Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لعزل وزراعة cardiomyocytes البطين الفئران الكبار (أرفك). يمكن استخدام أرفك معزولة لزراعة قصيرة وطويلة الأجل. عزل وزراعة أرفك يمكن أن تلعب دوراً رئيسيا في تطوير نظم المعالجة الجديدة لأمراض القلب.
Abstract
في قلب سليمة، وتأثير الخلايا المجاورة cardiomyocytes الكبار. مع طريقة العزل وزراعة كارديوميوسيتيس الكبار، إجراء تحقيق دقيق لسلوك هذه الخلايا ضمن بيئات وعلاجات محددة أمر ممكن. ويعرض هذه المخطوطة بروتوكول لعزل ناجحة وزراعة cardiomyocytes البطين الفئران الكبار (أرفك).
هو التضحية بالفئران بخلع عنق الرحم تحت التخدير العميق. ثم، يتم استخراج القلب والشريان الاورطي كشف. وفي وقت لاحق، يتم نضح على نظام التروية لانجيندورف مع نضوب الكالسيوم والعلاج كولاجيناز. بعد ذلك، أنسجة البطين يحصل مفروم، إعادة توزيع، وتصفيتها، تليها ثلاث خطوات استخدام الطرد المركزي مع الإضافة التدريجية كاكل2 حتى يتم التوصل إلى تركيز الكالسيوم الفسيولوجية. يتم مطلي أرفك في خلية ثقافة الأطباق. بعد تحديث مستنبت الخلية، أرفك يمكن أن تزرع لمدة تصل إلى ستة أيام دون تغيير وسيلة الثقافة التي تحتوي على المصل. عزل أرفك عملية حساسة كالسيوم. التغييرات الصغيرة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا يسبب نقصان في الجودة والسلامة للخلايا المعزولة.
أرفك على شكل قضيب طازجة معزولة. في الأيام الأولى للزراعة فإنها تفقد على شكل قضيب مورفولوجيا ونموذج pseudopodia مثل هياكل (نشر). خلال هذا التكوين المورفولوجي أرفك في البداية تتحلل عناصرها الهوس متبوعاً إصلاح عن طريق ألياف الأكتين الإجهاد و حيثياته ساركوميروجينيسيس. بعد أسبوع واحد من زراعة، تظهر معظم أرفك مظهر على نطاق واسع مع سترييشن عبر وضوح قابلة للاكتشاف. هذه العملية حساسة لتركيز الكالسيوم داخل الخلايا، كما يخفف العلاج مع إيونوميسين نشر. هي علامات رئيسية في هذه العملية دي وإعادة ديفيرينتييشن β-الميوسين سلسلة ثقيلة (β-MHC) و oncostatin م (OSM) سويبروسين-1 (EFHD2). وأشارت الدراسات الأخيرة أن القلب re ودو ديفيرينتييشن التي تحدث في ظروف الثقافة يحاكي ميزات ينظر في فيفو أثناء إعادة عرض القلب. ولذلك، عزل وزراعة أرفك تلعب دوراً أساسيا في فهم بيولوجيا كارديوميوسيتيس.
Introduction
كارديوميوسيتيس الكبار في فيفو العمل سينسيتيوم كهربائية استناداً إلى خلية خلية الاتصالات بين ميوسيتيس. وباﻹضافة إلى ذلك، فهي تتأثر بالخلايا المجاورة مثل القلب الليفية والخلايا البطانية والخلايا العصبية والخلايا الملتهبة1. من أجل دراسة قدرة كارديوميوسيتيس على التكيف مع تلك المنظمة داخل الخلايا لتغيير ظروف الحمل، كما رأينا خلال تضخم القلب، الذي هو خطوة أولية مما يؤدي إلى قصور القلب، والعزلة وزراعة الفئران البطين الكبار كارديوميوسيتيس (أرفك) هو اللازمة2،،من34. تاريخيا، كانت أولاً cardiomyocytes معزولة من الفرخ الجنينية قلوب5،6. بضع سنوات في وقت لاحق، وصفت الأولى عزل cardiomyocytes الميؤوس من شفائهم المتباينة باستخدام الكالسيوم استنفاد7. بيد أن هذه كارديوميوسيتيس الكبار لم تكن الكالسيوم متسامح ولذلك لا يمكن استخدامها لفحوصات فنية. وأخيراً، تمكين بروتوكول جديد في عام 1976 بأول وتطور التحقيق في cardiomyocytes البطين الكبار تحت الظروف الفسيولوجية8. وكخطوة أولى، أنها معزولة cardiomyocytes الكبار تحت تركيزات منخفضة من الكالسيوم والكالسيوم بعد ذلك زيادة التركيزات الفسيولوجية في إجراء التدرجي. اليوم، معظم البروتوكولات لعزل وزراعة كارديوميوسيتيس الكبار يعمل بهذا البروتوكول الكالسيوم واستخدام كولاجيناز الهضم الأنزيمي من اتصالات كثيفة خلية-خلية1.
زراعة ناجحة، مطلوب مصل العجل الجنين (FCS) أو oncostatin م (OSM). أرفك أداء دي-وإعادة-differentiation مع تغييرات هيكلية واسعة النطاق بما في ذلك ساركومير التفكيك واصلاحهم9،10،،من1112. هذه العملية هو مصحوبا بتعبير إعادة جينات نوع الجنين، مثل سلسلة ثقيلة β-الميوسين (β-MHC)، كما يعرف من تضخم، وتشكيل هياكل مثل بسيودوبوديا، وتسمى أيضا نشر4،11، 13-وعلاوة على ذلك، سويبروسين-1 (EFHD2)، بروتين محددة حديثا، دوراً رئيسيا عملية التفريق بين إعادة زراعتها أرفك11. نتيجة لذلك أرفك في ثقافة تحويل الخلايا على نطاق واسع، والأشكال التي تظهر تقلصات تلقائية بعد أسبوعين أو ثلاثة أسابيع في الثقافة2،،من414.
الاكتشافات الأخيرة قد كشفت عن أن القلب re ودو differentiation كما يحدث في ظروف الثقافة يقلد الميزات ينظر في فيفو خلال القلب يعيد10،15. إعادة عرض القلب عملية رئيسية خلال أمراض القلب16. كما لا تزال أمراض القلب هي السبب الرئيسي للوفاة في المجتمعات الصناعية، من المهم فهم أفضل لبيولوجيا cardiomyocytes الكبار (الذين؛ عام 2015). عزل وزراعة أرفك يمكن أن تساعد على وضع استراتيجيات جديدة وأدوية لعلاج أمراض القلب. ويرد مع هذه المخطوطة، بروتوكولا لعزل وزراعة أرفك. وعلاوة على ذلك، سلط الضوء على بعض الأجزاء الهامة من هذا الأسلوب في جزء المناقشة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويجري التحقيق وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرتها "لنا المعهد الوطني للصحة" (المعاهد الوطنية للصحة المنشور رقم 85-23، تنقيح عام 1996). وبصفة عامة، ويستار الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 3 إلى 4 أشهر، ومع متوسط وزن 250-350 جرام وتستخدم لهذا البروتوكول. قلب فأر واحد غير كافية من أجل 20 ثقافة الأطباق (1 مل كل طبق؛ والقطر الداخلي: 35 ملم) مع بكثافة خلية تقريبي 1.5 × 10 4 خلايا/1000 مم 2-
1. إعداد الوسائط والمواد الكاشفة
- الكرياتين-كارنيتيني-توراين المتوسطة (المتوسطة CCT)
ملاحظة: CCT المتوسطة وسيلة معقدة تستند إلى المتوسطة 199 بالإضافة إلى الكرياتين والكارنيتين وتوراين.- ل 1 إعداد متوسطة 199: إضافة 3.6 غ حبيس ومزيج ح 1. ثم قم بإضافة ملغ 655.5 الكرياتين (5 ملم)، 395.4 ملغ كارنيتيني (2 مم) و 625.5 ملغ توراين (5 مم). كارنيتيني وتوراين تغيير درجة الحموضة إلى < 7. كي تمنع نمو أي تلويث الخلايا، مثل خلايا بطانية أو الليفية، إضافة 10 ميكرون السيتوزين β-د-أرابينوفورانوسيدي إلى المتوسط. ضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم (2 مم) إلى تصفية 7.4 وعقيمة المتوسط. تخزين متوسطة CCT في 4 ° C.
- المتوسطة بأول
- لأول ل متوسطة الحجم، تذوب ز 6.43 كلوريد الصوديوم (110 مم) مع ز 0.19 بوكل (2.5 مم)، 0.16 ز خ 2 ص 4 (1.2 مم)، 0.3 ز مجسو 4 7 ح 2 س (1.2 مم)، ز 5.96 حبيس (25 مم)، و 1.98 غ د (+ )-مونوهيدرات (10 ملم) من الجلوكوز في أكوا العقيمة. ضبط الأس الهيدروجيني مع هيدروكسيد الصوديوم (2 م) لتصفية 7.4 وعقيمة المتوسط. المتوسطة بأول متجر في 4 ° C.
- كلوريد الكالسيوم (كاكل 2)
- إعداد حل 100 مم كاكل 2 (50 مل) وإعداد مختبرين تحتوي على 500 ميليلتر كاكل 2. تجميد مختبرين في-20 درجة مئوية.
- إعداد متوسطة الثقافة
- تحضير ثلاث وسائل الثقافة الخلية: قبل التصفيحات المتوسطة والمتوسطة والطلاء والمتوسطة الغسيل. استخدام CCT المتوسطة كالأساس لجميع وسائل الإعلام الثلاثة (الجدول 1). حساب CCT المتوسطة مع 1 مل كل طبق الثقافة. لذلك، إعداد 20 مل CCT المتوسطة 20 ثقافة الأطباق (القطر الداخلي: 35 ملم)-
- خلية ثقافة لوحات: معطف كل لوحة الثقافة الخلية (القطر الداخلي: 35 ملم) مع 1 مل قبل التصفيحات المتوسطة. تخزين لوحات المغلفة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، أو على الأقل 2 ح قبل استخدام.
2. عزل Cardiomyocytes الكبار
- نظام التروية "إعداد لانجيندورف"
- الحرارة المتوسطة والطلاء والمتوسطة الغسيل إلى 37 درجة مئوية. رفع التجميد عن أنبوب 500 ميليلتر كاكل 2 وتزن 25 ملغ كولاجيناز.
- طرد نظام التروية لانجيندورف مع أكوا العقيمة، بعد ذلك اسمحوا المتوسطة بأول تعميم نظام الحد الأدنى 5
- تعبئة نظام التروية لانجيندورف مع 80 مل المتوسطة بأول دون أي الهواء فقاعات والغاز المتوسطة مع الأكسجين 95%.
- إعداد أنبوب (50 مل) مع 40 مل بأول متوسط والحرارة عليه إلى 37 درجة مئوية، والغاز أنه مع الأكسجين 95%.
- إعداد مؤشر ترابط حوالي 25 سم في الطول لربط قلب إزالتها إلى القنية.
- ديجريسى شفرة حلاقة مع الكحول (70 في المائة من حيث الحجم)، وربط ذلك بالمروحية. المشبك قرص بلاستيك إلى المروحية.
- استخراج القلب
- تخدير ذكور جرذان ويستار مع isoflurane 4% إلى 5% والتضحية به مع التفكك عنق الرحم. فتح البطن خلف قوس الساحلي مع قص البطن، ومع نفس زوج من مقص، قطع طريق الحاجز لفتح تجويف الصدر. إزالة
- القلب، جنبا إلى جنب مع الرئة والغدة الصعترية، بالقطع أعلاه الغدة الصعترية الجمجمة عاليا في تجويف الصدر. نقل هذه المواد إلى المحلول الملحي المثلج فورا.
- إزالة الرئة والغدة الصعترية من القلب مع مقص تشريح (كبير) والتي فيكساتينج المواد مع الملقط كبسولة، نقل الأخير إلى حل مالحة جديد.
- عزلة
- إزالة الأنسجة الزائدة، مثل مخلفات الغدة الصعترية، القصبة الهوائية، والدهون والنسيج الضام من القلب باستخدام الملقط الكبسولة ومقص تشريح (كبيرة أو صغيرة). كشف الشريان الاورطي وقطع عليه مع مقص تشريح (كبيرة أو صغيرة) بين المهندس الأول والثاني التطور
- بدء نازف نظام التروية لانجيندورف. مكان القلب في قنية نظام التروية لانجيندورف ويحملق أولاً مع المشبك التماسيح ولاحقا مع الصفحات المعدة. شطف القلب حتى أنها خالية من الدم.
- حل 25 ملغ كولاجيناز في 5-6 مل المتوسطة بأول الحارة وإضافة 12.5 ميليلتر كاكل 2 (30 ميكرومتر). إغلاق الدورة الدموية عن طريق تحريك قمع زجاج، الذي يرتبط بنظام التروية لانجيندورف، عبر قلب نازف
- وإضافة كولاجيناز حل لنظام التروية. تبدأ نضح لمدة 25 دقيقة سرعة قطره قطره 1 في الثانية الواحدة.
ملاحظة: أثناء التروية، القلب سوف تضخم والحصول على مظهر شمعي. - توقف التروية بعد 25 دقيقة وإزالة القلب من نظام التروية لانجيندورف. إزالة الشريان الاورطي، الاذينين، والنسيج الضام من القلب وفتح البطينين الأيمن والأيسر.
- يقطع القلب مرتين بزاوية مقدارها 90 درجة (خفض العرض: 0.7 مم؛ والسرعة: 0.15 سم/ثانية). كرر هذه العملية يدوياً مع المشارط هما 10 s كل جانب.
- نقل 12 مل الوسط التروية في أنبوب جديد (50 مل). صب ملاط الخلية في هذه الخلايا المتوسطة وملخص لآخر خمس دقائق في 37 درجة جيم ميكس الحل كل دقيقة-
- تصفية الحل مع قلب هضمها من خلال شبكة نايلون (200 ميكرومتر) في أنبوب جديد (50 مل)-
- الطرد المركزي الحل الذي تم تصفيته في 29 س ز للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية وإضافة 6 مل المتوسطة بأول الحارة بما في ذلك 12.5 ميليلتر كاكل 2 (250 ميكرومتر) إلى بيليه الخلية. ريسوسبيند بيليه من خلال حركات الهز السلس. الطرد المركزي مرة أخرى في 29 س ز 2 دقيقة تجاهل المادة طافية وإضافة 6 مل الحارة المتوسطة بأول محل 25 ميليلتر كاكل 2 (500 ميكرومتر). حل بيليه الخلية من خلال حركات الهز لطيف وإضافة 12 مل الحارة بأول المتوسط بما في ذلك 120 ميليلتر كاكل 2 (1 مم). أجهزة الطرد المركزي لمرة ثالثة في 16 x ز لمدة 1 دقيقة. ومرة أخرى، إزالة المادة طافية.
- ميكس بيليه الخلية مع متوسط حرارة قبل الطلاء.
- إزالة الطلاء قبل المتوسطة من لوحات الثقافة. نقل 1 مل تصفيح المتوسطة، بما في ذلك كارديوميوسيتيس معزولة، لكل لوحة الثقافة. احتضان الطازجة cardiomyocytes معزولة في 37 درجة مئوية حاء 1 إزالة
- المتوسطة الطلاء من لوحات الثقافة. أضف 1 مل غسل المتوسطة لكل لوحة الثقافة وتخزين لوحات عند 37 درجة مئوية إلى ستة أيام دون تغيير في المتوسط-
- للتحقيق في تأثير المواد الكيميائية المختلفة والعلاجات في أرفك، أولاً تحديث المتوسطة والطلاء بغسل المتوسطة وبعد ذلك إضافة مواد كيميائية مختلفة-
ملاحظة: التقييم بالفحص المجهري الخفيفة: مع كل إعداد الخلية، ينبغي رصد cardiomyocytes 150 إلى 300 يوميا بالفحص المجهري الخفيفة. تقسيم cardiomyocytes جميع الأصوات التي تم فرزها في مجموعات حسب مظهرها (مثلاً، " على شكل قضبان "، " جولة أسفل "، " نشر "، و " مظهر غير عادي "). الفئة " نشر " يشمل جميع كارديوميوسيتيس مع هياكل مثل بسيودوبوديا. " مظهر غير عادي " ويشمل جميع أرفك مع سطح غير نظامية وغشاء الخلية لا يمكن كشفها سليمة.
3. مثال تجارب
- Fluorescence/الفلورة تلوين للكبار كارديوميوسيتيس
- تحليل التحويلات البنيوية والهيكلية من أرفك أثناء زراعة بالليزر [كنفوكل] مجهرية. استخدام فالويدين-تريتك للتحقيق فيها الهياكل واكتين في " على شكل قضبان "، " جولة أسفل "، و " نشر " أرفك. القيام بتلوين وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s. ويرد مثال لتلطيخ فالويدين-تريتك في إشارة نبيرت et al. 11-مع تلطيخ الأسفار/الفلورة، الاختلافات في دي-وإعادة-differentiation جهاز الهوس في cardiomyocytes الكبار المزروعة بين العلاجات التجريبية (مثلاً، مع Swiprosin-1، إيونوميسين) يمكن أن يحقق.
- (قرة-PCR) الكمية في الوقت الحقيقي RT-PCR
- أداء بكر قرة للتحقيق في التغيرات في التعبير مرناً من جينات مختلفة (مثل OSM، سويبروسين-1، β-MHC) أثناء زراعة أرفك. لحجم عينة كاف، استخدام أكبر ثقافة الأطباق (القطر الداخلي: 60 ملم) بحجم 2 مل. أرفك من خمسة ثقافة الأطباق غلة عينة واحدة. إجراء عزل مرناً والتحول من كدنا وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s-
- تقنيات إيمونوبلوت
- "أداء اسطوانات الغربية يقوم" التحقيق في تغيرات في التعبير البروتين (مثلاً، سويبروسين-1) أثناء زراعة أرفك. استخدام الثقافة صحن واحد (1 مل) كل عينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cardiomyocytes الكبار في الثقافة: ويبين الشكل 1 نظرة عامة cardiomyocytes الكبار طازجة معزولة ح 2 بعد الغسيل الأخير. وكان حوالي 75% من جميع كارديوميوسيتيس التشكل على شكل قضيب. وأظهرت نسبة 25 في المائة المتبقية مظهر غير عادية مع مورفولوجيا جولة وغشاء الخلية لا يمكن كشفها سليمة (الشكل 1). في نهاية زراعة (اليوم السادس)، ما يصل إلى 15 في المائة من جميع كارديوميوسيتيس وأظهرت نشر، حوالي 10% ظلت في مورفولوجيا جولة دون هياكل pseudopodia مثل، و 75 في المائة من جميع كارديوميوسيتيس قدم مظهر غير عادي مع سطح غير نظامية ودون يمكن كشفها غشاء الخلية سليمة (البيانات لا تظهر).
رقم 1: نظرة عامة على الفئران المعزولة طازجة كارديوميوسيتيس. جزء يسير كارديوميوسيتيس طازجة المعزولة التي أظهرت التشكل على شكل قضيب بلغت 75% كارديوميوسيتيس، في المتوسط. 25 في المائة المتبقية من الخلايا قدم مظهر غير عادية سطح غير نظامية ولا غشاء الخلية سليمة قابلة للاكتشاف. أجرى تسجيل الخفيفة الميكروسكوب ح 2 بعد الغسيل كارديوميوسيتيس طازجة معزولة. الخفيفة الميكروسكوب 2 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
مع الفحص المجهري الخفيفة، ظهرت أرفك طازجة معزولة على شكل قضيب وحوالي 100 ميكرومتر في الحجم (الشكل 2A). أرفك أن العقد تلقائياً لا الكالسيوم متسامح طازجة معزولة. كافة الخلايا التي كانت جولة ودون غشاء الخلية سليمة قابلة للاكتشاف كانت تالفة وغير قابلة للتطبيق (الشكل 2 أ-ب). وفي الأيام التالية، فقدت معظم قضيب على شكل أرفك هذا التشكل. حصلت على تقريب الخلايا بغشاء الخلية سليمة قابلة للاكتشاف. وكانت هذه أرفك قابلة للحياة. بدءاً من اليوم ثلاثة خلايا هذه الأخيرة تشكيل هياكل مثل بسيودوبوديا. بعض من هذه أرفك الاحتفاظ بمظهرها مستدير أثناء نشر (الشكل 2). تحويل الآخرين إلى مسطحة، أرفك متعددة الأشكال (الشكل 2).
رقم 2: عزل cardiomyocytes الفئران. (أ) أرفك طازجة معزولة كانت عادة قضيب على شكل. (ب) بعد ستة أيام في الثقافة، هياكل pseudopodia مثل (نشر) بوضوح قابلة للكشف في أرفك الآن تقريب. بعض أرفك تغيرت تماما إلى التشكل على نطاق واسع. عرض أرفك مع مظهر غير عادية سطح غير نظامية ولا غشاء الخلية سليمة قابلة للاكتشاف. الخفيفة الميكروسكوب 10 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
كانت أرفك عادة قضيب على شكل مع سترييشن عبر مرئية بوضوح (الشكل 3، يوم 0) طازجة معزولة. ولوحظت تغييرات في مورفولوجيا الخلايا خلال الأيام التالية في الثقافة. أولاً، أرفك فقدت كل ما بها من عناصر الهوس (الشكل 3أيام 1 و 2). وأعقب هذا إصلاح، تورط ساركوميروجينيسيس دي نوفو . وسبقت الإصلاح وتشكيل هياكل pseudopodia مثل (نشر، الرقم 3، 3 أيام إلى 6). ساركوميروجينيسيس نوفو دي بدأت مع ظهور الألياف الإجهاد أكتين (الشكل 3، 3 يوم). بالإضافة إلى ذلك، حزم أكتين ظهرت في منطقة بيرينوكلير، وشكلت حديثا تجميعها ساركوميريس (الشكل 3، أيام 4 و 5). الأخيرة نمت على طول ألياف الأكتين بريفورميد الإجهاد في المحيط (الشكل 3، 6 يوم). في نهاية فترة زراعة (6a يوم)، سترييشن عبر نموذجية من ساركوميريس المجمعة حديثا في الانتشار لوحظ أرفك.
الشكل 3: تلطيخ Fluorescence. دي-وإعادة-ديفيرينتييشن أرفك في الثقافة مع السفح 20% تظهر. طازجة معزولة أرفك مع شكلها رود نموذجية (يوم 0) أصبح جولة اللاإنسانية ساركوميريس خلال الأيام الأولى من الثقافة (1 يوم). أنهم فقدوا جميع العناصر الخاصة بهم الهوس (2 يوم) متبوعاً بتشكيل هياكل pseudopodia مثل (نشر؛ 3-5 أيام) والإصلاح اللاحقة من عناصرها الهوس تشير إلى نوفو دي ساركوميروجينيسيس (اليوم 6). في يوم ستة في الثقافة، عبر سترييشن كان وضوح قابلة للكشف مرة أخرى (يوم 6a). تلطيخ مع فالويدين-تريتك وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة؛ "سهام": هياكل مثل بسيودوبوديا (على سبيل المثال أظهرت)؛ *: حزم أكتين في منطقة بيرينوكلير (المثالي هو موضح). يتم نشر أجزاء من هذا الرقم في11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
يعرض الرقم 4 الحركية لعملية نشر أثناء الحرث. يتم إعطاء جزء يسير أرفك عرض هياكل مثل بسيودوبوديا في كل وقت للفحص تنتشر في المائة (الشكل 4). نشر بدأت حوالي ثلاثة أيام وارتفعت باستمرار خلال فترة زراعة. 14.7 وأظهرت % ± 1.39 في المائة من جميع الأصوات التي تم فرزها أرفك pseudopodia مثل هياكل بعد ستة أيام في زراعة.
الشكل 4: نشر زيادة الحركية في cardiomyocytes مع هياكل pseudopodia مثل تطبيع لجميع كارديوميوسيتيس الأصوات التي تم فرزها (نشر في المائة) خلال ستة أيام وقت زراعة (n = 33 الخلية الاستعدادات). وترد البيانات يعني ± sem. يتم نشر هذا الرقم في11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تأثير إيونوميسين على نشر أرفك: عزلة وزراعة أرفك هو1،عملية حساسة كالسيوم8. علاج أرفك مع إيونوميسين (1 ميكرومتر)، مما يزيد من تركيز الكالسيوم داخل الخلية، تسبب انخفاضا كبيرا (ف ≤0.01) في تشكيل هياكل pseudopodia مثل مقارنة بعناصر التحكم (الشكل 5). عند مقارنة مباشرة، أظهرت ± % 17-19 تتولى 2.45 في المائة من جميع الأصوات التي تم فرزها أرفك نشر تحت ظروف التحكم ولكن فقط 9.87 في المائة ± 2.77 في المائة من جميع الأصوات التي تم فرزها أرفك تشكيل هياكل pseudopodia مثل حضور إيونوميسين (يوم 6 من زراعة). وهكذا، خفض إيونوميسين ينتشر بنسبة 42.58%.
= fo:keep "jove_content"-together.within-صفحة = "1" >
الرقم 5: نشر حركية تحت العلاج مع إيونوميسين- بسبب المعاملة مع إيونوميسين (1 ميكرومتر) في اليوم 0 تخفيضاً كبيرا جداً في الخلية نشر مقارنة بالتحكم. وترد البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة؛ n = 4 خلية التحضيرية؛ اختبار مان-ويتني يو؛ * ≤0.05 p؛ * * ف ≤0.01 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
بالإضافة إلى ذلك، إيونوميسين زيادة النسبة المئوية أرفك مع مظهر غير عادي مقارنة بظروف التحكم (الشكل 6). في يوم ستة، 71.11% ± 4.65% لكل حساب أرفك التعامل مع إيونوميسين وأظهر مظهر غير عادي. ومع ذلك، تحت ظروف التحكم، صنفت فقط 51.35% ± 3.55 في المائة من أرفك في هذه المجموعة.
رقم 6: أرفك مع مظهر غير صحية- المعاملة مع إيونوميسين (1 ميكرومتر) في اليوم 0 أدى إلى زيادة كبيرة في عدد أرفك، الذي أظهر مظهر غير عادي. في يوم 6، كان الفرق بين الرقابة وتعامل مع إيونوميسين أرفك كبيرة. وترد البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة؛ n = 4 خلية التحضيرية؛ اختبار مان-ويتني يو؛ * ف ≤0.05 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
في اليوم الثالث من زراعة، تحت العلاج مع إيونوميسين، كشف بكر قرت انخفاضا في التعبير مرناً β-MHC (≤0.01 ف) و OSM، التي تقوم بدور متميز في التفريق بين دي أرفك (الشكل 7 ألف و جيم). سويبروسين-1، علامة للتفريق بين إعادة أرفك بكثير دوونريجولاتيد، جداً (الشكل 7).
الشكل 7: دي-وإعادة-ديفيرينتياتيون أرفك المزروعة تحت العلاج مع إيونوميسين
(1 ميكرومتر) في اليوم 0 تسببت انخفاض مرناً التعبير عن oncostatin م (OSM) و β-MHC، كلاهما الاضطلاع بأدوار رئيسية في التفريق بين كارديوميوسيتيس الكبار دي- بالإضافة إلى ذلك، انخفضت التعبير مرناً سويبروسين-1، لاعب رئيسي في التفريق بين إعادة cardiomyocytes الكبار، كان أيضا بالعلاج إيونوميسين. 3 يوم من الزراعة؛ وترد البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة؛ n = 30 خلية ثقافة لوحات كل مجموعة؛ اختبار مان-ويتني يو؛ * ≤0.05 p؛ * * ف ≤0.01 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المتوسطة ما قبل الطلاء |
| 20 مل CCT المتوسطة |
| 2% المجلد البنسلين/ستربتوميسين (400 ميكروليتر) |
| المجلد 4% FCS (800 ميكروليتر) |
| تصفيح المتوسطة |
| 20 مل CCT المتوسطة |
| 2% المجلد البنسلين/ستربتوميسين (400 ميكروليتر) |
| المتوسطة الغسيل |
| 20 مل CCT المتوسطة |
| 2% المجلد البنسلين/ستربتوميسين (400 ميكروليتر) |
| ملاحظة: FCS vol. 4% في المتوسط قبل الطلاء يمكن الاستعاضة عن لامينين Vol.-% 1 (0.5 ميكروغرام/سم2). بالإضافة إلى ذلك، لزراعة كارديوميوسيتيس لعدة أيام إضافة 20 Vol.-% FCS إلى المتوسطة الغسيل. تخزين الطلاء المتوسطة والمتوسطة الغسيل قبل 4-8 درجة مئوية حتى باستخدام. |
الجدول 1: ثقافة الوسائط المستخدمة لعزل كارديوميوسيتي
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتأثر سلوك cardiomyocytes الكبار في فيفو بكثير من التفاعلات مع خلايا أخرى (مثلاً، الخلايا العصبية، خلايا بطانية، والخلايا الليفية، الخلايا الملتهبة) وسينسيتيوم الكهربائية التي تشكل1. ولذلك يتطلب دراسة التكيف مع الإجهاد من كارديوميوسيتيس الكبار حصرا بالعزلة وزراعة أرفك. الآثار الرئيسية لعزل وزراعة أرفك: 1) قطع المصفوفة خارج الخلية وخلية خلية الاتصالات؛ 2) قطع اتصالهم من المحفزات الهوس؛ 3) إجبارهم على التكيف مع محيط ثنائي الأبعاد من أنسجة ثلاثية الأبعاد. في ظل هذه الظروف، أرفك بدء دي وإعادة differentiation كما هو موضح أعلاه، وإجراء تعديلات متعددة، التي تعتبر أيضا خلال القلب يعيد البناء في فيفو (β-أدرينوسيبتور الحساسية، إعادة التجميع ساركوميريس، و ما إلى ذلك) 4-ولذلك عزلة cardiomyocytes الكبار يمثل وسيلة صالحة للتحقيق في هذه الخلايا واستجابتها للعلاجات المختلفة. هذه الأفكار يمكن استخدامها بعد ذلك في فيفو التجارب، مما سيساعد في تجنب تجارب لا داعي لها، وخفض عدد الحيوانات الاختبار. ومن المؤكد أن بعض النتائج التي توصل إليها ينظر في المختبر لن يحدث في فيفو (مثلاً، تشكيل هياكل مثل pseudopodia). الخلية-الخلية-جهات الاتصال الموجودة داخل سينسيتيوم الكهربائية سيعيق النمو المفرط في ظل الظروف الفسيولوجية17. ومع ذلك، يمكن استخدام أرفك معزولة والمزروعة للتحقيق في سلوك cardiomyocytes الكبار. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء المحاكمات الأولى لاستراتيجيات جديدة للعلاج ضد أمراض القلب في البشر مع أرفك.
يحتوي الأسلوب وصف لعزل وزراعة كارديوميوسيتيس الكبار على بعض النقاط الحرجة. للحصول على نتائج ناجحة، البنود التالية يجب أن تؤخذ.
1-التسامح الكالسيوم: تاريخيا، التسامح الكالسيوم من كارديوميوسيتيس الكبار كان واحداً من أهم العوامل التي تؤدي إلى نجاح العزل وزراعة كارديوميوسيتيس الكبار1،7، 8-في الوقت الحاضر، يتم تأسيس بروتوكولات لضمان زراعة تحت الظروف الفسيولوجية الكالسيوم1،3. وتبين هذه المخطوطة تأثير تركيز الكالسيوم داخل الخلايا المتغيرة على نوعية أرفك معزولة. إيونوميسين، مما يزيد من تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا، تسبب انخفاضا كبيرا في نشر وزيادة كبيرة في عدد كارديوميوسيتيس مع مظهر غير عادي. وعلاوة على ذلك، تسببت downregulation علامات رئيسية للقلب دي-وإعادة-differentiation: β-MHC، OSM، وسويبروسين-1. ولذلك، تغيير تركيز الكالسيوم داخل الخلية أثناء زراعة يعوق قدرة أرفك على التكيف مع البيئات الجديدة. على الرغم من أن بعض أرفك كانت قادرة على نشر وتكييف (9.87 في المائة ± 2.77 في المائة من جميع الأصوات التي تم فرزها أرفك؛ الشكل 5)، إجراء تحقيق دقيق في أرفك في ظل هذه الظروف أمر غير ممكن. ونتيجة لذلك، ينبغي أن تستخدم بروتوكولا كالسيوم المتبعة لعزل الدقيقة وزراعة أرفك. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي التأكد من أن أيا من العلاجات التحقيق تتعارض مع الأرقاء الكالسيوم من أرفك.
2-كولاجيناز: هناك مجموعات مختلفة من كولاجيناز المتاحة. كل دفعة يبين الاختلافات في نوعية وفعالية1. ولذلك، يوصي المؤلفون بترتيب وفحص عينات دفعات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم وقت الهضم، ومقدار كولاجيناز من كل دفعة جديدة الاحتياجات يتم تقييم كل على حدة. تبعاً لذلك، يمكن أن تختلف بتركيز ووقت الهضم في البروتوكول وصف قليلاً للبروتوكولات الأخرى.
3- الوقت حتى نضح القلب: الوقت بين استخراج القلب من الجسم وبدء التروية مع نظام لانجيندورف لضمان جودة عالية من أرفك، ينبغي أن تكون قصيرة قدر الإمكان. فترة طويلة يسبب ضررا للقلب ويؤدي إلى عدد أكبر من أرفك غير قابل للحياة.
بالإضافة إلى ذلك، الاحترار الحل التروية أثناء التروية والهضم لمدة 5 دقائق بعد تقطيع الأنسجة لا بد أن تسفر عن نتيجة جيدة. لتجنب أضرار لا داعي لها للأنسجة البيولوجية، فإنه ينبغي التعامل معها بعناية عند أعلى نقطة. وعلاوة على ذلك، ينبغي الإشارة إلى أن المعاملة مع OSM أو تركيزات أقل من السفح أيضا تمكين أرفك من دي وإعادة ديفيرينتياتي4،10،،من1819. ومع ذلك، دون هذه العلاجات التغذوية، أرفك تتدهور خلال بضعة أيام2.
وفي الختام، عزلة وزراعة أرفك هو أسلوب حساسة التي تقدم مجموعة متنوعة من إمكانيات للتحقيق في سلوك الكبار cardiomyocytes حصرا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أظهرت النتائج جزء من رسالة الدكتوراه من [فرنزيسكا نيبيرت.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون نادين ويتاسكي وبيتر فولك للمساعدة التقنية. بالإضافة إلى ذلك، يشكر المؤلفون السيدة كلوديا لورينز (الكاتب الطبية، أكسيديس) لمساعدتها في إعداد المخطوطة. هذه المخطوطة كانت تدعمها ماليا DFG (شلو 324/7-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -D. Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , Springer International Publishing AG Switzerland. (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. Fabbro, D., McCormick, F. 290, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P.
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , Garland Science Taylor and Francis Group. New York, NY. (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
