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Bioengineering

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Gladstone Institute for Cardiovascular Disease

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Plattform für die Herstellung von selbst-zusammengebauten Gewebe Ringe in variablen Größen mit einer angepassten 3D-gedruckten Kunststoff-Formenbau. PDMS-negative sind in der Form 3D-gedruckten geheilt; dann wird Agarose in die ausgehärtete PDMS negative gegossen. Zellen sind in die resultierende Agarose-Brunnen gesät, wo sie ins Gewebe Ringe aggregieren.

Abstract

Technische Gewebe werden klinisch zur Gewebereparatur und Ersatz eingesetzt und sind als Werkzeuge für die Wirkstoff-Screening und Modellierung menschlicher Erkrankungen entwickelt. Selbstgebaute Gewebe bieten Vorteile gegenüber Gerüst-basierte Gewebetechnik, wie erweiterte Matrix Deposition, Stärke und Funktion. Allerdings gibt es einige Methoden zur Herstellung von 3D Gewebe ohne Aussaat Zellen auf oder in einem tragenden Gerüst. Zuvor, entwickelten wir ein System für die Herstellung von selbst-zusammengebauten Gewebe Ringe durch impfen Zellen in nichtklebenden Agarose Vertiefungen. Ein Polydimethylsiloxan (PDMS) negative wurde zuerst in einer bearbeiteten Polycarbonat-Form gegossen und dann wurde Agarose in der PDMS negative ringförmige Zelle Aussaat Brunnen erstellen geliert. Allerdings war die Vielseitigkeit dieses Ansatzes durch die Auflösung der Tools für die Bearbeitung der Polycarbonat-Form begrenzt. Hier zeigen wir, dass 3D-gedruckten Kunststoff als Alternative zu bearbeiteten Polycarbonat verwendet werden kann, für die Herstellung von PDMS negative. Die 3D-gedruckten Schimmel und überarbeiteten Form Design ist einfacher zu bedienen, kostengünstig zu produzieren, und benötigt deutlich weniger Agarose und PDMS pro Zelle Aussaat gut. Wir haben gezeigt, dass die daraus resultierenden Agarose-Brunnen, selbstgebaute Gewebe Ringe mit angepassten Durchmesser aus einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen zu erstellen verwendet werden können. Ringe können dann für die mechanische, funktionalen und histologische Analyse oder für die Herstellung von größeren und komplexeren röhrenförmigen Geweben verwendet werden.

Introduction

Zelluläre Selbstmontage Ansätze zur Herstellung Gewebezüchtungen Blutgefäße sind eine Alternative zum Gerüst-basierte Ansätze. Selbstgebaute, Gerüst-freies Gewebe haben höhere Zelldichte, erweiterte Matrix Deposition und Stärke und verbesserte biologische Funktion im Vergleich zum Schafott-basierte Gewebe1,2,3,4 . Jedoch bleibt die 3D Gewebe ohne den Einsatz von exogenen Gerüst Unterstützung mit bestimmten Größen und Formen bilden eine Herausforderung. Einige Methoden verschmelzen Schichten der Zelle Blätter dicker Konstrukte bilden, obwohl dieser Prozess zeitaufwendig und arbeitsintensiv intensive5sein kann. Alternativ können Zellen ausgesät in nichtklebenden Formen und erlaubt den Aggregat in Sphäroide, Ringe und andere Gewebe Formen6,7,8.

Selbstgebaute Gewebe Ringe benötigen weniger Zellen, kürzere Kulturzeiten und weniger Reagenzien als größere röhrenförmigen Geweben, entwickelt aber noch mechanisch getestet, histologisch untersucht, oder verwendet werden können für Kontraktilität und anderen funktionalen Test7 , 9 , 10 , 11. weil sie können schnell hergestellt und einfach getestet werden, Gewebe Ringe sind ideal für die Überprüfung einer Vielzahl von Kultur-Parameter und haben Potenzial für den Einsatz als Krankheit Modelle11 oder Werkzeuge für Drogen-screening-12. Darüber hinaus Ringe können in komplexer Gewebestrukturen wie Blutgefäße oder Luftröhre7,13verschmolzen und Ringe können vollständig als andere Formen wie Sphäroide14,15verschmelzen.

Agarose ist als ein Formmaterial für die Herstellung von selbst-zusammengebauten Gewebe aufgrund seiner Biokompatibilität, Durchlässigkeit und Klebstoff Zelleneigenschaften verbreitet. Norotte Et Al. hergestellt beispielsweise Agarose Formen aus extrudierten Stäbe, die eingeschränkte Kontrolle über Form und erforderliche Spezialausrüstung15aktiviert. Tan Et Al. hinterlegt Alginat Tröpfchen als Gebäudeeinheiten um benutzerdefinierte Hydrogel Formen in verschiedenen Formen (Pyramide, Quadrat)16zu fabrizieren. Der große Durchmesser der Alginat Sphäroide (300 µm) führte jedoch Funktionen mit niedriger Auflösung. Eine niedrige Auflösung führen ungleichmäßige Form Oberflächen, die Zelle Aggregation Konsistenz beeinträchtigen können. Alternativ kann Agarose in Polymer negative nichtklebenden Formen mit glatten Funktionen und bestimmten Abmessungen6,7,17erstellen geworfen werden.

Wir berichteten bereits ein System für die Herstellung von kundenspezifischen ringförmigen Agarose Zelle-säen Brunnen aus einer PDMS negative Besetzung in einen gefrästen Polycarbonat Schimmel7,18. Agarose war in der PDMS-negativen gegossen und7,18setzen durfte. Zellen wurden dann in Agarose-Brunnen, wo sie zu bilden selbst zusammengebaut aggregiert, Gerüst-freies Gewebe Ringe in weniger als 24 h7,18ausgesät. PDMS-negative sind autoklavierbar, können viele Male wiederverwendet werden und sind weich und flexibel, macht es einfach, die erstarrten Agarose-Brunnen zu entfernen. Wann wurde dieses System zunächst in Gwyther Et Al. berichtet. 7, PDMS negative wurden gegossen aus Polycarbonat Formen (Abbildung 1A) gefräst. Nach Agarose Gießen waren die Zelle seeding Brunnen einzeln ausschneiden und platziert in Brunnen ein 12-Well-Platte7,18. Das Design wurde vor kurzem derart modifiziert, dass eine einzelne Agarose-Form 5 Ringe produziert und in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte passt, entfällt die Notwendigkeit, die einzelnen Wells ausgeschnitten und Verringerung der Menge an PDMS und Agarose erforderlich, um jeden Ring (Abbildung 1 b) zu produzieren. Eine kleinere Zelle Aussaat Trog Breite wurde verwendet, um die Zahl der gesetzten Zellen benötigt, um Ringbildung zu erreichen. Trotz dieser Veränderungen die Auflösung und die Anpassung von Schimmelpilzen auf verfügbaren standard Schaftfräsern Dimensionen beschränkt waren, und Micromilling kann teuer werden. Darüber hinaus Computer Numerical Control (CNC) Bearbeitung kann zeitaufwendig sein und umständlich wegen der Notwendigkeit, Zeit zu reservieren stark ausgelastet benutzerdefinierte Ausstattung, zusätzliche Computer aided Manufacturing (CAM) Software zum Konvertieren des Computer-aided-Design ( CAD) Datei, die eine programmierbare Werkzeugweg und zuverlässige Halterung Polycarbonat Teils während der Bearbeitung.

In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Verwendung von 3D-Druck als Alternative zur CNC-Bearbeitung. 3D-Druck ist weit verbreitet für engineering benutzerdefinierte Implantate, Herstellung von Gerüstmaterial, und für den direkten Druck von Zellen und Gewebe Sphäroide15,19,20. Wir nutzten einen hochauflösenden 3D-Drucker und spezialisierte 3D-Druck Material, das uns ermöglicht, eine starre Form mit einer glatten drucken, glänzende Oberfläche (siehe Tabelle der Materialien). Unsere Technik ermöglicht bei der Herstellung von hochgradig anpassbar, hochauflösende Kunststoffformen, die verwendet werden können, für das Gießen PDMS negative und Agarose-Brunnen. Design-Iterationen sind in Abbildung 1zusammengefasst. Die Formengestaltung wurde weiter in die 3D-gedruckten Schimmel Version abgeschrägten Außenmauern und ein Mittelloch einschließen, um Entfernung von PDMS negative aus 3D-gedruckten Formen und die Agarose-Brunnen von PDMS negativen erleichtern geändert. Diese konischen Funktionen können nicht mit Standard Bearbeitungsverfahren erreicht werden. Der Abstand von der Unterseite der Brunnen an der Unterseite der Form stieg in dieser Iteration, wodurch ein dicker Agarose Basis unterhalb der Beiträge zur Verringerung des Risikos von Stellen brechen während Agarose gut entfernen. Der Schimmel und Ring Herstellung Ablauf ist schematisch in Abbildung 2dargestellt.

Protocol

1. Vorbereitung der 3D-Druck Form

  1. Bereiten Sie eine CAD-Zeichnung der Form in den gewünschten Abmessungen.
  2. Senden Sie die CAD-Datei an einen hochauflösenden 3D-Drucker. Wählen Sie das entsprechenden Druck Kunststoffmaterial mit Hochglanz-Finish.
  3. Nach dem Druck waschen Sie gründlich die Form mit Wasser und Spülmittel.

2. Casting PDMS negative

  1. Messen Sie die gewünschte Menge an base PDMS auf einer Waage. Beiträge für eine Form mit einem 60 mm Durchmesser und 2 mm gut, 25 g zu verwenden.
  2. Fügen Sie Härtemittel am eine 01:10 (w/w) Verhältnis der PDMS-Basis.
  3. Rühren Sie kräftig, bis die beiden Komponenten gründlich vermischt werden. Unzureichende Durchmischung kann nicht vollständig Aushärten des PDMS, wodurch eine "klebrig" Oberfläche führen.
  4. Legen Sie ein Stück Labor Klebeband am Rand von 3D-gedruckten Formen, um die Bildung von PDMS-Basis-Layer über die gedruckten Quellen zu ermöglichen.
  5. Gießen Sie die PDMS-Mischung in die Form und legen Sie die Form in eine Vakuumkammer auf de-Gas bis alle Bläschen freigegeben werden.
  6. Heilen Sie die PDMS bei 50 ° C für 2 – 4 h oder bis genug erstarrt zu entfernen.
  7. Entfernen Sie das Klebeband Lab und sorgfältig Extrahieren der PDMS-negativ.
  8. Inkubieren Sie PDMS bei 60 ° C für weitere 1 h (nach der Entnahme aus der 3D-Druck Form), um sicherzustellen, dass Schimmel vollständig ausgehärtet ist.
  9. Waschen Sie die PDMS gründlich mit Spülmittel und Wasser, um alle Rückstände zu entfernen. Unzureichende Reinigung kann schlechte Ringbildung für die erste Verwendung des PDMS Negativs führen.

3. Herstellung von Agarose Wells

  1. Bereiten Sie Agarose Brunnen 1 Tag vor der Aussaat Zellen.
  2. Machen Sie eine 2 % ige (w/V) Agarose-Lösung in DMEM und Autoklaven.
  3. Pipettieren 4 mL flüssige Agarose in eine negative autoklaviert PDMS. Dann negative Pipettieren Agarose direkt in das Amt des PDMS. Entfernen Sie eventuelle Luftblasen mit einer Spitze Pipettieren als Bläschen Inhomogenitäten in den gut Dimensionen verursachen.
  4. Hinweis: Überfüllen Sie nicht, Formen; die obere Fläche der Agarose muss flach, damit Agarose Brunnen auf Entfernung aus dem PDMS und Platzierung in Kultur 6-Well-Platten liegen werden. Übrig gebliebene Agarose kann Re-autoklaviert und gebrauchte wieder, obwohl nicht mehr als einmal sein.
  5. Nachdem die Agarose abgekühlt (ca. 10 min für 4 mL Agarose; größere Formen benötigen mehr Abkühlzeiten), sorgfältig die Agarose-Brunnen aus dem PDMS-negative mit stumpfen Pinzette zu trennen und in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte übertragen.
  6. Tauchen Sie die Agarose-Brunnen in komplette Kulturmedium und equilibrate über Nacht in einem 37 ° C Inkubator vor dem Gebrauch.

4. Aussaat Gewebe Ringe

  1. Kultur-Ratte Aorta Glattmuskel Zellen21 (RaSMCs) in DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % L-Glutamin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % Natrium Pyruvat und 1 % Penicillin-Streptomycin bis zum Zusammenfluss von 70 % erreichen.
    Hinweis: Zellen sollten um 5 % CO2 und 37 ° C in 15 cm Gewebekultur Platten kultiviert werden.
  2. Nach dem Formen equilibriert werden (Abschnitt 3), RaSMCs für die Aussaat vorbereiten.
  3. Spülen Sie Platten zweimal mit 5 mL pro Teller mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
  4. Fügen Sie 3 mL 0,25 % Trypsin pro 15 cm Petrischale. Verschieben Sie die Platten in einem 37 ° C Inkubator für 2 – 3 min. oder bis die Zellen aus der Platte gehoben haben.
  5. Trypsin mit ein gleiches Volumen (3 mL pro Teller) komplette Kulturmedium zu neutralisieren. Aufzuwirbeln Sie die Zellen gründlich zu Klumpen brechen.
  6. Verdünnen Sie ein Aliquot der Zellsuspension 1:1 mit Trypan blau Farbstoff und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
  7. Zentrifugieren Sie das Gesamtvolumen der Zellsuspension für 5 min bei 200 X g, pellet-Zellen.
  8. Aufschwemmen Sie Zellen in einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro mL; Dadurch werden 500.000 Zellen pro 50 µL.
    Hinweis: Verschiedene Zelltypen möglicherweise andere Zelle Konzentrationen.
  9. Aspirieren Sie alle Mittel aus der Agarose-Form. Achten Sie darauf, alle Mittel aus einzelnen Brunnen zu entfernen, sondern zu die Böden der Brunnen nicht durchstechen.
  10. Pipettieren 50 µL der Aussetzung in jede Vertiefung.
  11. 2 mL frisches Medium um die Außenseite der Agarose Form sorgfältig hinzugeben. Achten Sie darauf, nicht mittlere Überlauf in die Vertiefungen der Agarose lassen. Legen Sie die Platten in den Inkubator über Nacht (ca. 16 h).
  12. Aspirieren Sie nach der Inkubation über Nacht das Medium aus außerhalb der Formen, und jede Vertiefung des 6-Well-Platte fügen Sie 4,5 mL frisches Medium hinzu, sodass Formen und Ringe vollständig eingetaucht sind. Wechsel-Medium täglich.

Representative Results

Dieses System ermöglicht für das einfache, maßgeschneiderte Herstellung von Aussaat Brunnen Agarose-Zelle, die Zelle Selbstmontage des ringförmigen 3D ermöglicht Gewebe entwickelt. 3D-Druck ermöglicht bessere Auflösung und eine größere Flexibilität im Formenbau als Bearbeitung von Polycarbonat, wo Dimensionen durch die verfügbaren Werkzeuggrößen eingeschränkt sind. Mit einem hochauflösenden 3D-Drucker Wände so dünn wie 0,254 mm bedruckbar und Trog Abmessungen sind nur durch die Auflösung des Druckers (15,2 µm Auflösung für diese Untersuchungen) begrenzt. In der Regel sind CNC Endmills von weniger als 0,3 mm nicht im Handel erhältlich, so ist es nicht möglich, Tröge kleinere Breite zu erstellen. Mikrofräsen können kleinere Features, obwohl der Ausstattungsbedarf möglicherweise unerschwinglich teuer oder unzugänglich für viele biomedizinische Forschungslabors. Trog Dimensionen und Krümmung sind auch durch den Schaftfräsern Tip Shape begrenzt. Darüber hinaus Funktionen wie abgewinkelt oder konische Wände sind nicht möglich und kleine Features während der Bearbeitung brechen können.

CAD-Zeichnungen können leicht geändert werden, um 3D-gedruckten Formen und PDMS negative von anpassbaren Abmessungen produzieren. Abbildung 3 beschreibt die Dimensionen unserer aktuellen 2 mm Post 3D-gedruckten Formen, im Vergleich zu früheren Design-Iterationen. Das Verfahren ist kostengünstig; 2 mm, 5-Ring 3D-gedruckten Mold Kosten 44,67 USD, 3D Drucken und jedes Teil können verwendet werden, um mehrere PDMS negative zu erstellen. Bisher haben wir mehr als 30 PDMS negative aus einem Guss 3D-gedruckten geschaffen. Jede Negative erfordert 25 g PDMS auf 0,11 USD pro g (2,75 USD pro PDMS negativ). Jedes PDMS negativ kann mit Waschmittel, autoklaviert, gereinigt und wieder für bis zu mehreren Jahren, je nach Häufigkeit der Verwendung verwendet werden. Im Vergleich zu den ursprünglichen Entwurf18, nutzt die kompakte 3D-gedruckten Form deutlich weniger PDMS und Agarose pro 2 mm Gewebe Ring (Abbildung 1E).

Zellen ausgesät in aggregierter Form Gewebe Ringe in weniger als 24 Std. Ring Dimensionen abhängen, die Abmessungen der Agarose Brunnen äquilibriert Agarose-Brunnen. Hier haben wir gezeigt, dass selbst-zusammengebauten Ratte Glattmuskel Zelle Ringe in Brunnen mit 2, 4 oder 12 mm Durchmesser Beiträge (Abbildung 4) hergestellt werden können. Während Ringe in dieser Studie nur für 3 Tage kultiviert wurden, wir haben zuvor hSMC Ringe für bis zu 2 Wochen22kultiviert und Stammzellenreserve-Knorpel Ringe für bis zu 3 Wochen13. Wie bereits berichtet, können Ringe funktionieren, wie 3D in-vitro- Modelle der menschlichen Geweben für quantitative Bewertung des Gewebes11 und mechanische Festigkeit13,22 Funktion, und auch dienen als modulare Gebäudeeinheiten können generieren Sie röhrenförmig Gewebe Konstrukte7,13. Handy-seeding Bedingungen und funktionalen Eigenschaften der Gewebe Ringe aus dieser Zelltypen entwickelt sind in Tabelle 1zusammengefasst.

Figure 1
Abbildung 1: Polycarbonat Schimmel Entwürfe. Zunächst wurden 15 gut Formen aus Polycarbonat (A) bearbeitet. Spätere Versionen kennzeichnete eine kompaktere Bauweise (B), mit 5 Brunnen entworfen, um in einer einzigen Polycarbonat-Form und in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte passen. Hier haben wir modifiziert dieses Design 3D-gedruckten Kunststoff als kundengerechtere Alternative zu bearbeiteten Polycarbonat (C) zu verwenden. (D) gezeigt werden Agarose Brunnen hergestellt von der ersten18 (links) im Vergleich zu den aktuellen Kompaktbauweise (rechts), entwerfen, die erfordert deutlich weniger Agarose, und erfordert keine manuelle Trennung von Brunnen. Mengen von PDMS und Agarose für jede Iteration Design erforderlich erscheinen (E). Zentrum-Beiträge sind 2 mm im Durchmesser. Schimmel in (A) ist 6 cm x 12 cm, (B) hat einen Durchmesser von 5 cm und (C) hat einen Durchmesser von 6 cm. Maßstabsleiste (D) = 3 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Herstellung von selbst-zusammengebauten Gewebe Ringe. Eine 3D-gedruckten Form wird verwendet, um eine Negative PDMS zu werfen, die dann verwendet wird, um die Agarose-Brunnen (A) gegossen. Zellen sind dann direkt in die Agarose-Brunnen, gesät, wo sie in weniger als 24 h Form Gewebe Ringe (B) aggregieren. Gestrichelte Linien in (B) zeigen die gut Gliederung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Querschnittansicht 3D-gedruckten Schimmel CAD Zeichnung. Abmessungen für Trog Breite (A), Trog Höhe (B), Mittelloch (C), Durchmesser (D), äußere Lippe (E) und Außenwand Höhe (F) werden angezeigt. Die Außenwände (1), oberen Teil der Brunnen (2) und (3) das Loch in Mitte sind (in einem Winkel von 5° für 1 bis 3, 45 ° für 2) zur Verbesserung der Benutzerfreundlichkeit von PDMS negative Entfernung verjüngt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: CAD-Zeichnungen mit entsprechenden PDMS-negativen und selbst-zusammengebauten SMC-Ringe mit 2 (A), 4 (B) und 12 (C) mm Durchmesser post. In (A), (1) zeigt eine Kerbe für Orientierung, (2) zeigt eine mittige Bohrung um die Durchblutung zu verbessern, (3) ist ein Aktenzeichen, die direkt auf die PDMS negative prägt, und (4) zeigt die äußere Wand, die verjüngt sich um PDMS negative Ausbau zu erleichtern. Bars in Agarose Brunnen skalieren = 1 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zelltyp Zellen pro Ring ausgesät Ringdurchmesser Kultur-Dauer Funktionsanalyse durchgeführt
Ratte SMC 0,5, 1 oder 3 x 106 2, 4 oder 12 mm 3 Tage Aktuelle Studie; N/A
iPSC abgeleitet SMC 11 0,6 x 106 2 mm 17 Tage Kontraktilität testen, einachsigen Zugversuch, histologische Analyse
Menschlichen SMC 22 0,4 x 106 2 mm 2, 7 oder 14 Tage Einachsigen Zugversuch, histologische Analyse
Menschlichen MSC 14 0,4 x 106 2 mm 21 Tage Einachsigen Zugversuch, histologische Analyse, Ring Fusion und Rohr Kompression testen, Differenzierung in Knorpelgewebe

Tabelle 1: Anzahl Zellen für Ring-Herstellung von verschiedenen Zelltypen erforderlich.

Discussion

Hier haben wir eine vielseitige Methode für die schnelle Herstellung von selbst-zusammengebauten Gewebe Ringe mit leicht kundenspezifische Abmessungen mit 3D-Druck präsentiert. Unsere Methode ist ähnlich dem in Svoronos Et al.berichtet. 6 , wo 3D-gedruckten Waben und Hundeknochen geformt Wachs Formen dienten PDMS negative Stimmen. Jedoch wurden die Formen geändert, um mehrere einzigartige Design-Merkmale enthalten. Eine Kerbe (Abbildung 4A(1)) schafft Orientierung der Form erlauben jedem Ring gekennzeichnet und einzeln überwacht werden. Das zentrale Loch (Abbildung 4A(2)) trägt zur Verbesserung der Verbreitung des Mediums in die Vertiefungen. CAD-File-Nummern sind direkt auf der Form gedruckt; Daher PDMS negative sind jeweils gekennzeichnet mit Versionsnummer und post-Durchmesser (Abbildung 4A3). Die konische Außenwände (Abbildung 3(1), 5 °), an der Spitze der gut Tröge (Abb. 3(2), 45 °) und zentralen Loch (Abbildung 3(3), 5°) erleichtert das PDMS negative von den 3D-gedruckten Schimmel entfernen , und Agarose Brunnen sind einfacher, von den negativen PDMS zu entfernen (Abbildung 4A(2), A(4)).

Die Vielseitigkeit dieses Systems haben wir bewiesen, durch die Herstellung selbst-zusammengebauten ringförmige Gewebe von den unterschiedlichsten Durchmessern und Zelltypen, einschließlich der primären menschlichen Glattmuskel Zellen (SMCs)18,22, Ratte Aorta SMCs7 , 23, humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs)13und SMCs abgeleitet von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)11 (Tabelle 1). Wir sind im laufenden Arbeiten bewerten die Bildung von Ringen aus weitere Zelltypen wie Endothelzellen und Absicherung Knorpel Ringe in verschiedenen Größen für potenzielle Anwendungen in trachealen Ersatz. Neben komplett Zelle abgeleitet Konstrukte haben wir dieses System auch verwendet, um Ringe mit eingearbeiteten vernetzte Gelatine Mikrosphären13,22zu fabrizieren. Mikrosphären eingebaut werden können im Gewebe Ringe bei Selbstmontage um zusätzliche mechanische Festigkeit bieten oder für die Lieferung von Wachstumsfaktoren13,22lokalisiert.

Wenn Gewebe Ringe herstellen, möglicherweise Optimierung der Anzahl von Zellen für verschiedene Zelltypen erforderlich. Minimale Zelle Zahlen variieren basierend auf der Größe und Art der Zellen. Z. B. hSMCs aus iPSCs abgeleitet sind bei 600.000 Zellen/Ring11ausgesät, ausgesät hMSCs und primäre hSMCs bei 400.000 Zellen/Ring13,22und Ratte, die Aorta SMCs mit 500.000 Zellen/Ring18ausgesät werden. Trog Maße beeinträchtigen auch Ringbildung und die minimale Anzahl von Zellen für Ring Bildung24erforderlich. Für Studien mit menschlichen Zellen und 3D-gedruckten Formen wurde eine Trog Breite von 2 mm verwendet. Die ursprüngliche Polycarbonat Formen hatte eine Trog Breite von 3,75 mm, die 750.000 hSMCs bilden eine 2 mm Zelle Ring18erforderlich. Mit der reduzierten Trog breite konnten wir die Anzahl der Zellen notwendig für Ringbildung um 46 % auf 400.000 Zellen pro Ring25reduzieren. Mengen von Zellen pro Ring ausgesät werden in Tabelle 1zusammengefasst.

Bei 3D-gedruckten Werkstoffauswahl, müssen viele Faktoren berücksichtigt werden. Da PDMS in der Regel bei 60 ° C ausgehärtet ist, muss das Material 3D-gedruckten hoch genug Schmelztemperatur um Schäden während der Härtung PDMS zu vermeiden. Die Schmelztemperatur des in dieser Studie verwendeten Materials (eine eigene Material, siehe Tabelle der Materialien) ist nicht verfügbar. Jedoch wenn bei 60 ° C für 1 Stunde gebacken, beobachteten wir, dass das Material begann, einen Geruch zu produzieren. So beschlossen wir, die Aushärtung Temperatur auf 50 ° C und die Aushärtungszeit zu erhöhen, um die PDMS backen ohne Beschädigung der 3D-Druck Material. Anpassungen bei der Heilung Zeit möglicherweise erforderlich, wenn Formen zu größeren PDMS-negativen Form geändert werden. Eine zusätzliche Härtung Frist bei 60 ° C nach PDMS Entfernung aus den 3D-gedruckten Formen verhindert, dass die endgültige PDMS negative verbleiben klebrig, während Temperaturbegrenzung 3D-gedruckten Schimmel ausgesetzt ist. Beachten Sie, dass einige Materialien Aushärten des PDMS zu hemmen, also sicherstellen Sie, dass das ausgewählte Material mit PDMS kompatibel ist. Schließlich muss die Form materiellen Toxizität berücksichtigt werden. Während die 3D-gedruckten Form nicht in direktem Kontakt mit Zellen werden, ist es möglich, dass einige Rückstände aus der Form auf die PDMS negative während der Aushärtung Verfahren übertragen werden kann. Wir fanden, dass sehr gründliches Waschen mit Spülmittel ausreicht, um alle Rückstände aus dem PDMS negativ zu entfernen. Allerdings haben wir zuvor beobachtet, dass unzureichende waschen zu armen Ringbildung in Agarose-Brunnen für das erste paar Verwendungen von negativen PDMS geführt. PDMS-Besetzung von anderen 3D-gedruckten Materialien können benötigen zusätzliche Untersuchung zu überprüfen, ob Reinigungsmittel entfernen Schimmel Rückstände, einschließlich alle mögliche Leachates ausreicht. Wiederholungsprüfungen kann auch notwendig, da es möglich sein, die wiederholt Heizzyklen (sogar bis zu 50 ° C) kann die Form im Laufe der Zeit beschädigen, und verursachen erhöht im Rückstand nach wiederholtem Gebrauch. Bis heute haben wir ein 3D-gedruckten Guss eingesetzt, um mehr als 30 PDMS negative zu produzieren, die verwendet wurden, um erfolgreich Gewebe Ringe erzeugen.

Insgesamt, 3D Drucken ermöglicht größere Vielseitigkeit bei der Herstellung von Agarose Formen als Bearbeitung von Polycarbonat. Freuen Sie sich auf eine höhere Auflösung als bei Werkzeugen und Formengestaltung wird nicht durch die Abmessungen der verfügbaren Werkzeuge begrenzt. Dies ermöglicht eine größere Anpassung, und die Zugabe von Features wie Verjüngung, die möglicherweise nicht mit der Bearbeitung. Dieses System kann angewendet werden, zur Herstellung von selbst-zusammengebauten Gewebe in anderen Formen als auch zusätzlich Ringe6,17. Mit der Ring-Herstellung-Methode haben wir Gewebe Ringe aus einer Vielzahl von Zelltypen und Größen für potenzielle Anwendungen in trachealen Tissue engineering13, veränderter Blutgefäße7und Modellierung Gefäßerkrankungen11entwickelt.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Dr. Erica Stults (akademische Forschung & Application Scientist, WPI Information Technology Services) erkennen wir dankbar für ihre Hilfe mit 3D-Druck, Amanda Zoë Reidinger, Ph.d., Chris Nycz und Karen Levi, M.E., für ihre Beiträge auf Formengestaltung, Kathy Suqui und Jennifer Mann für ihre Unterstützung testen Schimmel Entwürfe und Michael O'Keefe für seine Hilfe bei Dreharbeiten.  Diese Arbeit wurde unterstützt durch NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, HAS), NIH R15 HL097332 (MWR, TAH), NSF REU EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, HAS) und NIH R15 HL137197 (MWR, HAS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SeaKem LE Agarose Lonza 50040
PDMS Dow Corning Sylgard 184
DMEM Corning Cellgro 15-017-CV
VeroWhite StrataSys RGD835
3D printer StrataSys Objet 260 Connex
DMEM Corning Cellgro 15-017-CV
FBS Thermo Fisher 16000069
L-glutamine Corning Cellgro 25-015-CI
Non-essential amino acids Corning Cellgro 25-025-CI
Sodium pyruvate Corning Cellgro 25-000-CI
Pen-strep Corning Cellgro 30-002-CI
Trypsin Corning Cellgro 25-053-CI
Trypan blue Corning Cellgro 25-900-CI
PBS Lonza 17-516F
6-well plate Corning 353046
WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells Provided by T. Wight [ref 21] N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biotechnik Ausgabe 134 3D-Druck selbstgebaute Gewebe Vascular Tissue Engineering Agarose benutzerdefinierte Form Gewebetechnik
Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen
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Strobel, H. A., Calamari, E. L.,… More

Strobel, H. A., Calamari, E. L., Alphonse, B., Hookway, T. A., Rolle, M. W. Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds. J. Vis. Exp. (134), e56618, doi:10.3791/56618 (2018).

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