Summary
Denne protokol beskriver en metode til at bestemme protein halveringstider i enkelt levende vedhængende celler, ved hjælp af pulse mærkning og fluorescens time-lapse billeddannelse af SNAP-tag fusion proteiner.
Abstract
Proteiner er i en dynamisk tilstand af syntese og nedbrydning og deres halveringstider kan justeres under forskellige omstændigheder. Dog, mest almindeligt anvendte metoder til at bestemme protein half-life er enten begrænset til befolkningens gennemsnit fra mængden celler eller kræver brug af protein syntese hæmmere. Denne protokol beskriver en metode til at måle protein halveringstider i enkelt levende vedhængende celler, ved hjælp af SNAP-tag fusion proteiner i kombination med fluorescens time-lapse mikroskopi. Et protein af interesse sammenvoksede til et SNAP-tag kan kovalent bundet af en fluorescerende, celle gennemtrængelig farvestof, der er koblet til en benzylguanine derivat, og henfald af befolkningens mærket protein kan overvåges efter udvaskning af de resterende farvestof. Efterfølgende celle tracking og kvantificering af den integrerede fluorescens intensitet over tid resulterer i en eksponentiel henfald kurven for hvert registrerede celle, giver mulighed for fastsættelse af protein nedbrydningshastigheder i enkelt celler af kurven montering. Denne metode giver et skøn for heterogenitet af halv-liv i en population af dyrkede celler, som ikke kan nemt vurderes ved hjælp af andre metoder. Tilgang præsenteres her gælder for enhver type af kulturperler vedhængende celler, der udtrykker en protein af interesse sammenvoksede til et SNAP-tag. Her bruger vi mus embryonale stamceller (ES) celler dyrkes på E-cadherin-belagt celle kultur plader til at illustrere hvordan enkelt celle nedbrydningen satser af proteiner med en bred vifte af halve liv kan bestemmes.
Introduction
Det er velkendt, at cellulære proteiner undergår omfattende omsætning med syntese og nedbrydning satser er specifik for hver protein og fysiologiske reguleret. Traditionelt, har protein nedbrydning priser været målt ved hjælp af bulk metoder, såsom radioaktivt puls chase analyse, eller som vedrører protein syntese hæmmere såsom cycloheximide1. Mere nylig, stabile isotop mærkning med aminosyrer i cellekultur (SILAC) i kombination med massespektrometri er blevet etableret til at kvantificere protein omsætning på et globalt plan2. Men disse metoder er begrænset af befolkning i gennemsnit, og oplysninger om celle til celle variabilitet er derfor tabt. Derudover ikke kan forbigående ændringer i protein nedbrydning, der er usynkroniserede på tværs af cellen befolkningen identificeres.
Protein halveringstider kan alternativt også bestemmes ved fluorescens-baserede tilgange, hvilket ofte har fordelen at give én celle opløsning. For eksempel, er en photoactivatable grøn fluorescerende proteiner (paGFP) blevet brugt til at bestemme Oct4 halveringstid i den tidlige pattedyr embryo3. En anden metode til at overvåge protein forfald i levende celler er brugen af et SNAP-tag i kombination med fluorescens time-lapse billeddannelse. SNAP-tag er en mutant version af DNA reparation enzym O6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT), der specifikt reagerer med benzylguanine (BG) derivater, som kan være koblet til molekylære sonder4,5, 6. derfor et SNAP-tag fusion protein irreversibelt kan mærkes med et fluorescerende, celle gennemtrængelig farvestof. Puls mærkning af en protein af interesse smeltet til SNAP-tag, efterfulgt af udvaskning af de resterende farvestof, giver mulighed for overvågning af forringelsen af befolkningens mærket protein og dermed til bestemmelse af protein half-life. SNAP-tags held har været anvendt til pulse-chase mærkning af proteiner og til bestemmelse af protein halveringstider i tilhænger celle kultur og i vivo5,7,8,9. En lang række SNAP-tag substrater dækker anvendte fluorescerende spectra er kommercielt tilgængelige, gør det muligt for udvælgelsen af den optimale farve for hver specifik applikation. Således kan SNAP-tags også bruges til multicolor imaging i kombination med andre fluorescerende fusion proteiner eller farvestoffer. Celle-vandtætte farvestoffer er velegnet til mærkning af membran-bundet proteiner, der henviser til, at celle-gennemtrængelige farvestoffer er gældende for overvågning både intracellulære og membran-bundet proteiner. Desuden, nogle af disse sonder udviser næsten ingen basale fluorescens og kun starte udsender en stærk fluorescerende signal ved binding til et SNAP-tag10.
Denne protokol beskriver hvordan man kan måle nedbrydningshastigheder af forskellige proteiner af interesse for enkelte celler ved hjælp af et SNAP-tag. Vi anvender her denne metode til musen embryonale (ES) stamceller kulturperler på E-cadherin, men det bør være muligt at bruge det med enhver vedhængende kulturperler celletype. Vi viser at puls mærkning af SNAP-tag fusion proteiner efterfulgt af fluorescens time-lapse imaging giver mulighed for fastsættelse af enkelt celle halveringstider af forskellige proteiner af interesse og giver en skøn for celle til celle variabiliteten af halv-liv i en befolkningen i kulturperler celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: I denne undersøgelse, E14 ES cellelinie blev brugt. Denne protokol er dog gælder direkte for alle andre mus ES cellelinje at udtrykke et protein af interesse sammenvoksede til et SNAP-tag, enten ved at tagge det endogene protein eller ved hjælp af overekspression. For eksemplerne i afsnittet resultater, doxycyclin-inducerbar SNAP-tag fusion cellelinjer blev brugt (SNAP-tag smeltet til de følgende proteiner: Nanog, Oct4, Srsf11, eller at de fluorescerende proteiner mOrange2 og sfGFP og læg under kontrol af en Doxycyclin-inducerbar promotor. Se11 for yderligere oplysninger om plasmider anvendes for generation af doxycyclin-inducerbar SNAP-tag fusion cellelinjer). Doxycyclin-inducerbar systemet kan være særligt nyttigt, da det giver mulighed for tæt styring af timing og intensitet af udtryk af protein af interesse. C-terminale positionering af SNAP-tag anbefales, som ændrer N-terminalen aminosyresekvens er mere tilbøjelige til at ændre halveringstiden for target proteinet (N-ende regel12).
1. E-cadherin belægning og celle såning
- Generere en ES cellelinie udtrykker et protein af interesse smeltet til SNAP-tag4.
- Frakke 100 mm celle kultur retter med 4 mL af 0,1% gelatine (fortyndet i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) uden Ca2 +/Mg2 +) for 1 h. fjerne gelatine og lad tørre i 1 h. Brug straks eller gemme de coatede retter for op til 2 måneder.
- Vokse cellelinie af interesse i ES cellekulturmedium (Glasgow Minimum afgørende Medium, suppleret med 10% ES celle-kvalificeret føtal bovint serum, 2 mM natrium pyruvat, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 1% penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin, 100 µM 2- mercaptoethanol, leukæmi hæmmende faktor (LIF), 3 µM CHIR99021 og 0,8 µM PD184352) på gelatine-belagt retter på 37 ° C og 5% CO2 i 2 dage indtil nå et sammenløb af 10-20 Mio celler pr. fad.
Bemærk: Her, LIF blev produceret af forbigående Transfektion af HEK 293T celler, efterfulgt af supernatanten samling og filtrering. Hver batch af LIF blev testet for dets potentiale til at opretholde pluripotency, men koncentrationer blev ikke bestemt. Men rekombinant LIF er også kommercielt tilgængelige og den koncentration, der almindeligvis anvendes til mus ES cellekultur er 1000 enheder/mL13. - Coat en 96-brønd plade egnet til imaging med 30 µL af rekombinant musen E-cadherin Fc chimera protein (E-cad-Fc) pr. brønd (5 ng/µL, fortyndes i PBS med Ca2 +/Mg2 +. Brug stock koncentrationer af 100 ng/µL, opbevares ved-80 ° C). Undgå omfattende pipettering, som E-cad-Fc er meget skrøbelige. Der inkuberes ved 37 ° C i 1,5 time.
Bemærk: Afhængigt af mikroskopet, andre formater kan bruges. - Opsug E-cad-Fc, vaskes en gang med 100 µL af PBS med Ca2 +/Mg2 +og tilsæt 100 µL af pre varmede ES cellekulturmedium.
- Cellerne vaskes af interesse med 5 mL PBS uden Ca2 +/Mg2 +. Opsug og der tilsættes 2 mL Trypsin-EDTA 0,25%. Inkuber i 4 min ved 37 ° C. Der tilsættes 4 mL ES cellekulturmedium, resuspend og spin ned ved 1000 x g i 4 min. aspirat supernatanten og resuspenderes i 2 mL frisk ES cellekulturmedium.
Bemærk: PBS uden Ca2 +/Mg2 + bør anvendes til at vaske cellerne inden trypsinization for at fjerne Ca2 + -ioner, som er nødvendige for celle vedhæftning. I modsætning til E-cad-Fc fortynding og belægning (trin 1.4), skal du bruge PBS med Ca2 +/Mg2 +, siden vedhæftning af ES-celler til E-cad-Fc belagt retter er Ca2 +-afhængig af14. - Fortynd den resuspenderede celler 1:10 i 1 mL ES cellekulturmedium og antal, ved hjælp af en optælling kammer (belastning 10 µL til et kammer i 0,1 mm dybde).
- Frø 30.000 celler/cm2 i E-cad-Fc belagt imaging plade. Fyld op til 200 µL pr. brønd med ES cellekulturmedium. For doxycyclin-inducerbar cellelinjer, fremkalde med en passende dosis af doxycyclin (optimere dosis og timing af induktion på forhånd. Cellelinjer bruges her blev behandlet med 500 ng/mL doxycyclin 24 timer før imaging). Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 og fortsætte med puls mærkning og imaging 24 h efter celle såning.
2. puls, mærkning af SNAP-tag
Bemærk: For protein henfald eksperimenter er det afgørende at bruge en passende SNAP farvestof koncentration. Koncentrationen skal være høj nok til at give en lyse signal i begyndelsen af den time-lapse, som fluorescens vil falde over tid. Men ved hjælp af farvning af for høje koncentrationer kan forårsage resterende farvestof efterlades på mellemlang eller i cellerne selv efter vask. Gratis farvestoffet kunne efterfølgende bindes til nyligt producerede SNAP-tag molekyler i løbet af filmen, der vil forvride henfald kurve. Observerede fluorescens signal vil afhænge af egenskaberne af farvestoffet, cellelinie anvendes, samt udtryk niveauet af det tilsvarende protein. Derfor er det afgørende at optimere farvestof koncentrationen ved at teste forskellige fortyndinger, startende fra den fortynding foreslår levende celle billeddannelse af fabrikanten. For denne undersøgelse, blev en far-red fluorescerende substrat brugt. En optimal koncentration af 12 nM blev fastsat for doxycyclin-inducerbar overekspression cellelinjer.
- Fortynd SNAP farvestof til den passende koncentration i pre varmede ES cellekulturmedium. Bruge en pipette forsigtigt fjerne medium fra cellerne tidligere seedede i 96-brønd plade og tilsæt 50 µL fortyndede SNAP farvestof pr. brønd. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
- Opsug den fortyndet farvestof med en pipette og vask 3 x med 200 µL pre varmede PBS (uden Ca2 +/Mg2 +). Tilføje 200 µL af ES cellekulturmedium og Inkuber i 15 min. ved 37 ° C.
- Gentag de forrige vask trin to gange mere.
Bemærk: Omfattende vask er vigtigt for at fjerne enhver ubundne farvestof. Gentagen vask trin med PBS fjerne de resterende ekstracellulære farvestof i medium, 15 min inkubationer sikre robuste mærkning af SNAP-tag fusion proteiner inden start den billeddiagnostiske eksperiment. Imidlertid udføre trinene vask af blid pipettering og brug ikke en automatisk indsugningsventil, som cellerne seedede på E-cad-Fc har tendens til at løsne sig let. - Tilføje 200 µL af imaging medium. At reducere fluorescens baggrund, bruge phenol rød gratis medium (suppleret med 10% ES celle-kvalificeret føtal bovint serum, 2 mM natrium pyruvat, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 1% penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin, 100 µM 2-mercaptoethanol, LIF, 3 µM CHIR99021 og 0,8 µM PD184352).
3. time-lapse mikroskopi
- Bruge et mikroskop egnet til live imaging, giver mulighed for kontrolleret temperatur og CO2. Indstil temperaturen til 37 ° C og CO2 -5% forud for bruger og lad Blandingen henstår i 1-2 h.
- Pladen anbringes i mikroskop og finde steder egnet til billedbehandling. Vælg steder hvor cellerne er jævnt fordelt, men ikke for tæt, da dette vil lette analysen. Justere antallet af markerede steder til antallet af celler, der kræves til analyse. I denne undersøgelse, blev 3-5 steder pr. cellelinje optaget.
- Vælg målsætningen. Et 20 X mål er passende for størrelsen af ES-celler.
- Vælg belysningsstyrke indstillinger for de fluorescerende kanaler skal registreres. Justere laser power og eksponering ifølge intensiteten af fluorescens signal fra celler af interesse. Sørg for at opnå en stærk første signal, da den vil falde i løbet af filmen, men undgå laser beføjelser højere end 30% for at minimere fototoksicitet og photobleaching. For denne undersøgelse, en excitation filter 632/22 nm (bølgelængde/bandpass), emission filter af 679/34 nm (bølgelængde/bandpass), laser power 10% og eksponering tid af 100 ms blev brugt.
- Vælg imaging intervaller og varighed af time-lapse eksperimentet. Proteiner med forventede halv-liv 2-20 h, vælge erhvervelse gange af 12-24 timer med tidsintervaller af 15 min. For shorter-lived proteiner, reducere intervaller og erhvervelse gange, for teknologiinvesteringer proteiner stigning i overensstemmelse hermed.
- Start imaging.
4. billede behandling og analyse
- Indsamle de erhvervede billeder som en stak i tiff-format. For yderligere behandling og analyse, bruge FIJI software15. Hvis den time-lapse data ikke indsamles som en stak af mikroskop software, åbne alle rammer for time-lapse eksperimentet i software (enten ved at klikke på fil | Åbn... eller trække og slippe de tilsvarende filer på værktøjslinjen) og klik på billede | Stakke | Billeder til stakken.
- Brug funktionen Subtraher baggrund til at fjerne baggrunden fra alle billederne i stakken. For at gøre dette, skal du klikke på processen | Subtrahere baggrund. Vælg den rullende kugle radius i pop-up-vinduet. Bruge en radius, der er mindst på størrelse med celler afbildet. Hvis du vil anvende baggrunden subtraktion til alle celler i stakken, Vælg Ja i den proces stakken? pop op-vindue.
- Vælg en celle af interesse og tegne en region af interesse (ROI) omkring det ved hjælp af værktøjslinjen. For nukleare signaler, skal du bruge Oval udvalg ved første at klikke på den tilsvarende fane på værktøjslinjen og derefter klikke på kernen af interesse, og justere ovalt omkring det. Bruge freehand udvælgelse at nøje følge celle konturer for cytoplasmatisk signaler eller meget tætte områder. Undgå at medtage alt for store regioner i baggrunden, selvom det ikke er nødvendigt at følge celle konturer netop på grund af den efterfølgende subtraktion af alle baggrundspixel (trin 4.8-4.9).
- Tilføje region af interesse til ROI manager ved at klikke på analyser | Værktøjer | ROI manager | Tilføje, eller ved at trykke på T på tastaturet.
- Gå videre til den næste ramme ved at flytte fanen i vinduet stakken eller ved at trykke på Skift + < på tastaturet, så Gentag de tidligere handlinger. Følg celle af interesse i løbet af filmen og tilføje ROI på hver ramme til ROI manager. Gemme den endelige ROI indstille for hvert registrerede celle ved at klikke på flere | Gem... i ROI manager.
Bemærk: Efter celledelinger, spore både datterceller separat og opsummere deres integrerede støtteintensiteter efter baggrund subtraktion (Se trin 4.6-4.9) for at tage højde for protein fortynding under celledeling. Gemme ROI-sæt til begge datterceller. - Når cellen i interesse spores i hele filmen, skal du klikke på foranstaltning, for at opnå værdierne for den gennemsnitlige intensitet og området af ROIs. Kopiere de opnåede værdier til et elektronisk regnearksprogram og beregne den rå integreret intensiteten af cellen for hvert tidspunkt som følger:
hvor menercer den gennemsnitlige intensitet ogområdeCinden for den tilsvarende ROI. - Du skal vurdere den lokale baggrund, tilføje en ROI tæt på celle af interesse for hver tidsramme. Undgå at medtage eventuelle cellulære fluorescens signal. Bruge en cirkulær Investeringsafkast, der er omtrent på størrelse med en celle og flytte eller krympe det i overensstemmelse hermed, hvis det er nødvendigt, fx hvis naboceller interferere. Fortsæt som tidligere beskrevet med cellulære ROI for at opnå en baggrund ROI indstillet og kopiere de målte intensitetsværdier i regnearket.
- Du kan hente en baggrund-korrigeret værdi for integreret intensiteten af cellen, først beregne integreret intensiteten af baggrunden for hvert tidspunkt:
hvor menerBG er den gennemsnitlige intensitet baggrund signal og områdeC er området af ROI omkranser cellen. Brug ikke område af baggrunden ROI, medmindre begge områder har den samme størrelse. - Beregne den endelige baggrund-trækkes integreret intensiteten af cellen for hvert tidspunkt:
- For at normalisere enkelt celle henfald kurver, opdele intensitetsværdien af hvert tidspunkt af intensitetsværdien af det første tidspunkt.
Bemærk: Kurve montering (Se trin 4.11) kan enten udføres på hver enkelt celle eller på gennemsnittet i befolkningen. Der kræves en normalisering, hvis en population baseret gennemsnit beregnes for at undgå bias fra forskellige fluorescens intensiteter mellem celler. Normaliseringen sikrer således, at hver celle bidrager med samme vægt til den endelige forfald kurve. Derudover kan normalisering være nyttigt at visualisere enkelt celle henfalder uafhængigt af deres absolutte fluorescens intensitet (Se Tal 3A-3 C). Men hvis kun én celle halveringstider bestemmes og data er ikke gennemsnit, normalisering trin kan udelades og kurve montering direkte kan udføres på de rå data. - Bruge et kurve montering værktøj til vurdering af protein half-life. I denne undersøgelse, blev MATLAB kurven montering værktøjskasse 3.4.1 brugt, som er placeret af standard i sektionen Apps i MATLAB-brugergrænsefladen. Importere fluorescens-intensiteten og Tidsværdier fra den elektroniske regneark i MATLAB ved at klikke på fanen Importdata åbne kurven montering værktøjskasse og vælge de tidspunkter og fluorescens henfald data i X data og Y data tab. Vælg Custom ligning i kurven montering under fanen og Indtast ligningen for en eksponentiel henfald:
hvor f(v) er fluorescens-intensiteten på et givet tidspunkt, en indledende intensiteten og b henfaldet. I Passer indstillinger... under fanen, Vælg 0 for den nedre grænse for både a og b. De estimerede værdier for a og b vil derefter vises i resultatvinduet. Beregn halveringstiden som følger:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne protokol giver et skøn over celle til celle variabilitet i half-life for enhver given protein sammenvoksede til et SNAP-tag. Brugen af rekombinant E-cadherin-Fc til belægning af imaging plade giver mulighed for enkelt celle opløsning i ES-celler, som ellers vokser i kolonier. Enkelt celler kan spores særskilt under hele filmen ( figur 1A).
Bestemmelse af protein halveringstiden for hver enkelt celle, er det vigtigt at måle integrerede, baggrunden-trækkes SNAP-tag fluorescens signalet over tid ( figur 1B), med opsummering af de integrerede intensiteter af begge datterceller i tilfælde af divisioner. Dette resulterer i en eksponentiel henfald kurve for hver celle, hvorfra henfaldet og dermed halveringstiden kan udvindes af kurven montering ( figur 1 c). Vigtigere, hvis en gennemsnitlig henfald kurve er beregnet, skal enkelt celle spor være normaliseret til den første ramme til at sikre, at hver celle har samme vægt på gennemsnittet, trods den formodede forskel i oprindelige fluorescens intensitet mellem celler.
Passende farvestof koncentration afhænger af typen af farvestof og cellelinie anvendes, og skal dermed optimeres for hvert forsøg. For at illustrere dette, viser figur 2 forfald kurver i forskellige koncentrationer af far-red fluorescerende substrat anvendes til alle forsøg vist her, testet på et doxycyclin inducerbar SNAP-tag fusion cellelinje. En indledende farvestof koncentration af 3 µM blev udvalgt efter fabrikantens anvisninger og en seriel fortynding på 1:3 blev udført indtil nå en koncentration af 1.4 nM. De to højeste koncentrationer signalet ikke falde, mens den observerede henfald er eksponentiel for koncentrationer under 111 nM. En optimal koncentration af 12 nM af dye blev valgt til yderligere forsøg, da det sikres minimal beløb af resterende farvestof tilbage i mellemstore efter vask, men signalet var stadig lys nok til at observere klar forfald kurver for en bred vifte af doxycyclin inducerbar cellelinjer.
3A - 3C viser tal repræsentative resultater, herunder enkelt celle henfalder og befolkningens gennemsnit, for 3 proteiner med forskellige gennemsnitlige halveringstid: pluripotency forbundet transkriptionsfaktorer Nanog (gennemsnitlig half-life 2,9 h) og Oct4 (gennemsnit Half-Life: 4,8 h), og meget længere levede pre-mRNA behandling faktor Srsf11 (gennemsnitlig half-life 25.3 h). Boxplots ( figur 3D) repræsenterer halveringstider fremstillet af enkelt celle henfald kurver ved kurven montering og illustrere heterogenitet af halveringstider for de tre proteiner.
Figur 1 : Time-lapse erhvervelse og analyse
A: række repræsentative billeder viser henfaldet af fluorescens i celler puls mærket med SNAP farvestof. Cell line: doxycyclin inducerbar TRE3G-Oct4-SNAPtag, induceret med 500 ng/mL doxycyclin 7 h før billeddannelse.
B: film analyse og beregning af integrerede intensitet. Jegc: integreret intensiteten af cellen, jegBG: integreret intensiteten af baggrund, jegC-BG: baggrundskorrigeret integreret intensitet.
C: eksponentialkurve montering udføres i MATLAB. Eksempel på sporløst enkelt celle forfald, den tilsvarende pasform og de deraf følgende estimater for parametrene forfald en og b. Halveringstiden er beregnet som følger: t1/2 = ln (2) /b. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Optimering af farvestof koncentrationen.
Fluorescens henfald af celler puls mærket med forskellige koncentrationer af SNAP farvestof. En seriel fortynding af farvestoffet start fra 3 µM blev udført. Sporene er gennemsnit af 5 celler hver, normaliseret til den første frame og spores til 12 h. cellelinie: doxycyclin inducerbar TRE3G-sfGFP-mOrange2-SNAPtag-PEST, induceret med 500 ng/mL doxycyclin 24 timer før billeddannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Enkelt celle variation af halveringstider for forskellige SNAP-tagged kandidat proteiner.
A-C: Encellede henfalder (lyseblå) og befolkningens gennemsnit (mørkeblå) for doxycyclin inducerbar Nanog-, Oct4- og Srsf11-SNAP-tag fusion proteiner.
D: halveringstider for individuelle celler, som blev beregnet af eksponentialkurve montering for hver enkelt celle. Boxplots vises i log2 skala. Boksene vise de interkvartil vifte (IQR), den sorte linje angiver medianen. Knurhår repræsenterer de minimale og maksimale værdier, bortset fra outliers (sorte prikker), der defineres som værdierne afviger mere end 1,5 x fra IQR. N = 20 celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest afgørende skridt når benytter et SNAP-tag til at overvåge protein henfald er at sikre, at ingen resterende ubundne farvestof er tilbage på mellemlang eller i cellerne efter vask, som ellers det kan binde til nyligt producerede SNAP-tag molekyler senere i løbet af eksperimentet og ther Eby kompromis henfald kurve. Det er på den ene side opnået ved omhyggeligt udføre alle beskrevet vaske trin. På den anden side bør farvestof koncentration holdes så lavt som muligt, mens du stadig er i et område, der giver mulighed for at opnå et godt signal til støjforhold. Som vist i figur 2, skal farvestof koncentration være optimeret til hvert eksperiment ved at teste forskellige fortyndinger. I vores tilfælde har doxycyclin inducerbar cellelinjer relativt høje udtryk niveauer, således gør det muligt for at bruge en lav farvestof koncentration.
Denne protokol beskriver en generel tilgang for at kvantificere protein nedbrydning i enkelt celler af time-lapse fluorescens imaging og forskellige aspekter af protokollen kan ændres, afhængigt af de eksperimentelle betingelser og mål for det tilsvarende eksperiment. Protein nedbrydning følger for det meste en første ordre eksponentiel henfald. For protein er henfalder vist her, Rasmussen2 værdier af passer var forholdsvis høj (0,95-0,99) og ved hjælp af multi-eksponential ikke væsentligt forbedret passer. Dog, hvis de opnåede resultater fra enkelt eksponentiel passer ikke er tilfredsstillende, montering multi-eksponential kunne være overvejet, som indebærer eksistensen af flere mærket protein delpopulationer rådnende med forskellige satser. Desuden indebærer vores billede analyse pipeline betydelige manuelt arbejde, hvilket er kun mulig, hvis begrænset antal celler er analyseret. For højere antal celler, bør en mere automatiserede tilgang overvejes. Forskellige automatiske værktøjer er blevet udviklet i de seneste år, som gør det muligt for segmentering og tracking større antal celler16,17. Flytning af celler og hyppige celledelinger er imidlertid udfordrende og tilbøjelige til at forårsage segmentering fejl. Derudover når imaging protein henfalder, vil fluorescens signal falde over tid, at gøre udvælgelsen af en tærskel for segmentering endnu vanskeligere. Således skal sporingsværktøjer nøje testes før gennemføres for denne protokol, som segmentering fejl kan fordreje data betydeligt. Derudover kan en anden baggrund subtraktion metode betragtes, afhængigt af kvaliteten af de erhvervede billeder. Her bruger vi FIJIS rullende bold korrektion, som er egnet til jævnt oplyst billeder med temmelig tyndt seedede celler. Men især hvis billederne lider af ujævn belysning, mere specialiserede baggrund subtraktion metoder kan være anvendt18,19.
En begrænsning til vores tilgang er varigheden af de time-lapse optagelser, der kan analyseres. For relativt kortlivet proteiner er en erhvervelse tid på omkring 12 timer tilstrækkeligt. For teknologiinvesteringer proteiner, som for eksempel Srsf11, er udfører en kurve montering på et tidsinterval på 12 h muligt. Det er dog vigtigt at holde inde indre at de eksponentielle passer kan være mindre præcis for teknologiinvesteringer proteiner, som erhvervelse tid og billedbehandling intervallerne skal øges. Hvis hurtig cykel celler er ved at blive afbildet, vil længere erhvervelse gange komplicere analyse, på grund af det stigende antal datter celler der skal analyseres. Igen, i dette tilfælde en mere automatiseret analyse pipeline kan være nyttige. Når du bruger SNAP-tag fusion proteiner til at bestemme protein henfald satser, betragtes desuden muligheden for SNAP-tag at ændre halveringstiden for den endogene protein. I tilfælde af de cellelinjer, der er brugt her ser vi ingen beviser for sådanne virkninger, som de beslutsomme halveringstid af Oct4 og Nanog nøje matche publicerede værdier3,20,21,22. Yderligere udelukke en effekt af SNAP-tag på protein nedbrydning, især når ingen data på half-life er tilgængelige, ville en mulighed være at blokere proteinsyntesen ved cycloheximide og til at udføre western blotting på forskellige tidspunkter ved hjælp af en antistof anerkende den endogene protein, og direkte sammenligne henfald af SNAP-tagged kandidat protein med de ukodede endogene version.
De fleste tidligere offentliggjorte data på protein half-life er baseret på bulk biokemiske eksperimenter, hovedsagelig tidsforløb vestlige skamplet eksperimenter ved hæmning af proteinsyntese af cycloheximide. Men denne fremgangsmåde giver ikke enkelt celle opløsning og dens tidsmæssige opløsning er lav på grund af det begrænsede antal tidspunkter, der kan tages i betragtning. I modsætning hertil vores encellede tilgang kræver ikke brug af protein syntese hæmmere og kan identificere celle til celle variabilitet i protein nedbrydning priser. Det giver også mulighed for at identificere potentielle delpopulationer af celler med forskellige halveringstider, som kan være særligt interessant for undersøgelse af uensartet udtrykte proteiner. En yderligere fordel ved vores metode er mulighed for at i siliciummangan synkronisere cellerne og derfor overvåge forbigående ændringer i half-life, for eksempel gennem hele cellecyklus. SNAP-tag teknologi kræver imidlertid generation af en tilsvarende SNAP-markeret cellelinje, som kan være dens store ulempe. Vigtigere, kan vores tilgang også anvendes til endogent tagged proteiner9. Som nævnt ovenfor vi ikke overholder noget bevis på den SNAP-tag at ændre endogene protein halveringstiden for de proteiner, vi har studeret, antyder, at nøjagtigheden af SNAP-tag tilgang er i det samme område som andre metoder.
Metoden præsenteres her vil være nyttig for forskellige applikationer. Vigtigst af alt, giver det mulighed for at studere celle til celle variabilitet i halveringstider for et SNAP-tag fusion protein af interesse. Der er flere andre tags, der er tilgængelige (f.eks. klip-tag23 eller Halo-tag24) Hvis Funktionsprincip er den samme. Puls mærkning og vask af de resterende farvestof vil føre til et forfald kurve, som giver mulighed for fastsættelse af protein half-life, mens forlader farvestoffet i medium (i tilfælde af en ligand, der er ikke-fluorescerende medmindre bundet til tag) gør det muligt for langsigtet billeddannelse af et protein af interesse. På grund af det store udvalg af tilgængelige fluorescerende ligander, kan SNAP-tag således være kombineret med andre tags eller med flere andre fluorescently mærket molekyler, giver mulighed for at anvende teknikken i forskellige sammenhænge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Time-lapse mikroskopi eksperimenter blev udført på Biomolekylær Screening facilitet (BSF), EPFL. Vi takke Marc Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) for Videografi og redigering af filmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | - | - | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | - | - | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | - | - | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | - | |
| Microsoft Excel | Microsoft | - |
References
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).
- Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).
- Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).
- Bojkowska, K., et al.
- Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells. Methods. 120, 65-75 (2017).
- Komatsu, T., et al. Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method. J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).
- Deluz, C., et al. A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation. Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).
- Varshavsky, A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis. Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).
- Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing. PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).
- Nagaoka, M., et al. E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation. PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).
- Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings. Methods. 85, 3-11 (2015).
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Comm. 8, (2017).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation. Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).
- Lin, Y., et al. Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells. Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).
- Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation. J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
