillämpad18,19.
En begränsning att vårt tillvägagångssätt är varaktigheten av time-lapse inspelningarna som kan analyseras. För relativt kortlivade proteiner räcker en förvärv tid av ca 12 h. För hållbarare proteiner, som for example Srsf11, är det möjligt att utföra en kurva montering på ett tidsintervall på 12 h. Det är dock viktigt att komma ihåg att den exponentiella passar kan vara mindre exakt för hållbarare proteiner, som tidpunkten för förvärvet och imaging intervallen bör ökas. Om snabb cykling celler är som avbildas, kommer att längre anskaffningstid komplicera analysen, på grund av det ökande antalet dottercellerna ska analyseras. Igen, i detta fall en mer automatiserad analys pipeline kan vara användbart. Dessutom, när du använder SNAPIN-tag fusionsproteinerna för att bestämma protein decay priser, bör möjligheten att SNAPIN-etiketten förändra halveringstiden av endogen protein övervägas. När det gäller de cellinjer som används här ser vi inga bevis för att sådana effekter och som de beslutsamma halveringstider för Oct4 och Nanog överensstämmer publicerade värden3,20,21,22. Att ytterligare utesluta en effekt av den SNAPIN-tag på proteinnedbrytning, särskilt när inga data om halveringstiden är tillgänglig, ett alternativ skulle vara att blockera proteinsyntesen av Kungliga Automobilklubben och utföra western blotting vid olika tidpunkter med hjälp av en antikropp erkänner det kroppsegna proteinet, och direkt jämföra förfalla av proteinet SNAP-taggade kandidat med otaggade endogena versionen.
Den tidigare publicerade data om halveringstiden för protein är baserat på bulk biokemiska experiment, främst tidsförlopp western blot experiment vid hämning av proteinsyntesen av Kungliga Automobilklubben. Dock detta tillvägagångssätt ger inte enda cell resolution och dess temporal upplösning är låg på grund av det begränsade antalet tidpunkter som kan beaktas. Däremot vår encelliga strategi kräver inte användning av proteinhämmare syntes och kan identifiera cell till cell variabilitet i protein nedbrytningshastigheten. Det möjliggör också för att identifiera potentiella subpopulations av celler med olika halveringstider, vilket kan vara särskilt intressant för utredningen av heterogeneously uttryckta proteiner. En ytterligare fördel med vår metod är möjligheten att i silico synkronisera cellerna och därför övervaka övergående förändringar i half-life, till exempel hela cellcykeln. SNAPIN-tag tekniken kräver dock generering av en motsvarande SNAPIN-taggade cell fodrar, som kan vara dess stora nackdel. Allt kan vårt förhållningssätt också tillämpas på endogent märkta proteiner9. Som nämnts ovan vi inte iakttar någon bevisning av SNAPIN-taggen att ändra endogen protein halveringstiden för de proteiner som vi har studerat, tyder på att riktigheten av metoden SNAPIN-tag är i samma intervall som andra metoder.
Metoden presenteras här kommer att vara användbart för olika applikationer. Viktigast av allt, ger det möjlighet att studera cell-till-cell variabilitet i halveringstider för eventuella SNAPIN-tag fusionsprotein av intresse. Det finns flera andra taggar som är tillgängliga (t.ex. CLIP-tag23 eller Halo-tag24) vars Arbetsprincip är samma. Pulse märkning och tvättning av kvarvarande färgämnet kommer att leda till en decay kurva, vilket möjliggör att bestämma protein halveringstid, medan lämnar färgämnet i mediet (vid en ligand som är icke-fluorescerande såvida inte bunden till taggen) möjliggör långsiktiga avbildning av ett protein av intresse. På grund av det stora urvalet av tillgängliga fluorescerande ligander, kan SNAPIN-etiketten alltså kombineras med andra taggar eller med flera andra fluorescently märkta molekyler, möjliggör tillämpa tekniken i olika sammanhang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Time-lapse mikroskopi experimenten utfördes på den Biomolecular Screening Facility (BSF), EPFL. Vi tackar Marc Delachaux (Service Audiovisual, EPFL) för videography och redigering av filmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | - | - | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | - | - | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | - | - | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | - | |
| Microsoft Excel | Microsoft | - |
References
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).
- Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).
- Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).
- Bojkowska, K., et al. Measuring In Vivo Protein Half-Life. Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).
- Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells. Methods. 120, 65-75 (2017).
- Komatsu, T., et al. Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method. J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).
- Deluz, C., et al. A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation. Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).
- Varshavsky, A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis. Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).
- Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing. PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).
- Nagaoka, M., et al. E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation. PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).
- Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings. Methods. 85, 3-11 (2015).
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Comm. 8, (2017).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation. Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).
- Lin, Y., et al. Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells. Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).
- Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation. J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
