Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Détection et suppression de nucléase Contamination durant la Purification de l’intégrase du Virus spumeux Prototype Recombinant

Published: December 8, 2017 doi: 10.3791/56605
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

Protéine de l’intégrase spumavirus prototype recombinante est souvent contaminée par une nucléase bactérienne pendant la purification. Cette méthode identifie la contamination nucléase et le supprime de la préparation finale de l’enzyme.

Abstract

La protéine de l’intégrase (IN) du virus spumeux prototype rétrovirus (PFV) est une enzyme de modèle pour l’étude du mécanisme d’intégration rétrovirale. Par rapport à po d’autres rétrovirus, PFV IN est plus soluble et plus propices à la manipulation expérimentale. En outre, il est sensible aux inhibiteurs de IN cliniquement pertinente virus d’immunodéficience humaine (VIH-1), suggérant que le mécanisme catalytique de PFV IN est similaire à ce que de l’HIV-1 po en catalyse covalente par le rattachement de viral ADN complémentaire (ADNc) à target L’ADN dans un processus appelé transfert de brin. Cette réaction de transfert de brin introduit des entailles à l’ADN cible. Analyse des produits de réaction d’intégration peut être confondue par la présence de nucléases qui nick de même ADN. Une nucléase bactérienne a été établie conjointement purifier par recombinaison PFV IN exprimé chez Escherichia coli (e. coli). Nous décrivons ici une méthode pour isoler la PFV IN de la nucléase contaminante par chromatographie d’affinité de l’héparine. Fractions sont facilement contrôlées pour contamination nucléase avec un plasmide surenroulé et électrophorèse sur gel d’agarose. PFV IN et la nucléase contaminante affichage alternatives affinités pour l’héparine Sépharose permettant une préparation exempte de nucléase de recombinant PFV IN adapté à l’analyse biochimique ou simple molécule en vrac de l’intégration.

Introduction

Des études biochimiques et unique molécule d’interactions de protéine avec de l’ADN nécessitent exceptionnellement pures protéines recombinantes. Contaminer les nucléases de bactéries peut masquer les résultats de ces tests. Une nucléase contaminante a été trouvée dans les préparations de protéines recombinantes oxygène charognard protocatéchuate-3, 4-dioxygénase (PCD) et prototype virus spumeux (PFV) intégrase (IN) isolés de Escherichia coli (e.coli)1 , 2 , 3.

Tests d’intégration rétrovirale reposent sur la conversion de l’ADN surenroulé produits entaillées ou linéaires comme une mesure de l’activité4. Au cours de l’infection cellulaire IN a rejoint les deux extrémités d’un ADNc viral à l’hôte la chromatine5. Chaque extrémité joignant la réaction est appelée transfert de brin. Dosages des recombinants en activité peut-être se joindre deux oligomères d’ADN imitant l’ADNc viral se termine vers une cible ADN dans une intégration concertée réaction4,5,6,7,8. Alternativement IN recombinant peut-être adhérer à seule fin d’ADN dans un non-physiologiquement pertinents moitié site intégration réaction9,10. Lorsque l’ADN plasmidique surenroulé est la cible d’intégration, intégration concertée produits sont linéarisés ADN et demi produits d’intégration de site sont des cercles détendues. Ces produits de réaction sont identifiés par leur mobilité relative au cours de l’électrophorèse sur gel d’agarose1. Si la recombinée IN a une nucléase contaminante, il sera fausses cercles détendues ou un plasmide linéarisé éventuellement confondre les résultats expérimentaux. Oligomères d’ADN virales peuvent être étiquetés fluorescent pour identifier avec certitude les produits d’intégration, par opposition aux produits nucléase. Cependant, dans beaucoup favorise les cibles d’ADN surenroulés ; toute perte du plasmide surenroulé cercles détendues ou ADN linéaire par nucléase contaminante pourrait biaiser les résultats et interprétation de données11. Ainsi, il est impératif de retirer les nucléases bactériennes de rétroviraux dans des préparations.

PFV IN a une affinité différente pour héparine Sépharose par rapport à la nucléase bactérienne1. PFV IN et la nucléase peuvent être séparés par une élution gradient linéaire de l’héparine sepharose. La nucléase n’est pas facilement détectée par une absorbance de rayons ultraviolette (UV) à 280 nm crête ou sur gel de polyacrylamide d’analytique sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE). Au lieu de cela, la nucléase est détectée par un test d’activité nucléasique employant la conversion d’un plasmide surenroulé cercles détendues ou produits linéaires. Chaque fraction après chromatographie sur sepharose d’héparine est testée pour activité nucléasique. PFV IN et le contaminant nucléase n’ont aucune différence en affinité pour résine anionique Mono-Q. Il y a une petite différence en affinité pour la résine cationique Mono-S. Toutefois, la résolution de Mono-S de nucléase bactérienne et PFV IN n’autoriserait pas une séparation efficace des protéines. En fin de compte, purification d’affinité de l’héparine Sépharose offre la meilleure séparation des nucléases bactérienne de PFV IN et présente l’avantage de volume de charge illimitée.

Tests de contamination activité nucléasique peut être adapté à d’autres protéines. La protéine d’intérêt auront probablement des caractéristiques d’affinité alternatives à PFV IN ; la différence dans les caractéristiques de la protéine d’intérêt et le contaminant nucléase de liaison doit être déterminée empiriquement. Cette méthodologie permettant d’identifier la contamination nucléase peut être adaptée à d’autres résines, y compris des cations Mono-S ou résines échangeuses de Mono-Q anion. Résines d’affinité et échange d’ions peuvent offrir une méthode fiable pour isoler une protéine recombinante d’intérêt de contaminer les nucléases sans limite sur le volume des protéines au cours de la chromatographie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inciter PFV en Expression dans e. coli

  1. Ajouter 1 μL de plasmide d’expression IN PFV (10 ng/μL) à 20 μL d’e. coli BL21 (DE3) pLysS (20 μL partie aliquote de cellules disponibles dans le commerce a > 2 x 106 UFC/μg plasmide) dans un tube de 1,5 mL. Mélanger doucement à doigts tapotant ou effleurant le tube. Incuber en glace 5 min.
    1. Chauffer le choc pendant exactement 30 s dans un 42 ˚C bain d’eau et ensuite retourner immédiatement à la glace pendant 2 min.
    2. Ajouter 80 μL de bouillon super optimal de température ambiante avec les médias (SOC) la répression catabolique. Incuber pendant 1 heure à 37 ° c avec 225 tours par minute (tr/min) secouant.
    3. Plaque de 25 μl du mélange sur un 100 x 15 mm boîte de Pétri contenant 25 mL de gélose de bouillon (LB) de Luria (Gélose LB 1 L : 10 g bacto-tryptone, 10 g de NaCl, extrait de levure 5 g, 15 g de gélose) et 100 ampicilline μg/mL (100 mg/mL de solution).
    4. Plaque de la μL 75 restants des cellules transformées sur une seconde plaque identique. Incuber les boîtes avec des couvercles pendant toute la nuit à 37 ° C.
  2. Récupérer les plaques de transformé e. coli. Utiliser une seule colonie pour ensemencer 3 mL de LB (1 L LB : 10 g de bacto-tryptone, 10 g de NaCl, 5 g de levure extrait) complété avec de l’ampicilline 100 μg/mL dans un tube à culture en polypropylène fond rond 14 mL. Incuber pendant environ 8 h à 37 ° c sous agitation 225 t/mn.
    1. Ajouter les 3 mL de culture à 50 mL LB additionné de 100 μg/mL ampicilline et à la chloramphénicol (34 mg/mL de solution) de 34 µg/mL dans une fiole Erlenmeyer de 250 mL. Incuber la culture pendant une nuit à 37 ° C sous agitation 225 t/mn.
    2. Transférer le 53 mL de culture à LB 1 L, 100 μg/mL ampicilline et 34 chloramphénicol μg/mL dans une fiole d’Erlenmeyer de 4 L. Incuber à 37 ° C sous agitation 225 t/mn.
    3. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) de la culture périodiquement. Au départ, vérifiez la culture OD600 toutes les h. Lorsque la culture atteint le désiré de l’OD600, vérifier toutes les 15 min à ne pas proliférer. Cultiver la culture à une OD600 entre 0.9 et 1.0. Transférer le flacon dans un bain de glace et agiter pour réduire la température de la culture.
  3. Transférer 1 mL de la culture dans un tube de 1,5 mL pour une analyse ultérieure en dénaturant l’analyse SDS-PAGE.
    1. Les cellules dans le tube de 1,5 mL de granule par centrifugation pendant 1 min dans un microtube à 14 000 x g à la température ambiante. Jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans 150 solution saline tamponnée au phosphate de μL (PBS) par pipetage. Le PBS peuvent être avec ou sans CaCl2 et MgCl2.
    2. Ajouter 150 μL de 2 x tampon échantillon SDS-PAGE (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS de 1,2 %, 30 % de glycérol, 15 % de β-mercaptoéthanol (βME), bleu de bromophénol 0,0018 %) et bien mélanger en pipette ou vortex. Faire bouillir pendant 3 min. conserver à-20 ° C.
  4. Ajouter à la culture bactérienne : une concentration finale de 0,25 mM isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, solution mère de 0,25 M) et 50 μM ZnCl2 (solution mère 50 mM). IPTG induit l’expression du gène PFV IN du promoteur T7 et ZnCl2 est ajouté comme un supplément pour le repliement correct d’un domaine amino terminal zinc de doigt en PFV IN. Incubate la culture à 25 ° C sous agitation immédiatement à 225 t/mn pendant 4 h. transférer le flacon dans un bain de glace. Économisez 1 mL de culture pour l’analyse SDS-PAGE, suivant le même protocole que ci-dessus au point 1.3.
  5. Transférer la culture bactérienne à la centrifugeuse Fluxsol bouteilles. Par exemple, une culture 1 L peut être transférée à quatre bouteilles en polypropylène fond conique stérile jetable 250 mL. Faites tourner les bouteilles dans une centrifugeuse réfrigérée table à 3000 x g pendant 20 min à 4 ° c. Jeter les surnageants en versant.
    1. Tous les plombs d’une culture bactérienne 1 L dans un volume total de 25 mL (6,25 mL par flacon) PBS froid (avec ou sans CaCl2 et MgCl2) resuspendre de pipetage. Mélanger et transférer les suspensions bactériennes dans un tube conique de 50 mL. Tourner dans une centrifugeuse réfrigérée à 3 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant par coulée ou de pipetage.
  6. Resuspendre le culot bactérien dans 10 mL de tampon de resuspension (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl et inhibiteur de protéase de 500 μM phenylmethylsulfanoxide (PMSF)) par pipetage. Composant logiciel enfichable geler le culot en plaçant le tube dans une fiole de Dewar à l’azote liquide suffisante pour immerger le tube de 50 mL. Retirez délicatement le tube de l’azote liquide et conserver à-80 ° C.
    Remarque : Granulés bactériennes peuvent être conservés pendant plusieurs mois à-80 ° C. Nous n’avons vu aucune perte de protéine active après stockage de-80 ° C pendant deux ans.
  7. Analyse des échantillons induction avant et après induction par 8,3 cm de largeur, 7,3 cm de hauteur et 0,75 mm épais SDS-PAGE gelées avec polyacrylamide de 6 % de 1,5 mL empilant couche (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 6 % d’acrylamide, SDS 0,1 %, 0,1 % persulfate d’ammonium, 0,001 % TEMED) et 3,5 mL 10 % polyacrylamide résoudre la couche (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 % d’acrylamide, SDS 0,1 %, 0,1 % persulfate d’ammonium, 0,001 % TEMED)12.
    1. Après avoir versé le gel de concentration, insérez un peigne bien 10. Lorsque le gel a polymérisé, assembler l’appareil PAGE et ajoutez suffisamment tampon en cours d’exécution de SDS-PAGE (25 mM Tris, glycine 192 mM, SDS 0,1 %).
    2. Charger 10 μL de chaque échantillon et 4 μL de normes marqueur protéique. Courir à 16,5 V/cm jusqu'à ce que le front de colorant atteigne le bas du gel, environ 60 min.
    3. Démonter les plaques de gel et transférer le gel dans une cuve en plastique. Ajouter le bleu de Coomassie brillant bleu coloration solution (0,1 % de bleu de Coomassie brillant bleu R-250, méthanol 40 %, 10 % d’acide acétique) à couvrir le gel généreusement et des taches pendant 20 min à température ambiante.
    4. Retirer la solution colorante en versant et remplacer par décolorer la solution (40 % de méthanol, acide acétique 10 %) jusqu'à ce que les bandes soient bien visibles. Enlever la solution de décoloration en versant et remplacer par l’eau désionisée. PFV IN doit être facilement identifiée dans l’échantillon après induction. PFV IN avec une balise de protéine a un poids moléculaire de 47374 Da.
    5. Si PFV IN n’est pas visible, répétez l’induction commençant par une colonie différente parmi les plaques de transformation.

2. chromatographie d’affinité nickel

  1. Décongeler un pellet bactérienne sur la glace.
    Remarque : Cela va prendre beaucoup de temps (environ 2-3 h). Lorsque le culot est dégelé à une suspension de cellules, ajouter une supplémentaire de 500 μM PMSF (solution mère de 100 mM).
  2. Maintenir le tube de 50 mL de bactéries lisier sur la glace. Soniquer la bactérie à amplitude de 30 % pendant 30 s (1 s, 1 s éteint) par granulés provenant de culture de 1 L en utilisant un sonicateur avec une corne de bio 0,5 pouces de diamètre avec un diamètre de 0,125 coniques microtip, une fréquence de 20 kHz et une puissance maximale de 400 w.
  3. Transférer l’échantillon de cellules dans un tube froid ultracentrifugeuse. Utiliser des assemblys bouteille en polycarbonate (diamètre 25 mm, hauteur de 89 mm) compatibles avec un rotor à angle fixe Type 60 Ti. Rotors et tubes de rechange peuvent être utilisés si la même force de gravitation est obtenue. Essorage 120 000 x g pendant 60 min à 4 ° C. Il devrait y avoir un pellet évidente. Le surnageant peut avoir une couleur jaune.
  4. Transférer le surnageant par coulée ou de pipetage dans un tube conique froid 50 mL. Noter le volume ; ce volume devrait être approximativement le volume de tampon de resuspension utilisé avant snap gel. Si le surnageant est visqueux, il peut être contaminé par ADN bactérien qui risqueraient de boucher la colonne de chromatographie. Dans ce cas, répétez l’ultracentrifugation pour granulés de l’ADN bactérien.
  5. Préparer 500 mL tampon un (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) et 500 mL tampon B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, imidazole de 200 mM).
    Remarque : Dans ce protocole, garder le système de chromatographie en phase liquide (FPLC) protéine rapide, tous les tampons et l’échantillon à 4 ° C dans une chambre froide.
    1. Tampons de filtre stérile A et B avec 0,2 μm unité de filtre jetable. Selon le système des FPLC, laver pompe A et pompe B avec tampons A et B de la mémoire tampon, respectivement. Flux de 10 % et 90 % A de la mémoire tampon tampon B à travers le système jusqu'à ce que la conductivité et les lectures UV stabilisent. Le débit maximal dépendra de l’instrument ; utiliser un débit de 5 mL/min avec une limite de pression maximale de 1,0 MPa.
  6. Préparer une colonne longue, de FPLC diamètre de 110 mm de 5 mm avec 1,5 mL de résine chargée nickel (capacité de couplage maximale 1 MPa de pression de 50 mg/mL, maximum). La colonne peut être préparée la veille de la purification et stockée à 4 ° c.
  7. Connecter la colonne à l’instrument des FPLC. Equilibrer la colonne avec 20 mL de 90 % A de la mémoire tampon et 10 % tampon B (imidazole de 20 mM) à un débit de 0,5 mL/min, avec une limite de pression maximale de 0,5 MPa. L’instrument devrait être la collecte de données en temps réel de la conductivité et l’absorbance UV à 280 nm (un280). La conductivité et les lectures UV devraient se stabiliser. Si ces lectures ne sont pas stabilisés, continuer de tampons de flux à travers la colonne jusqu'à ce qu’ils sont stables.
  8. Charger l’échantillon de protéines (environ 10 mL / pellet) à la colonne à un débit de 0,15 mL/min, avec une limite de pression maximale de 0,5 MPa. La pression de taux et de la colonne débit reste le même tout au long de la purification. Recueillir le débit à travers un tube de 50 mL.
    1. Laver la colonne avec 20 mL 10 % et 90 % A de la mémoire tampon tampon B. percevoir le lavage dans un tube de 50 mL. Éluer les protéines avec un dégradé linéaire de 20 mL de 10 % à 100 % tampon B (20 mM à imidazole de 200 mM).
    2. Enfin, laver la colonne avec 5 mL 100 % tampon B (imidazole 200 mM). Recueillir le dégradé et dernier lavage en fractions de 0,27 mL.
  9. Mélanger 15 μL de tampon de 2 x SDS-PAGE avec 15 μl de l’écoulement à travers, le lavage et pointe A280 fractions. Faire bouillir les échantillons pendant 3 min.
    1. Préparer deux 10 % gels de SDS-PAGE, comme indiqué précédemment au point 1.6 sauf avec 15 peignes bien. Charger 10 μL de chaque échantillon pour les gels et 4 μL de normes marqueur protéique. Exécuter, souiller et analyser les gels comme indiqué au point 1.6.
    2. Combiner les fractions qui semblent contenir presque pur PFV IN basé sur une inspection visuelle. Mesurer le volume de pipetage, généralement de 8 à 10 mL.
    3. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer l’A280 des fractions combinées et calculer la quantité totale de PFV en protéines ; notre rendement typique est de ~ 10 mg / L de culture induite. Le coefficient d’extinction de PFV dans avec la balise de protéine est 59360 cm-1 M-1.
  10. Pour supprimer la balise de protéine, compléter la PFV IN avec 10 mM le dithiothréitol (DTT, la solution mère de 1 M) et 0,1 mM EDTA, pH 8,0 (solution mère de 0,5 M). Ajouter 15 μg de protéase 3C humaine rhinovirus (HRV) par mg PFV IN. Incubate à 4 ° c durant la nuit. Le clivage réduit le poids moléculaire de PFV IN de 47374 Da à Da 44394 et peut être vérifié par l’analyse SDS-PAGE 10 %.

3. chromatographie d’affinité de l’héparine

  1. Préparer 250 mL tampon C (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF) et 250 mL de tampon D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
    Remarque : Dans ce protocole, le système FPLC, tampons et échantillons sont conservés dans une chambre froide à 4 ° c.
    1. Filtres stériles tampons C et D avec 0,2 μm unité de filtre jetable. Selon le système des FPLC, laver pompe A et pompe B avec tampon C et D de la mémoire tampon, respectivement. Débit 80 % C tampon et 20 % tampon D à travers le système jusqu'à ce que la conductivité et les lectures UV se stabilisent. Le débit maximal dépendra de l’instrument ; Nous utilisons systématiquement un débit de 5 mL/min avec une limite de pression maximale de 1,0 MPa.
  2. Préparer une colonne longue, de FPLC diamètre de 80 mm de 5 mm avec 1 mL de résine de Sépharose héparine (maximum capacité de liaison 2,0 mg de bovins antithrombine III / mL résine ; 1,4 MPa de pression maximale). La colonne peut être préparée la veille de la purification et stockée à 4 ° C. Connecter la colonne à l’instrument des FPLC.
    1. Equilibrer la colonne avec 20 mL de 80 C tampon et 20 % tampon D (200 mM NaCl) à un débit de 0,5 mL/min, avec une limite de pression maximale 1 MPa. L’instrument devrait être la collecte de données en temps réel de la conductivité et l’absorbance UV à 280 nm (un280). La conductivité et les lectures UV devraient se stabiliser. Si ces lectures ne sont pas stabilisés, continuer de tampons de flux à travers la colonne jusqu'à ce qu’ils sont stables.
  3. Réduire la concentration de NaCl de la PFV dans un échantillon de 200 mM en ajoutant 1,5 volumes tampon C. Par exemple, ajouter 15 mL de tampon C po PFV 10 mL Notre volume total est généralement environ 25 mL.
  4. Limite de charge le dilué PFV dans un échantillon à la colonne de Sépharose héparine à 0,5 mL/min de débit avec une pression maximale 1,0 MPa. La pression de taux et de la colonne débit reste le même tout au long de la purification. Recueillir le débit à travers dans un tube conique de 50 mL.
    1. Laver la colonne avec 20 mL de 80 C tampon et 20 % tampon D (200 mM NaCl), recueillant le lavage dans un tube conique de 50 mL. Éluer la colonne avec un dégradé linéaire de 30 mL de 20 % à 100 % tampon D (200 mM à 1 M NaCl).
    2. Laver la colonne avec 5 mL de 100 % tampon D. collecter le gradient et lavage final dans les fractions de 0,37 mL.
  5. Analyser la charge, le flux à travers, lavage et fractions de 8 % SDS-PAGE, comme décrit dans 2,9. PFV en suivant un clivage de la protéine balise a un poids moléculaire de 44394 Da et le coefficient d’extinction reste 59360 cm-1 M-1 sans l’étiquette de la protéine. Stockez toutes les fractions à 4 ° c jusqu'à la fin d’un test de nucléase.

4. dosage de la nucléase

  1. Identifier les fractions de Sépharose héparine qui semblent contenir presque pur PFV po combiner 3 μL de la fraction de l’héparine et 50 ng de 3KO ADN surenroulé plasmide dans la réaction de la mémoire tampon (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM TNT) avec un volume final de 15 μL. Incuber à 37 ° c pendant 90 min. inclure un contrôle négatif avec aucun PFV IN.
    1. Arrêter la réaction avec la protéinase K de la 1 mg/mL (20 mg/mL de solution) et le SDS de 0,5 % (solution mère à 10 %). Incuber à 37 ° C pendant 1 h. échantillons peuvent être conservés à-20 ° C pour une analyse ultérieure.
  2. Préparer un gel 125 mL de 1 % en poids par volume (p/v) d’agarose dans 1 x TAE tampon (40 mM Tris-acétate, EDTA 1 mM) avec 0,1 µg/mL d’éthidium bromure (10 mg/mL de solution)13. Faire fondre la solution d’agarose et verser sur un plateau de coulage de gel 15 x 10 cm. Insérer un peigne bien 15 avec large, puits d’épaisseur de 0,75 mm mm 5. Puits de minces donnent meilleure résolution de bande par rapport aux puits épaisseur 1,5 mm. Laisser le gel à se solidifier à température ambiante.
    1. Immerger le gel dans 1 x TAE 0,1 µg/mL au bromure d’éthidium. Ajouter 3,5 μL de 6 x chargement colorant (50 % de glycérol, colorant Orange G 0,15 %) dans les réactions de dosage nucléase. Charger la totalité du volume au gel. Exécutez le gel à tension constante, 10 volts / cm (100 V) à température ambiante pendant 1 heure ou jusqu'à ce que le front de colorant Orange G arrive à la fin du gel.
  3. Immédiatement le gel d’agarose d’images avec un scanner fluorescent défini pour détecter le bromure d’éthidium. ADN linéaire doit tourner fidèle à taille 3 Ko, ADN surenroulé doit s’exécuter plus rapidement (~ 2 Ko) et détendue cercle ADN doit s’exécuter plus lentement (~3.5 Ko).
    1. À l’aide de logiciels d’analyse image, calculer le volume de pixel du plasmide cercle surenroulé, linéaire et détendue dans chaque ruelle. Appelez la somme du pixel volumes pour ces trois formes de l’ADN l’ADN « total » valeur et l’utilisent pour calculer le pourcentage de milieux linéaires et détendues. Par exemple, le volume de pixel des cercles détendues est divisé par la valeur de pixel ADN totale dans cette voie, multipliez ce nombre par 100 pour déterminer un pourcentage. Les fractions qui contiennent la nucléase contaminante affichent un pourcentage plus élevé des cercles linéaires et détendus par rapport au témoin négatif.
  4. Combiner des fractions de Sépharose héparine qui n’affichent pas d’activité nucléasique contaminante. Dialyser dans 10 mm 6-8 kDa poids moléculaire coupure (MWCO) tube à dialyse à 4 ° C durant la nuit, contre 1 L de 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20 % de glycérol.
  5. Récupérer l’échantillon PFV en exempte de nucléase de tube à dialyse. Mesurer l’A280 et calculer la concentration de la protéine finale. Aliquote et snap congélation dans l’azote liquide. Stocker les aliquotes à-80 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Recombinant PFV en est souvent contaminée par une nucléase bactérienne1. Analyses biochimiques intégration dépendent de la quantification de la conversion de l’ADN de plasmide surenroulé cercles détendues et produits linéaires. La présence d’une nucléase contaminante pourrait conduire au dosage fallacieux de ces tests. Expression de PFV po avec une étiquette de protéine est induite chez e. coli (Figure 1) et d’abord purifiée par chromatographie d’affinité de nickel (Figure 2). Les fractions avec presque pur PFV IN sont combinées et la balise de protéine est clivée par une protéase. Nous avons déterminé que la PFV IN et la nucléase contaminante ont des affinités différentes pour l’héparine Sépharose chromatographie (Figure 3)1. Fractions de PFV IN après chromatographie sur sepharose d’héparine sont incubées avec un plasmide surenroulé analyser pour cercles détendues et plasmide linéarisé, les produits de l’activité nucléasique (Figure 4). Ce test permet l’identification des fractions de protéines sans la nucléase (Figure 5). Ces fractions peuvent être combinées, dialysées et congelées pour de futures expériences.

Figure 1
Figure 1 : Induction de PFV dans chez e. coli . Les cellules provenant de cultures avant (piste 2) et après induction (piste 3) sont analysés pour la présence de PFV IN, 47374 da. échantillons ont été séparés par 10 % SDS-PAGE et colorées au bleu de Coomassie brillant bleu. Lane 1, marqueurs de poids moléculaire (kDa). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Fractions de chromatographie d’affinité de nickel. Les lysats bactériens solubles ont été séparés par chromatographie d’affinité de nickel. PFV IN avec une balise de protéine est éluée avec un dégradé linéaire de 20 mM à imidazole de 200 mM. Fractions ont été évaluées par 10 % SDS-PAGE et colorées au bleu de Coomassie brillant bleu. PFV IN, 47374 Da, est évidente dans l’échantillon chargé à la colonne (charge), mais est moins apparent dans le flux à travers ou en lavant. Fractions qui éluer couramment au début de la pente de l’imidazole affichent un contaminant de mobilité plus lent près de 75 kDa ainsi que certains contaminants plus rapides de la mobilité égale ou inférieure à 25 kDa. Des concentrations plus élevées de l’imidazole, il n’y a aucun contaminant apparent et PFV IN semble être relativement pur. Dans cet exemple, les fractions #33 par #84 ont été combinées et purifiées. Marqueurs de poids moléculaire (kDa) sont sur la gauche de chaque gel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Chromatographie Sépharose héparine de PFV dans 1 . Après le retrait du nickel affinité et de la protéase de la balise de protéine, PFV (44394 da) a été fractionné par héparine Sépharose. Les protéines sont élués avec un dégradé linéaire de 200 mM à 1 M NaCl. Fractions de même #12 et #44 ont été évaluées par 8 % SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie bleu. Marqueurs de poids moléculaire (kDa) sont sur la gauche de chaque gel. Ces fractions ont été testées pour l’activité nucléasique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Dosage de la nucléase de fractions de Sépharose héparine 1 . Chaque fraction de Sépharose héparine a été ajoutée à supercoiled ADN de plasmide. Numéros de fraction sont corrélés à ceux illustré à la Figure 3. Après incubation, les réactions de la nucléase ont été deproteinated et séparant par 1 % d’agarose au bromure d’éthidium. Contrôles négatifs comprennent l’ADN plasmidique avec aucune protéine (cible seulement) et une purification précédente de type sauvage en PFV réputée indemne de nucléases (PFV IN WT). Un contrôle positif pour contaminer l’activité nucléasique est une purification précédente de catalytiquement inactif dans PFV qui est connu pour avoir la nucléase contaminante (PFV IN D128N). Marqueurs de taille d’ADN apparaissent en Ko. Surenroulé plasmide (SC), plasmide linéaire (L) et des cercles détendues (RC) sont indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Quantification de la nucléase 1. d’Agarose gels ont été scannés et les valeurs de pixel ont été quantifiées pour surenroulé (SC), linéaire (L) et cercle détendue (RC) bandes sur chaque voie. Numéros de fraction sont corrélés à ceux indiqué aux Figures 3 et 4. Les pourcentages des cercles linéaires et détendus ont été calculées en utilisant les valeurs de pixel et l’équation montré. Par exemple, le pixel valeurs pour les bandes de fraction #12 sont : 817636 surenroulé plasmide, plasmides linéaires 50467 et 112052 cercles détendues. La valeur totale de pixel de l’ADN pour fraction #12 est la somme de ces valeurs, 980155. Le pourcentage d’ADN linéaire est 50467 multiplié par 100 pour le pourcentage et divisée par la valeur de l’ADN totale égal à 5,1 %. Le pourcentage des cercles détendues est 112052 multiplié par 100 et divisé par la valeur de l’ADN totale égal à 11,4 %. La somme des pourcentages de cercle linéaire et décontractée est de 16,5 %. Contrôle négatif l’ADN de plasmide avec aucune protéine (aucune IN, le graphique du bas) indique que cette préparation du plasmide inclus 4,4 % de l’ADN total comme des cercles linéaires ou défrisés. Un deuxième témoin négatif était une purification précédente de type sauvage PFV IN (WT) pouvant afficher 8,6 % de l’ADN total comme cercles linéaires ou défrisés. Ces voies de deux contrôle indiquent le niveau de fond de plasmide entaillé ou linéarisé présent avec le seul substrat et PFV po Un contrôle positif est une purification précédente de catalytiquement inactif dans PFV (D128N) qui a eu 23 % de l’ADN total comme des cercles de linéaires et détendus. L’ADN exposé aux fractions de Sépharose héparine 12 # à #22 a donné lieu à > 10 % de l’ADN comme des cercles de linéaires et détendus. Dans cet exemple, fractions #24 à 42 # affichées < 10 % de conversion aux cercles linéaires et détendus. Ces fractions ont été combinées et dialysées. Aliquotes ont été congelés et conservés à-80 ° C pour une utilisation future. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protéines recombinantes qui interagissent avec l’ADN, tels que protéines, charognards d’oxygène pour les applications de microscopie seule molécule ou integrases rétrovirale, réparation de l’ADN doivent être exempts de contamination bactérienne nucléases2,3. Ces contaminants peuvent confondre l’interprétation des résultats au cours de tests biochimiques ou simple molécule en vrac.

Nous avons trouvé qu’une nucléase bactérienne souvent co purifie avec PFV po Toutefois, IN PFV affiche une affinité pour l’héparine Sépharose qui se distingue facilement de la bactérienne nucléase contaminant1. La clé de la préparation d’exempte de nucléase PFV dans est la quantification prudente d’activité nucléasique dans chacune des fractions suite à gradient d’élution de l’héparine Sépharose. La pente doit être suffisamment faible pour permettre de séparer du PFV en le contaminant nucléase ; une forte pente ne serait pas compatible avec une séparation efficace. En outre, le substrat de l’ADN de plasmide devrait avoir un faible pourcentage des cercles détendues afin de réduire le fond de l’essai de nucléase. Si le substrat de l’ADN de plasmide possède un fond important de cercles détendues, une nouvelle purification d’ADN plasmidique est souhaitable. Le dosage de l’activité nucléasique révèle la présence des nucléase contaminant et fractions qui devraient être jetées.

Dans certains cas, chromatographie d’exclusion (s) peut être une méthode efficace pour l’enlèvement d’un de nucléase contaminant2. Groupes précédents ont utilisé SEC durant la purification du PFV dans4. SEC a un volume de charge limitée et tend à réduire la concentration de la protéine finale. L’avantage majeur d’affinité et de chromatographie échangeuse d’ions est la possibilité de charger un volume significativement plu que SEC.

Test d’activité nucléasique peut être adaptée à différentes protéines qui purifient conjointement avec une nucléase bactérienne. Ici, nous identifions que IN PFV et une nucléase contaminante peut-être être séparée par chromatographie sur sepharose d’héparine. Nous avons déjà montré que PFV IN a un profil similaire à la nucléase avec des cations Mono-S et chromatographie d’échange d’anions Mono-Q faire ces résines impropres à cette protéine. Selon les caractéristiques d’affinité de la protéine désirée en ce qui concerne la nucléase, ce protocole peut être utilisé avec des résines d’affinité ou échange d’ions gradient d’élution. La clé pour une élimination efficace de la contamination de la nucléase d’une protéine d’intérêt est une différence d’affinité pour une résine. Chaque fraction doit être dosée pour activité nucléasique. Les résines de chromatographie du présent protocole ne peuvent pas être appliquées directement sur toutes les protéines qui purifient conjointement avec des nucléases bactériennes. Cependant, le concept global d’utiliser une affinité ou une résine échangeuse d’ions pour séparer la nucléase une protéine d’intérêt et des fractions de dosage à l’activité nucléasique peut être largement applicable.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les NIH AI099854 et AI126742 à clé.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

Tags

Immunologie numéro 130 rétrovirus Prototype spumavirus intégrase nucléase purification des protéines
Détection et suppression de nucléase Contamination durant la Purification de l’intégrase du Virus spumeux Prototype Recombinant
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M.,… More

Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter