Summary
재조합 프로토 타입 거품 바이러스 integrase 단백질은 종종 정화 동안 세균성 nuclease로 오염 됩니다. 이 메서드는 nuclease 오염을 식별 하 고 효소의 마지막 준비에서 그것을 제거 합니다.
Abstract
레트로 바이러스 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)의 integrase (IN) 단백질은 retroviral 통합의 메커니즘 연구 모델 효소 이다. 다른 레트로 바이러스에서에 비해, PFV에 더 많은 가용성과 실험적인 조작에 순종. 또한, 그것은 임상으로 관련 된 인간 면역 결핍 바이러스 (hiv-1)에 억제제, PFV에 촉매 메커니즘은 그의 HIV-1 인치에 catalyzes 바이러스 무료 DNA (cDNA) 대상의 공유 결합 비슷한 제안에 민감한 과정에서 DNA 가닥 전송을 이라고합니다. 이 물가 이동 반응 대상 DNA에 닉스를 소개합니다. 통합 반응 제품의 분석 nucleases 마찬가지로 DNA를 닉의 존재에 의해 혼동 될 수 있습니다. 세균성 nuclease 공동 재조합 PFV에 대장균 (대장균)에 표현 된 정화 표시 되었습니다. 여기 헤 파 린 친화성 크로마토그래피에 의해 오염 nuclease에서 PFV에 격리 하는 방법을 설명 합니다. 분수는 쉽게 supercoiled 플라스 미드와 agarose 젤 전기 이동 법 nuclease 오염에 대 한 상영 됩니다. PFV에 및 오염 nuclease nuclease 무료 준비 재조합 PFV에 통합의 대량 생 화 확 적인 또는 단일 분자 분석에 대 한 적합 한 허용 하는 헤 파 린 sepharose에 대 한 대체 선호도 표시 합니다.
Introduction
Dna 단백질 상호 작용의 생 화 학적 및 단일 분자 연구 매우 순수한 재조합 단백질을 필요로합니다. 박테리아에서 nucleases 오염 이러한 분석의 결과 모호한 수 있습니다. 오염 nuclease 재조합 단백질 산소 폐품 protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) 및 대장균 (대장균)1 에서 절연 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV) integrase (IN)의 준비에서 발견 되었습니다. , 2 , 3.
Retroviral 통합 분석 실험 활동4의 측정으로 긁어 또는 선형 제품 supercoiled DNA의 변환에 의존합니다. 세포 감염 동안에 호스트 chromatin5바이러스 성 cDNA의 두 끝에 합류 했다. 반응에 참여 하는 각 끝에는 스트랜드 전송 되 나 이다. 분석 실험 활동 두 DNA 올리고 참여 수 재조합에의 공동된 통합 반응4,,56,7,8에서 표적 DNA에 종료 바이러스 성 cDNA를 흉내 낸. 또는 재조합에 비 순수 관련 반 사이트 통합 반응9,10단 하나의 DNA 끝을 참여할 수 있습니다. Supercoiled 플라스 미드 DNA의 대상인 통합, 공동된 통합 제품은 오는지 DNA 고 반 사이트 통합 제품은 편안한 서클. 이러한 반응 제품 agarose 젤 전기 이동 법1동안 상대 그들의 이동성에 의해 식별 됩니다. 재조합에 오염 nuclease 있으면 가짜 편안한 원이나 실험 결과 혼란 가능성이 선형화 플라스 미드 있을 것입니다. 바이러스 성 DNA 올리고 nuclease 제품 반대로 통합 제품을 결정적으로 식별 하 붙일 표시 될 수 있습니다. 그러나,에서 크게 하시 더군요 supercoiled DNA 목표; 편안한 원 또는 오염 nuclease에 의해 선형 DNA supercoiled 플라스 미드의 손실 결과 및 해석 데이터11의 왜곡 수 있습니다. 따라서 세균 nucleases retroviral 준비에서에서 제거 하는 것이 필수적 이다.
PFV에 세균성 nuclease1에 비해 헤 파 린 sepharose에 대 한 다른 선호도 하고있다. PFV에 고는 nuclease 덤플링 sepharose에서 선형 그라데이션 차입에 의해 분리 될 수 있습니다. 280 nm 첨단 자외선 (UV) 흡 광도 또는 분석 나트륨 라우릴 황산 염의 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)는 nuclease 쉽게 감지 되지 않습니다. 대신,는 nuclease 편안한 원이나 선형 제품 supercoiled 플라스 미드의 전환 채용 nuclease 활동 분석 결과 의해 감지 됩니다. 헤 파 린 sepharose 크로마토그래피 다음 각 분수는 nuclease 활동에 대 한 테스트입니다. PFV에 nuclease 오염 물질 모노-Q 음이온 수 지에 대 한 선호도에 차이가 있다. 모노-S 양이온 수 지에 대 한 선호도에 작은 차이가 있다. 그러나, 세균성 nuclease 모노 S 해상도 PFV에 단백질의 효율적인 분리를 수 없습니다. 궁극적으로, 덤플링 sepharose 친 화력 정화 PFV에 세균성 nuclease의 최고의 분리를 제공 하 고 무제한 부하 볼륨의 이점이 있다.
오염 nuclease 활동에 대 한 테스트 다른 단백질을 적용할 수 있습니다. 관심사의 단백질 대체 선호도 특성 PFV에; 보다 가능성이 해야한다. 바인딩 관심과 nuclease 오염 물질의 단백질의 특성에 차이 실험적으로 결정 되어야 합니다. Nuclease 오염 식별이 방법론 모노-S 양이온 또는 모노-Q 음이온 교환 수 지를 포함 하 여 다른 수 지에 적용할 수 있습니다. 선호도 및 이온 교환 수 지는 크로마토그래피 중 단백질의 볼륨에 제한이 없는 nucleases 오염에서 재조합 단백질을 분리 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공할 수 있습니다.
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Protocol
1. 유도 PFV 대장균 에 식에서
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대장균 BL21(DE3) pLysS의 20 μ 1 μ PFV에 식 플라스 미드 (10 ng/μ)의 추가 (상업적으로 사용 가능한 셀의 20 μ 약 수는 > 2 x 106 CFU/μ g 플라스 미드) 1.5 mL 튜브에. 부드럽게 손가락 도청 또는 튜브를 터치 믹스. 품 어에 얼음 5 분.
- 정확히 30 충격 열 42 ˚C에 s 물 목욕 한 후 바로 2 분 동안 얼음을 반환할.
- Catabolite 억제 (SOC) 미디어 실 온 슈퍼 최적의 국물의 80 μ를 추가 합니다. 1 h 225 분당 회전 (rpm) 떨고와 37 ˚C에서 품 어.
- 접시는 100 m m x 15 m m Luria 국물 (파운드) agar의 25 mL를 포함 하는 배양 접시에 혼합물의 25 μ (1 L 파운드 agar: 10 g NaCl, 5 g 효 모 추출 물, bacto tryptone 10 g 15 g 천) 및 100 μ g/mL 암 피 실린 (100mg/mL 재고 솔루션).
- 두 번째 동일한 접시에 변환 된 셀의 나머지 75 μ 접시 37 ° c.에 하룻밤 내려 뚜껑 접시를 품 어
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검색의 판 변형 대장균. 단일 식민지를 사용 하 여 파운드의 3 mL 접종 (1 L 파운드: bacto tryptone, 10 g의 NaCl, 효 모 5 g의 10 g 추출) 14 mL 둥근 바닥 폴 리 프로필 렌 문화 관에서 100 μ g/mL 암 피 실린 보충. ~ 8 h 225 rpm 동요와 37 ˚C에서 품 어.
- 50 mL 파운드 100 μ g/mL 암 피 실린과 34 μ g/mL 페니 (34 mg/mL 재고 솔루션) 250 mL 삼각 플라스 크에에서 보충에 문화의 3 mL를 추가 합니다. 225 rpm 동요와 37 ° C에서 하룻밤 문화를 품 어.
- 1 L 파운드, 100 μ g/mL 암 피 실린, 그리고 4 L 삼각 플라스 크에 34 μ g/mL 페니를 이동 문화의 53 mL. 225 rpm 동요와 37 ° C에서 품 어.
- 600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) 정기적으로 문화. 처음에, 모든 h 문화 OD600 확인 하십시오. 문화는 원하는 OD600에 도달, 하지 자라 다를 15 분 마다 확인 합니다. 0.9와 1.0 사이 세600 문화를 성장. 얼음 목욕을 플라스 크를 전송 및 문화의 온도 줄이기 위해 소용돌이.
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SDS 페이지 분석을 변성 시키기에 의해 나중에 분석 1.5 mL 튜브에 문화의 1 mL를 전송.
- 실 온에서 14000 x g에서 microfuge에 1 분 동안 원심 분리에 의해 1.5 mL 튜브에 세포를 작은. 폐기는 상쾌한. Pipetting으로 150 μ 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 펠 릿을 resuspend. PBS 또는 CaCl2 , MgCl2없이 있을 수 있습니다.
- SDS 페이지 샘플 버퍼 x 2의 150 μ 추가 (150 m m Tris HCl, pH 6.8, 1.2 %SDS, 30% 글리세롤, 15% β-mercaptoethanol (βME), 블루 0.0018 %bromophenol) 피펫으로 또는 소용돌이 의해 철저 하 게 혼합. -20 ° c.에 3 분 저장소에 대 한 종 기
- 세균성 문화에 추가: 0.25 m m 이소프로필-베타-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0.25 M 재고 솔루션) 및 50 μ M ZnCl2 (50 m m 재고 솔루션)의 최종 농도. IPTG T7 발기인에서 PFV 유전자의 표정을 유도 및 ZnCl2 PFV 인치 품 즉시 4 헤 대 한 225 rpm에서 떨고와 25 ° C에서 문화에에서 아미노 터미널 아연 손가락 영역의 올바른 접는 보충 교재로 추가 됩니다. 얼음 목욕을 플라스 크를 전송. SDS 페이지 분석 1.3에서 위와 같이 동일한 프로토콜을 다음 위한 문화의 1 mL를 저장 합니다.
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적절 한 크기의 원심 병 세균성 문화를 전송 합니다. 예를 들어 1 L 문화 4 살 균 일회용 250 mL 원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 병을 양도할 수 있습니다. 4 ˚C에서 20 분 동안 3000 x g에서 냉장된 탁상 원심 분리기에 병을 회전 합니다. 붓는 의해 supernatants를 삭제 합니다.
- 25 mL (6.25 mL 병 당) 차가운 PBS (또는 CaCl2 및 MgCl2)의 총 볼륨 1 L 세균성 문화에서 알 약의 모든 pipetting으로 resuspend. 결합 하 고 한 50 mL 원뿔 튜브에 세균성 정지를 전송. 4 ° c.에 20 분 동안 3000 x g에서 냉장된 원심 분리기에서 회전 붓는 또는 pipetting는 상쾌한을 삭제 합니다.
- Pipetting으로 세균 펠 릿 10 mL 물의 resuspension 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 및 500 μ M phenylmethylsulfanoxide (PMSF) 프로 테아 제 억제 물)에서 resuspend. 스냅 잠수함 50 mL 튜브에 충분 한 액체 질소와 함께 Dewar 플라스 크에 튜브를 삽입 하 여 펠 릿을 동결. 조심 스럽게 액체 질소에서 튜브를 제거 하 고-80 ° c.에 저장
참고: 세균성 펠 릿-80 ° c.에 몇 달 동안 저장 될 수 있습니다. 우리는 2 년 동안-80 ° C 저장 다음 활성 단백질의 손실 없이 보았다. -
분석 사전 유도 후 유도 샘플 8.3 c m, 높이 7.3 c m 0.75 m m 두께 SDS 페이지 젤 1.5 mL 6 %polyacrylamide 레이어 스태킹와 (125 mM Tris HCl, pH 6.8, 6% 아크릴, 0.1 %SDS, 0.1% 염화 persulfate, 0.001 %TEMED) 3.5 mL 10% 레이어를 해결 polyacrylamide (375 mM Tris HCl, pH 8.8, 10% 아크릴, 0.1 %SDS, 0.1% 염화 persulfate, 0.001 %TEMED)12.
- 겹쳐 쌓이는 젤을 붓는 후 10 잘 빗을 삽입 합니다. 젤 생산은 때 페이지 장치를 조립 하 고 충분 한 SDS 페이지 실행 버퍼 (25mm Tris, 192 m m 글리신, 0.1 %SDS)를 추가 합니다.
- 각 샘플의 10 μ prestained 단백질 표준의 4 μ를 로드 합니다. 염료 앞 약 60 분, 젤의 하단에 도달할 때까지 16.5 V/cm에서 실행 합니다.
- 젤 접시를 분해 하 고 젤 플라스틱 욕조를 전송. Coomassie 화려한 블루 솔루션 (0.1 %Coomassie 화려한 블루 R-250, 40% 메탄올, 10% 아세트산) 아낌없이 젤 커버 하 고 주위 온도에서 20 분 동안 얼룩 얼룩을 추가 합니다.
- 붓는 의해 얼룩 솔루션을 제거 하 고 바꿀 솔루션 (40% 메탄올, 10% 아세트산) destain까지 밴드를 쉽게 볼 수 있습니다. 붓는 의해 destaining 솔루션을 제거 하 고 이온된 수를 바꿉니다. PFV에 후 유도 샘플에서 쉽게 식별 되어야 합니다. Hexahistidine 태그와 PFV에 47374 Da의 분자량.
- PFV에 표시 되지 않는 경우 변환 접시 중 하나에서 다른 식민지로 시작 하는 유도 반복 합니다.
2. 니켈 친화성 크로마토그래피
- 얼음에 대 한 세균 펠 릿 녹여
참고:이 중요 한 시간 (약 2-3 h) 소요 됩니다. 펠 릿은 셀 슬러리에 동 때 추가 500 μ M PMSF (100 m m 재고 솔루션)를 추가 합니다. - 계속 박테리아의 50 mL 튜브 얼음 슬러리. 30 대 30% 진폭에서 박테리아를 sonicate s (1 초, 1에서 s) 0.125 인치 직경 0.5 인치 직경 바이오 경적 sonicator는을 사용 하 여 1 L 문화에서 파생 된 펠 릿 당 테이퍼 microtip, 20 kHz의 주파수 및 400 w.의 최대 전력
- 차가운 ultracentrifuge 튜브에 셀 샘플을 전송. 폴 리 탄산염 병 어셈블리 (25 m m 직경, 89 m m 높이) 유형 60 Ti 고정된 각도 터와 호환을 사용 합니다. 동일한 중력 힘을 달성 하는 경우 대체 튜브와로 터를 사용할 수 있습니다. 4 ° c.에서 60 분에 대 한 회전 120000 x g 명백한 펠 렛 이어야 한다. 상쾌한 노란 색깔을 할 수 있습니다.
- 붓는 또는 찬 50 mL 원뿔 튜브에 pipetting는 상쾌한 전송. 참고 볼륨; 이 볼륨 스냅 동결 전에 사용 되는 물의 resuspension 버퍼의 볼륨 약 해야 합니다. 상쾌한 점성 경우에, 착 색 인쇄기 열을 방해할 수 있는 세균성 DNA에 의해 오염 될 수 있습니다. 이 경우에, 세균성 DNA를 펠 렛을 ultracentrifugation를 반복 합니다.
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500 mL를 준비 (50mm pH 7.5, 500 mM NaCl, Tris HCl 500 μ PMSF) 버퍼와 500ml 버퍼 B (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μ PMSF, 200mm 이미).
참고:이 프로토콜에서 계속 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템, 모든 버퍼 및 샘플 콜드 룸에 4 ° C에서.- 살 균 필터 완충기 A와 B 0.2 μ m 일회용 필터 단위. FPLC 시스템에 따라 씻고 펌프 A 펌프 B 버퍼 A와 버퍼 B, 각각. 전도도 및 UV 수치가 안정 될 때까지 시스템을 통해 흐름 10%와 90% 버퍼 A 버퍼 B. 최대 유량; 악기에 따라 달라 집니다. 5 mL/min 흐름 속도 사용 하 여 1.0 MPa의 최대 압력 제한.
- 준비는 110 m m, 5 m m 직경 FPLC 열 1.5 mL 니켈 충전 지 (최대 바인딩 용량 50 mg/mL, 최대 1 MPa의 압력). 열 정화 하기 전에 하루를 준비 하 고 4 ˚C에 저장 된 수 있습니다.
- FPLC 악기에 열을 연결 합니다. 0.5 MPa의 최대 압력 한계를 가진 90% 버퍼 A와 10% 버퍼 B (이미 20 m m) 0.5 mL/min의 유량의 20 mL와 함께 열 equilibrate 악기는 전도도 및 280에서 UV 흡 광도의 실시간으로 데이터를 수집 한다 nm (280). 전도도 및 UV 수치 안정화 해야 합니다. 이러한 수치 안정 하지, 계속 열 통해 흐름 버퍼 안정 될 때까지.
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0.5 MPa의 최대 압력 한계를 가진 0.15 mL/min 흐름 속도로 열을 단백질 샘플 (펠 릿 당 ~ 10 mL)를 로드 합니다. 흐름 속도 열 압력 정화에 걸쳐 동일 남아 있습니다. 50 mL 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다.
- 열을 씻어 20 mL 10%와 90% 버퍼 A와 B. 버퍼 수집 50 mL 튜브에서 세척. 선형 그라데이션 20 mL의 10% ~ 100% 버퍼 B (200 m m 이미 20 m m)와 단백질 elute
- 마지막으로, 5 mL 100% 버퍼 B (200 m m 이미) 열 세척. 수집에 그라데이션 하 고 마지막 세척 0.27 mL 분수.
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2 x SDS 페이지 샘플 버퍼의 15 μ 15 μ, 세척, 그리고 피크 A280 분수를 통해 흐름의 결합. 3 분에 대 한 샘플을 끓인 다.
- 두 개의 10 %SDS 페이지 젤 이전 단계에서 설명한 1.6 제외 하 고 15 잘 빗을 준비 합니다. 10 μ는 젤을 각 샘플의 prestained 단백질 표준의 4 μ를 로드 합니다. 실행 하 고 얼룩, 1.6 단계에서 설명한 대로 젤 분석.
- 육안 검사에 따라 거의 순수한 PFV에 포함 하도록 표시 되는 분수를 결합 한다. Pipetting, 일반적으로 8-10 mL를 볼륨을 측정 한다.
- 분 광 광도 계를 사용 하 여 결합 된 분수의 A280 을 측정 하 고 PFV에 단백질;의 총 금액을 계산 우리의 전형적인 수확량은 유도 문화 L 당 ~ 10 mg 이다. Hexahistidine 태그 PFV에 소멸 계수는 59360 c m-1 M-1.
- Hexahistidine 태그를 제거 하려면 PFV에 10 m m dithiothreitol (DTT, 1 M 재고 솔루션)와 0.1 m m EDTA, pH 8.0 (0.5 M 재고 솔루션)을 보충 한다. 4 ˚C에서 하룻밤 mg PFV 인치 품 당 인간의 이노 (HRV) 3 C protease의 15 μ g를 추가 합니다. 분열 47374 다에서 44394 다 PFV에 분자량을 감소 하 고 10 %SDS 페이지 분석 하 여 확인할 수 있습니다.
3. 헤 파 린 친화성 크로마토그래피
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250 mL 준비 버퍼 C (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 m m EDTA, 500 μ PMSF)와 250 mL 버퍼 D (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 m m DTT, 0.1 m m EDTA, 500 μ PMSF, M 1 M NaCl).
참고:이 프로토콜 FPLC 시스템, 버퍼, 그리고 샘플 보관 됩니다 4 ˚C에서 차가운 방에.- 살 균 필터 버퍼 C 그리고 D 0.2 μ m 일회용 필터 단위. FPLC 시스템에 따라 씻고 펌프 A 펌프 B C 버퍼와 버퍼 D, 각각. 전도도 및 UV 수치가 안정 될 때까지 시스템을 통해 흐름 버퍼 C 80%와 20% 버퍼 D. 최대 유량; 악기에 따라 달라 집니다. 우리는 정기적으로 5 mL/min의 유량을 사용 하 여 1.0 MPa의 최대 압력 제한.
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80 m m, 5 m m 직경 FPLC 열 덤플링 sepharose 수 지 (최대 바인딩 용량 소의 2.0 mg mL 당 antithrombin III 수 지; 최대 1.4 MPa의 압력)의 1 mL를 준비 합니다. 열을 정화 하기 전에 하루를 준비 하 고 4 ° c.에 저장 된 수 있습니다. FPLC 악기에 열을 연결 합니다.
- 1 MPa의 압력을 최대 제한 버퍼 C 80%와 20% 버퍼 D (200 m m NaCl) 0.5 mL/min의 유량의 20 mL와 함께 열 equilibrate 악기는 전도도 및 280에서 UV 흡 광도의 실시간으로 데이터를 수집 한다 nm (280). 전도도 및 UV 수치 안정화 해야 합니다. 이러한 수치 안정 하지, 계속 열 통해 흐름 버퍼 안정 될 때까지.
- 1.5 볼륨 버퍼 c.를 추가 하 여 200mm PFV에 샘플의 NaCl 농도 감소 예를 들어 10 mL PFV 인치를 버퍼 C의 15 mL를 추가 우리의 전체 볼륨은 일반적으로 25 mL.
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부하 최대 압력 0.5 mL/min 흐름 속도로 덤플링 sepharose 열에 희석된 PFV에 샘플 1.0 MPa를 제한 합니다. 흐름 속도 열 압력 정화에 걸쳐 동일 남아 있습니다. 50 mL 원뿔 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다.
- 워시 버퍼 C 80%와 20% 버퍼 D (200 m m NaCl), 20 mL로 열 워시 50 mL 원뿔 튜브에 수집. (200 m m 1 M NaCl) 30 mL 선형 그라디언트의 20% ~ 100% 버퍼 D 열 elute
- 워시 100% 버퍼 디의 5 mL와 열 수집 0.37 mL 분수에 그라데이션 하 고 마지막 세척 합니다.
- 분석 로드, 통해, 세척, 분수 8 %SDS 페이지 2.9에 설명 된 대로. 다음 hexahistidine 태그의 분열 하는 PFV에 44394 Da의 분자량 있으며 멸종 계수 hexahistidine 태그를 하지 않고 59360 c m-1 M-1 에 남아 있다. 4 ˚C에서 모든 분수 nuclease 분석 결과 완료 될 때까지 저장 합니다.
4. nuclease 분석 결과
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식별 덤플링 분수 및 50의 거의 순수한 PFV 인치 결합 3 μ를 포함 하도록 표시 되는 헤 파 린 sepharose 분수 3 kb의 ng supercoiled 플라스 미드 DNA에 반응 버퍼 (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 m NaCl, 5mm MgSO4, 4 μ M ZnCl2 m 10 mM DTT) 15 μ의 최종 볼륨. 없는 PFV 인치와 90 분 포함 부정적인 컨트롤에 대 한 37 ˚C에서 품 어
- 1 mg/mL 가수분해 K와 반응 (20 mg/mL 재고 솔루션) 및 0.5 %SDS 중지 (10% 주식 솔루션). 37 ° C에서 품 어 1 h. 샘플 나중에 분석-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
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1의 x TAE 버퍼 (40 m m 트리 아세테이트, 1 mM EDTA) 0.1 µ g/mL ethidium 평범한 사람 (10mg/mL 재고 솔루션)13에 볼륨 (w/v) agarose 당 1% 무게의 125 mL 젤을 준비 합니다. Agarose 솔루션을 녹여와 15 cm x 10 cm 젤 캐스팅 용지함에 붓는 다. 5 m m, 0.75 m m 두께 웰 스도 15 잘 빗을 삽입 합니다. 얇은 스 웰 스 1.5 m m 두께에 비해 더 나은 밴드 해상도 얻을. 허용 주위 온도에서 응고 하 젤.
- 1에서 젤 담가 0.1 µ g/mL ethidium 평범한 사람으로 x TAE. Nuclease 분석 결과 반응 염료 (50% 글리세롤, 0.15% 오렌지 G 염료) 로드 x 6의 3.5 μ를 추가 합니다. 전체 볼륨 젤을 로드 합니다. 정 전압, 1 시간 또는 오렌지 G 염료 전면 젤의 끝에 도달할 때까지 주위 온도에 (100) cm 당 10 볼트에서 젤을 실행 합니다.
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바로 형광 스캐너 ethidium 평범한 사람을 감지를 설정 agarose 젤 이미지. 선형 DNA 3 kb 크기 true로 실행 해야 합니다, supercoiled DNA 빠른 (~ 2 kb), 실행 해야 하 고 편안한 원형 DNA 느린 (~3.5 kb)를 실행 해야 합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여, 각 차선에 supercoiled, 선형, 그리고 편안한 원형 플라스 미드의 픽셀 볼륨을 계산 합니다. 이러한 세 가지 DNA 형태 "총 DNA"에 대 한 볼륨 값 및 선형 및 편안한 원형의 비율을 계산 하는 데 사용할 픽셀의 합계를 호출 합니다. 예를 들어 편안한 서클의 픽셀 볼륨 나눈 값입니다 그 차선에 있는 총 DNA 픽셀 값, 백분율을 결정 하는 100이이 숫자를 곱합니다. 분수 오염 nuclease 포함 하는 부정적인 컨트롤에 비해 선형이 고 편안한 서클의 더 높은 백분율을 표시 합니다.
- 헤 파 린 sepharose 분수 오염 nuclease 활동을 표시 하지 않는 결합. 6-8 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 투 석 튜브 50 mM Tris HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 μ M ZnCl2, 10 m m DTT, 20% 글리세롤의 1 리터에 하룻밤 4 ° C에서 10 mm dialyze.
- 투 석 배관에서 nuclease 무료 PFV에 샘플을 복구 합니다. A280 을 측정 하 고 최종 단백질 농도 계산. 약 수 및 액체 질소에서 동결. -80 ° c.에 aliquots 저장
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Representative Results
재조합 PFV에 종종 세균 nuclease1오염 됩니다. 생 화 확 적인 통합 분석 편안한 원 및 선형 제품 supercoiled 플라스 미드 DNA의 변환의 정량에 따라 달라 집니다. 오염 nuclease의 존재는이 분석 실험의 스 퓨 리 어스 정량으로 이어질 수 있습니다. Hexahistidine 태그와 표현의 PFV에 대장균 (그림 1)에서 유도 된 이며 니켈 친화성 크로마토그래피 (그림 2)에 의해 먼저 정화. 거의 순수한 PFV in 분수 결합 되 고 hexahistidine 태그는 효소에 의해 죽 습. 우리는 PFV에 및 오염 nuclease 덤플링을 sepharose 크로마토그래피 (그림 3)1에 대 한 다른 선호도 결정 했습니다. PFV에 분수 덤플링을 sepharose 크로마토그래피 다음 편안한 서클에 대 한 분석 결과를 supercoiled 플라스 미드 및 선형화 플라스 미드, nuclease 활동 (그림 4)의 제품으로 알을 품는. 이 분석 결과 (그림 5) nuclease 없이 단백질 분수의 식별 수 있습니다. 이 분수는 결합, dialyzed, 고 미래 실험을 위한 동결 될 수 있습니다.
그림 1: 대장균 에 있는 PFV의 유도 . (2 레인) 전에 문화에서 세포 및 PFV에, 47374 검사 샘플의 존재에 대 한 분석 (3 차선) 유도 후 10%로 구분 했다 SDS 페이지 Coomassie 화려한 파랑 스테인드. 레인 1, 분자량 마커 (kDa). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 니켈 친화성 크로마토그래피 분수. 수용 성 세균성 lysates 니켈 친화성 크로마토그래피에 의해 분리 되었다. Hexahistidine 태그와 PFV에 eluted 200mm 이미 20 m m의 선형 그라데이션으로. 분수 10%에서 평가 했다 SDS 페이지 Coomassie 화려한 파랑 스테인드. PFV에, 47374 다 예가 열 (부하), 로드 샘플에서 이지만 덜 통해 흐름에 명백한 또는 세척. 일반적으로 초기에 이미 그라데이션 elute 분수 25 kDa 이하로 일부 빠른 이동성 오염 물질 뿐만 아니라 75 kDa 근처 느린 이동성 오염 물질을 표시 됩니다. 이미의 높은 농도에서 아무 예가 오염 있으며 PFV에 상대적으로 순수한 것 같다. 이 예제에서는 분수 #33 # 84를 통해 결합 되었고 더 정화. 분자량 표식은 (kDa) 각 젤의 왼쪽에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : PFV에 헤 파 린 sepharose 크로마토그래피 1 . Hexahistidine 태그의 니켈 선호도 및 프로 테아 제 제거, 다음 PFV (44394 다)에 분류 한 헤 파 린 sepharose에 의해. 단백질은 eluted 200 m m에서 1 M NaCl 선형 그라디언트를. 심지어 분수 #12 #44 SDS 페이지 물 Coomassie 파란 8%에 의해 평가 되었다. 분자량 표식은 (kDa) 각 젤의 왼쪽에 있습니다. 이 분수는 nuclease 활동에 대 한 테스트 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 헤 파 린 sepharose 분수의 nuclease 분석 결과 1 . 각 덤플링을 sepharose 분수 supercoiled DNA 플라스 미드에 추가 되었습니다. 분수 숫자는 그림 3에 표시 된 그 상관. 부 화, 다음 nuclease 반응 deproteinated 그리고 1% agarose ethidium 평범한 사람으로 구분. 네거티브 컨트롤 없는 단백질 (대상만)와 야생 타입 PFV에 알려진 nuclease (PFV에 WT)의 자유의 이전 정화 플라스 미드 DNA를 포함 됩니다. 오염 nuclease 활동에 대 한 긍정적인 통제 오염 nuclease (PFV에 D128N)를가지고 하는 촉매로 비활성 PFV에 이전 정화 이다. DNA 크기 마커 kb에서 같습니다. Supercoiled 플라스 (SC), 선형 플라스 (L), 그리고 편안한 서클 (RC)이 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : Nuclease 분석 실험의 정량 1. Agarose 젤 스캔 했다 및 픽셀 값 supercoiled (SC), 선형 (L), 및 각 레인에 편안한 원 (RC) 밴드에 대 한 계량 했다. 분수 숫자 연결 그 그림 3과 4에 표시 된. 선형 및 편안한 서클의 백분율 픽셀 값과 표시 된 방정식을 사용 하 여 계산 했다. 예를 들어 픽셀 값 분수 # 12의 밴드는: 817636 supercoiled 플라스 미드, 50467 선형 플라스 미드 그리고 112052 편안한 서클. 분수 # 12에 대 한 총 DNA 픽셀 값은 980155,이 값의 합계입니다. 선형 DNA의 백분율은 50467 비율 100을 곱한 및 5.1% 인 총 DNA 값으로 나눈 값 이다. 편안한 서클의 백분율은 112052 100을 곱한 및 11.4% 인 총 DNA 값으로 나눈 값 이다. 선형 및 편안한 원 비율의 합계는 16.5%. 없는 단백질 (에서, 아래 그래프)와 부정적인 제어 플라스 미드 DNA 플라스 미드의이 준비 선형 또는 편안한 원으로 총 DNA의 4.4% 포함을 나타냅니다. 두 번째 부정적인 제어 야생 타입 PFV에 (WT) 선형 또는 편안한 원으로 총 DNA의 8.6%를 표시의 이전 정화 했다. 이 두 개의 차선 현재 혼자 기질과 PFV 인치 긁어 또는 선형화 플라스 미드의 배경 수준을 나타냅니다. 긍정적인 통제는 선형 및 편안한 원으로 총 DNA의 23%를 했다 촉매로 비활성 PFV에 (D128N)의 이전 정화 이다. 헤 파 린 sepharose 분수 #12 # 22를 통해 노출 하는 DNA 결과 > 선형 및 편안한 원으로 DNA의 10%. 이 예제에서는 분수 #24 #42 표시 < 선형 및 편안한 서클에 10% 변환. 이 분수와 dialyzed 결합 했다. Aliquots 냉동 고 나중에 사용-80 ° C에 저장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
DNA 복구 단백질, 단일 분자 현미경 검사 법 응용 프로그램, 또는 retroviral integrases 산소 청소부와 같은 DNA와 상호 작용 하는 재조합 단백질 오염 세균 nucleases2,3의 무료 되어야 합니다. 이러한 오염 물질은 동안에 대량 생물 또는 단일 분자 분석 실험 결과의 해석을 혼동 수 있습니다.
우리는 세균 nuclease 자주 공동 정화 PFV 인치와 발견 그러나, PFV에 세균성 nuclease 오염 물질1에서 쉽게 구별할 수 있는 덤플링 sepharose에 대 한 선호도 표시 합니다. PFV에 nuclease 무료의 준비에 열쇠 덤플링 sepharose에서 그라데이션 차입에 따라 각 분수에서 nuclease 활동의 주의 깊은 정량 이다. 그라데이션 충분히 얕은 nuclease 오염;에서 PFV에 별거를 허용 하 여야 합니다. 가파른 그라디언트 효율적인 분리와 호환 되지 않을 것 이다. 또한, 플라스 미드 DNA 기판 nuclease 분석 결과의 배경 줄이기 위해 편안한 서클의 낮은 백분율이 있어야 한다. 플라스 미드 DNA 기판 편안한 원의 높은 배경을, 플라스 미드 DNA의 새로운 정화를 수행 되어야 한다. Nuclease 활동 분석 결과 오염 nuclease 무시 해야 하는 분수의 존재를 보여준다.
경우에 따라 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 오염 nuclease2의 제거를 위한 효과적인 방법 수 있습니다. 이전 그룹 PFV에4의 정화 하는 동안 초 사용. 초 제한 부하 볼륨 있고 최종 단백질 농도 감소 하는 경향이 있다. 선호도 및 이온 교환 크로마토그래피를 주요 장점은 초 보다 훨씬 더 큰 볼륨을 로드 하는 기능
Nuclease 활동에 대 한 테스트 공동 세균성 nuclease와 정화는 다른 단백질에 적용할 수 있습니다. 여기 우리는 PFV에 식별 하 고 오염 nuclease 덤플링 sepharose 크로마토그래피에 의해 분리 될 수 있습니다. 우리는 이전 PFV에 모노 S 양이온 및 모노-Q 음이온 교환 크로마토그래피가 수이 지가이 단백질을 위해 부적 한 만드는 nuclease에 비슷한 프로 파일을가지고 나타났습니다. nuclease에 관하여 원하는 단백질의 선호도 특성에 따라 선호도 또는 이온 교환 수 지와 그라데이션 차입이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 관심사의 단백질에서 키 nuclease 오염 물질의 효과적인 제거를 수 지에 대 한 선호도에 차이가 있습니다. 각 분수 nuclease 활동에 대 한 분석 해야 합니다. 이 프로토콜의 크로마토그래피 수 지 공동 세균성 nucleases와 정화 모든 단백질에 직접 적용 수 있습니다 없습니다. 그러나,는 nuclease 관심과 nuclease 활동 시 금 분수의 단백질에서 분리 하는 친 화력 또는 이온 교환 수 지를 사용 하 여 전반적인 개념 광범위 하 게 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH AI099854 및 AI126742 키에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
References
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