Summary

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

Published: December 08, 2017
doi:

Summary

אב טיפוס רקומביננטי וירוס קצפית integrase חלבון נגוע לעיתים קרובות נוקלאז חיידקי במהלך טיהור. שיטה זו מזהה נוקלאז זיהום ומסירה אותו הכנת הסופי של האנזים.

Abstract

החלבון integrase (ב) של רטרווירוס אב טיפוס קצפית וירוס (PFV) הוא אנזים מודל לימוד המנגנון של retroviral אינטגרציה. בהשוואה ל- IN של רטרווירוסים אחרים, PFV IN הוא מסיס יותר נוטה יותר מניפולציה ניסויית. בנוסף, הוא רגיש מעכבי IN הרלוונטית קלינית וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1), רומז כי מנגנון PFV IN קטליטי דומה כי של HIV-1 ב- IN IN מזרז קוולנטיות בהצטרפות של נגיפי DNA משלימים (cDNA) למטרה DNA בתהליך שנקרא העברה strand. כזאתי העברה סטרנד מציג ניקס יעד ה-DNA. ניתוח של אינטגרציה התגובה מוצרים יכול להיות מבולבל על ידי הנוכחות של nucleases שניק באופן דומה ה-DNA. נוקלאז חיידקי הוכח לטהר במשותף עם רקומביננטי IN PFV לידי ביטוי Escherichia coli (e. coli). כאן אנו מתארים שיטה לבודד PFV ב מ נוקלאז משחיתה מאת הפארין כרומטוגרפיית זיקה. שברים מוקרנים בקלות עבור נוקלאז זיהום עם פלסמיד supercoiled, agarose בג’ל. ב PFV ו נוקלאז משחיתה את להציג הזיקות חלופי עבור sepharose הפארין ומאפשר נוקלאז ללא הכנת IN PFV רקומביננטי מתאים לניתוח ביוכימית או יחיד מולקולה בצובר של אינטגרציה.

Introduction

מחקרים ביוכימיים, רווק מולקולה של אינטראקציות חלבון עם ה-DNA דורשים חומרים טהור במיוחד. מזהם nucleases מחיידקים, ניתן להסתיר את התוצאות של מבחני אלה. נוקלאז מזהמים נמצא בתוך ההכנות של חומרים חמצן נבלות protocatechuate-3,4-dioxygenase (יהלומים), אב-טיפוס קצפית וירוס (PFV) integrase (ב) מבודד Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.

שילוב retroviral מבחני להסתמך על ההמרה של ה-DNA supercoiled עצור או ליניארי מוצרים כאמצעי של פעילות4. במהלך זיהום הסלולר ב מצטרף בשני קצותיו של cDNA ויראלי כרומטין מארח5. בכל קצה מצטרף התגובה נקרא העברה strand. מבחני של recombinant ב פעילות יכול להצטרף oligomers דנ א שני מחקה את cDNA ויראלי נגמר אל יעד ה-DNA אינטגרציה מתואמת תגובה4,5,6,7,8. לחלופין IN רקומביננטי עשוי להצטרף קצה דנ א אחד רק9,10תגובה אינטגרציה שאינה פיזיולוגית הרלוונטיים באתר חצי. כאשר הדנ א פלסמיד supercoiled היעד של אינטגרציה, אינטגרציה מתואמת המוצרים הם לליניארית דנ א, חצי אתר שילוב מוצרים עיגולים רגועה. מוצרים אלה התגובה מזוהים על ידי ניידות היחסי שלהם במהלך agarose ג’ל אלקטרופורזה1. אם IN רקומביננטי של נוקלאז מזהמים, יהיה כדין עיגולים רגועה או על פלסמיד ליניארית יכול להיות מבלבל את תוצאות הניסוי. נגיפי DNA oligomers עשוי להיות מסומן fluorescently באופן סופי לזהות מוצרים אינטגרציה, בניגוד נוקלאז מוצרים. עם זאת, ב מאוד טובות מטרות DNA supercoiled; אובדן של פלסמיד supercoiled עיגולים רגועה או DNA ליניארי על ידי מזהמים נוקלאז יכול להטות תוצאות ופרשנות של נתונים11. לכן יש הכרח להסיר את nucleases חיידקי retroviral בהכנות.

ב PFV יש זיקה שונה עבור sepharose הפארין בהשוואה של נוקלאז חיידקי1. ב PFV, את נוקלאז עשוי להיות מופרדים של • תנאי מעבר צבע ליניארי של הפארין sepharose. נוקלאז אינה מזוהה בקלות על-ידי של ספיגת אולטרה סגול (UV) בשיא 280 ננומטר או נתרן אנליטית dodecyl סולפט לזיהוי בג’ל (מרחביות-עמוד). במקום זאת, נוקלאז מאותרים על ידי assay פעילות נוקלאז העסקת את ההמרה של פלסמיד supercoiled עיגולים רגועה או מוצרים. כל שבר בעקבות הפארין sepharose כרומטוגרפיה נבדק נוקלאז פעילות. ב PFV את הזיהום נוקלאז יש הבדל אהדה עבור מונו-Q אניון שרף. יש הבדל קטן אהדה עבור מונו-S הקטיון שרף. עם זאת, הרזולוציה מונו-S של נוקלאז חיידקי ו PFV לא תאפשר הפרדה יעילה בין החלבונים. בסופו של דבר, הפארין sepharose זיקה טיהור מציע ההפרדה הטוב ביותר של נוקלאז חיידקי מ PFV IN ויש לו היתרון של נפח בלתי מוגבל.

בדיקה של מזהם נוקלאז פעילות עשוי להיות מותאם חלבונים אחרים. החלבון עניין סביר להניח יש זיקה חלופי מאפיינים מאשר ב PFV; ההבדל מחייבים המאפיינים של החלבון של עניין את הזיהום נוקלאז להיקבע מדעית. מתודולוגיה זו לזיהוי נוקלאז הזיהום עשוי להיות מותאם כדי אחרים שרפים כולל הקטיון מונו-S או מונו-Q אניון exchange שרפים. זיקה, יונים שרפים עשויים להציע שיטה אמינה כדי לבודד חלבון רקומביננטי עניין ובלחות nucleases ללא מגבלות באמצעי האחסון של חלבון במהלך כרומטוגרפיה.

Protocol

1. לגרום PFV בביטוי e. coli להוסיף 1 μL של PFV של הביטוי פלסמיד (10 ng/μL) 20 μL של e. coli BL21(DE3) pLysS (aliquot μL 20 תאים זמינים מסחרית יש > עונה 2 פרק 106 CFU/μg פלסמיד) צינור 1.5 מ ל. מערבבים בעדינות על ידי האצבע הקשה או להרים את השפופרת. דגירה על קרח 5 דקות. מחממים הלם עבור בדיו…

Representative Results

ב PFV רקומביננטי נגוע לעיתים קרובות עם חיידקי נוקלאז1. שילוב הביוכימי מבחני תלויים כימות תשובתו של פלסמיד supercoiled DNA עיגולים רגועה ומוצרים ליניארי. הנוכחות של נוקלאז מזהמים עלול להוביל כדין כימות של מבחני אלה. הביטוי של PFV IN עם תג hexahistidine המושרה ב e. coli (איור 1), ?…

Discussion

חומרים המקיימים אינטראקציה עם ה-DNA, כגון ה-DNA לתקן חלבונים, אוכלי נבלות חמצן עבור יישומים מיקרוסקופ מולקולה בודדת, או retroviral integrases, צריך להיות חופשי של זיהום חיידקי nucleases2,3. מזהמים אלה עשוי לבלבל את הפרשנות של תוצאות במהלך מבחני ביוכימית או יחיד מולקולה בצובר.</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH AI099854 ו- AI126742 למפתח.

Materials

BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

References

  1. Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
  12. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

Play Video

Cite This Article
Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

View Video