Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC). ARVC isolata può essere utilizzato per la coltivazione di breve e lungo termine. L'isolamento e la coltura di ARVC possono giocare un ruolo chiave nello sviluppo di nuovi regimi di trattamento per malattie cardiache.
Abstract
In un cuore intatto, celle adiacenti influenzano cardiomiociti adulti. Con il metodo di isolamento e coltura dei cardiomiociti adulti, è possibile una valutazione dettagliata del comportamento di queste cellule nell'ambito di trattamenti specifici e di ambienti. Questo manoscritto presenta un protocollo per l'isolamento di successo e coltivazione dei cardiomyocytes ventricolari di ratto adulto (ARVC).
Il ratto è sacrificato dalla dislocazione cervicale sotto anestesia profonda. Quindi, viene estratto il cuore e l'aorta è scoperto. Successivamente, viene eseguita aspersione sul sistema di perfusione di Langendorff con deplezione di calcio e trattamento collagenasi. In seguito, tessuto ventricolare ottiene macinata, ricircolo e filtrata, seguita da tre fasi di centrifugazione con graduale aggiunta di CaCl2 finché non viene raggiunta la concentrazione fisiologica di calcio. ARVC sono placcati su piastre di coltura delle cellule. Dopo l'aggiornamento il mezzo di coltura cellulare, ARVC può essere coltivata fino a sei giorni senza cambiare il mezzo di coltura contenente siero. Isolamento di ARVC è un processo delicato di calcio. Piccoli cambiamenti nella concentrazione intracellulare di calcio causano una diminuzione della qualità e la vitalità delle cellule isolate.
Appena isolato ARVC sono a forma di asta. Entro i primi giorni di coltivazione perdono l'asta-a forma di forma e morfologia pseudopodi-come le strutture (diffusione). Durante questa formazione morfologica ARVC degradare inizialmente loro elementi contrattili, seguite da una riforma attraverso fibre di actina stress e de novo sarcomerogenesis. Dopo una settimana di coltivazione, la maggior parte ARVC mostrano un aspetto diffuso con una striatura trasversale chiaramente rilevabile. Questo processo è sensibile alla concentrazione intracellulare di calcio, come il trattamento con ionomicina attenua la diffusione. Catena pesante β-miosina (β-MHC), oncostatin M (OSM) e swiprosin-1 (EFHD2) sono indicatori chiavi in questo processo di de - e re - differentiation. Studi recenti hanno suggerito che cardiaco re e de differentiation che si verificano in condizioni di coltura imita caratteristiche visto in vivo durante il ritocco cardiaco. Di conseguenza, isolamento e coltura di ARVC gioca un ruolo chiave nella comprensione della biologia dei cardiomiociti.
Introduction
Cardiomiociti adulti in vivo funziona come un sincizio elettrico basato su contatti cellula-cellula fra miociti. Inoltre, sono influenzati da celle adiacenti come fibroblasti cardiaci, cellule endoteliali, neuroni e cellule infiammatorie1. Al fine di studiare la capacità dei cardiomiociti di adeguare la loro organizzazione intracellulare di alterate condizioni di carico, come si è visto durante l'ipertrofia cardiaca, che è un passo iniziale che porta a insufficienza cardiaca, l'isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC) sono necessario2,3,4. Storicamente, cardiomiociti in primo luogo sono stati isolati da pulcino embrionali cuori5,6. Pochi anni dopo, il primo isolamento di cardiomiociti terminalmente differenziati è stata descritta utilizzando calcio svuotamento7. Tuttavia, questi cardiomiociti adulti non erano calcio tollerante e non potevano essere usati per saggi funzionali. Infine, nel 1976 un nuovo protocollo abilitato Powell e Twist per indagare su cardiomiociti adulti ventricolari sotto condizioni fisiologiche8. Come primo passo, hanno isolato cardiomiociti adulti sotto le concentrazioni basse del calcio e calcio in seguito aumentato a concentrazioni fisiologiche in una procedura graduale. Oggi, maggior parte dei protocolli per l'isolamento e la coltura di cardiomiociti adulti lavoro con questo protocollo di calcio e utilizzare collagenasi per la digestione enzimatica della cellula-cellula densa contatti1.
Per una coltivazione di successo, è necessario il siero fetale di vitello (FCS) o oncostatin M (OSM). ARVC eseguire un de - e re - differentiation con vasti cambiamenti strutturali tra cui sarcomero smontaggio e riforma9,10,11,12. Questo processo è accompagnato da una ri-espressione dei geni di tipo fetale, come β-miosina catena pesante (β-MHC), come noto da ipertrofia e una formazione di pseudopodi-come le strutture, anche chiamato diffusione4,11, 13. Inoltre, swiprosin-1 (EFHD2), una proteina di recente identificazione, svolge un ruolo importante nel processo di re-differenziazione di coltivato ARVC11. Di conseguenza, ARVC nella cultura trasformare nelle cellule polimorfiche, diffuse, che spontaneamente mostrano contrazioni dopo due o tre settimane nella cultura2,4,14.
Recenti scoperte hanno rivelato che cardiaco re e de differentiation come si verifica in condizioni di coltura imita caratteristiche visto in vivo durante il rimodellamento cardiaco10,15. Rimodellamento cardiaco è un processo chiave durante malattie cardiache16. Come le malattie cardiache sono ancora la principale causa di morte nelle società industrializzate, una migliore comprensione della biologia dei cardiomiociti adulti è importante (OMS; 2015). Isolamento e coltura di ARVC può aiutare a sviluppare nuove strategie e medicinali per il trattamento delle malattie cardiache. Con questo manoscritto, un protocollo per l'isolamento e la coltura di ARVC è fornito. Inoltre, alcune parti critiche di questo metodo sono evidenziate nella sezione discussione.
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Protocol
l'indagine è condotta secondo la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicato da la US National Institute of Health (NIH pubblicazione n. 85-23, rivisto 1996). In generale, ratti maschii di wistar invecchiati 3-4 mesi e con un peso medio di 250-350 g vengono utilizzati per questo protocollo. Un cuore di ratto è sufficiente per 20 piastre di coltura (1 mL per ogni piatto; diametro interno: 35 mm) con una densità approssimativa delle cellule di 1.5 x 10 4 cellule/1000 millimetri 2.
1. preparazione dei terreni e reagenti
- Creatina-Carnitina-taurina medio (medio CCT)
Nota: CCT medium è un mezzo complesso basato su medium 199 con l'aggiunta di creatina, carnitina e taurina.- Preparare 1 L di medium 199: aggiungere 3,6 g Hepes e mescolare per 1 h. Quindi aggiungere 655,5 mg creatina (5 mM), carnitina 395,4 mg (2 mM) e taurina 625,5 mg (5 mM). Carnitina e taurina cambiare pH a < 7. Al fine di inibire la crescita di cellule contaminanti, ad es. cellule endoteliali o fibroblasti, aggiungere 10 µM citosina β-D-arabinofuranoside al mezzo. Regolare il pH con NaOH (2 mM) per filtro 7,4 e sterile il mezzo. Conservare il mezzo CCT a 4 ° C.
- Medio di Powell
- per 1 medio L Powell, sciogliere 6,43 g NaCl (110 mM) con 0,19 g KCl (2,5 mM), 0,16 g KH 2 PO 4 (1,2 mM), 0,3 g MgSO 4 7 H 2 O (1,2 mM), 5,96 g Hepes (25 mM) e 1,98 g D (+ )-Glucosio monoidrato (10 mM) in Aqua sterile. Regolare il pH con NaOH (2 M) al filtro 7,4 e sterile il mezzo. Conservare il medium Powell a 4 ° C.
- Cloruro di calcio (CaCl 2)
- preparare una soluzione di 100 mM CaCl 2 (50 mL) e preparare aliquote contenente 500 µ l CaCl 2. Congelare aliquote a -20 ° C.
- Preparazione del terreno di coltura
- preparare tre cellule di coltura: pre-placcatura medie, medie di placcatura e lavaggio medio. Utilizzo medio CCT come base per tutti i tre Medium (tabella 1). Calcolare medie CCT con 1 mL / piastra di coltura. Quindi, preparare 20 mL di terreno di CCT per 20 piastre di coltura (diametro interno: 35 mm).
- Cella cultura piastre: cappotto ogni piastra di coltura delle cellule (diametro interno: 35 mm) con 1 mL pre-placcatura medio. Conservare le piastre a 37 ° C durante la notte o per almeno 2 h prima dell'uso.
2. Isolamento di cardiomiociti adulti
- sistema di perfusione di preparazione di Langendorff
- di calore medio di placcatura e lavaggio medio a 37 ° C. scongelare un tubo di 500 µ l CaCl 2 e pesare 25 mg di collagenasi.
- A filo il sistema di perfusione di Langendorff con aqua sterile, lasciate in seguito medio di Powell circolare del sistema per 5 min.
- Riempire il sistema di perfusione di Langendorff con 80 mL di mezzo di Powell senza qualsiasi aria bolle e gas il mezzo con 95% di ossigeno.
- Preparare una provetta (50 mL) con 40 mL di mezzo di Powell, riscaldare fino a 37 ° C e gas con 95% di ossigeno.
- Preparare un filo di circa 25 cm di lunghezza per il collegamento di cuore rimosso alla cannula.
- Sgrassare una lama di rasoio con alcool (70% in volume) e fissarlo all'elicottero. Fissare un disco di plastica nel chopper.
- Estrazione del cuore
- anestetizzare un ratto wistar maschio con 4-5% isoflurane e sacrificalo con dislocazione cervicale. Aprire l'addome dietro l'arco costale con un taglio addominale e, con lo stesso paio di forbici, tagliare attraverso il diaframma per aprire la cassa toracica.
- Rimuovere il cuore, insieme con il polmone e timo, tagliando sopra il timo altamente cranico nella cavità toracica. Trasferire il materiale a soluzione salina ghiacciata immediatamente.
- Rimuovere il polmone e timo dal cuore con una forbice per dissezione (grande) e di fissazione del materiale con il forcipe capsula, trasferire a quest'ultimo a una nuova soluzione salina.
- Isolamento
- rimuovere il tessuto in eccesso, come residui di timo, della trachea, grasso e tessuto connettivo dal cuore utilizzando capsule pinze e forbici per dissezione (grandi o piccole). Scoprire l'aorta e si divide con una forbice per dissezione (grande o piccola) tra il primo e in secondo luogo branchial Arch.
- Avviare il gocciolamento dell'apparato di aspersione di Langendorff. Posto nel cuore della cannula dell'apparato di aspersione di Langendorff e fissare lo sguardo in primo luogo con un morsetto a coccodrillo e successivamente con il thread pronto. Sciacquare il cuore fino a quando non è priva di sangue.
- Sciogliere 25 mg collagenasi in 5-6 mL di liquido caldo di Powell e aggiungere 12,5 µ l CaCl 2 (30 µM).
- Chiudere circolazione spostando un imbuto di vetro, che è collegato con il sistema di perfusione di Langendorff, sopra il cuore di gocciolamento e aggiungere la collagenosi risolto per il sistema di perfusione. Iniziare la perfusione per 25 min con una velocità di discesa di 1 goccia al secondo.
Nota: Durante l'aspersione, il cuore si gonfiano e ottenere un aspetto ceroso. - Interrompere la perfusione dopo 25 min e togliere il cuore del sistema di aspersione di Langendorff. Rimuovere l'aorta, atrii e tessuto connettivo dal cuore e aprire i ventricoli destro e sinistro.
- Tritare il cuore due volte ad un angolo di 90° (larghezza di taglio: mm 0,7; velocità: 0,15 cm/s). Ripetere questo processo manualmente con due bisturi per 10 s ogni lato.
- Trasferire 12 mL di terreno di aspersione in una nuova provetta (50 mL). Versare i residui delle cellule in queste cellule medie e digest per altri cinque minuti a 37 ° C. Mix la soluzione ogni minuto.
- Filtrare la soluzione con il cuore digerito attraverso una rete di nylon (200 µm) in una nuova provetta (50ml).
- Centrifugare la soluzione filtrata a 29 x g per 3 min. scartare il sopranatante e aggiungere 6 mL di terreno caldo Powell cui 12,5 µ l CaCl 2 (250 µM) per il pellet cellulare. Risospendere il pellet attraverso movimenti di agitazione. Centrifugare nuovamente a 29 x g per 2 min. scartare il sopranatante e aggiungere 6 mL caldo medio Powell sostituito con 25 µ l CaCl 2 (500 µM). Sciogliere il pellet cellulare attraverso delicati movimenti di agitazione e aggiungere 12 mL caldo Powell media tra cui 120 µ l CaCl 2 (1 mM). Centrifuga per la terza volta a 16 x g per 1 min. Ancora una volta, rimuovere il sopranatante.
- Mescolare il pellet cellulare con il mezzo di placcatura preriscaldata.
- Rimuovere il mezzo di pre-placcatura da piastre di coltura. Trasferire 1 mL di mezzo, compresi i cardiomiociti isolati, per ogni piastra di coltura di placcatura. Incubare i cardiomiociti isolati freschi a 37 ° C per 1 h.
- Togliere la soluzione di placcatura da piastre di coltura. Aggiungere 1 mL di media per ogni piastra di coltura di lavaggio e memorizzare le piastre a 37 ° C fino a sei giorni senza cambiare mezzo.
- Per indagare l'influenza di diverse sostanze chimiche e trattamenti su ARVC, prima di aggiornare placcatura media media di lavaggio e successivamente aggiungendo diverse sostanze chimiche.
Nota: Valutazione con microscopia chiara: con ogni preparazione delle cellule, devono essere monitorati cardiomyocytes 150 a 300 al giorno da microscopia chiara. Suddividere tutti contati cardiomiociti in gruppi secondo il loro aspetto (ad es., " asta-a forma di ", " arrotondare per difetto ", " diffusione ", e " apparenza insolita "). La categoria " diffusione " include tutti i cardiomiociti con pseudopodi-come le strutture. " Apparenza insolita " comprende tutti i ARVC con una superficie irregolare e non rilevabile membrana cellulare intatta.
3. Esempio Esperimenti
- fluorescenza/immunofluorescenza di cardiomiociti adulti
- analizza le conversioni morfologiche e strutturale di ARVC durante la coltivazione da microscopia laser confocale. Utilizzare falloidina-TRITC per indagare strutture di F-actina in " asta-a forma di ", " arrotondare per difetto ", e " diffusione " ARVC. Eseguire la colorazione secondo il produttore ' protocollo s. Un esempio per la colorazione falloidina-TRITC è dato in riferimento Nippert et al. 11. con fluorescenza/immunofluorescenza, differenze in differentiation de e re dell'apparato contrattile nei cardiomyocytes coltivati adulto tra trattamenti sperimentali (ad es., con Swiprosin-1, Ionomicina) possono essere investigate.
- Real-Time RT-PCR quantitativa (qRT-PCR)
- eseguire qRT-PCR per studiare i cambiamenti nell'espressione di mRNA di geni diversi (ad es., OSM, Swiprosin-1, β-MHC) durante la coltivazione di ARVC. Per dimensione del campione sufficiente, utilizzare piastre di coltura più grandi (diametro interno: 60 mm) con 2 mL di volume. ARVC di cinque piatti di cultura produce un campione. Eseguire l'isolamento di mRNA e la trasformazione del cDNA secondo il produttore ' protocollo s.
- Tecniche Immunoblot
- eseguire Western Blots per studiare i cambiamenti nell'espressione della proteina (ad es., per Swiprosin-1) durante la coltivazione di ARVC. Utilizzare una piastra di coltura (1 mL) per esempio.
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Representative Results
Adulti cardiomiociti in coltura: La figura 1 Mostra una panoramica di recente isolate cardiomiociti adulti 2 h dopo l'ultimo lavaggio. Circa il 75% di tutti i cardiomiociti aveva una morfologia a forma di bastoncello. Il restante 25% ha mostrato un aspetto insolito con una morfologia rotonda e non rilevabile membrana intatta di cella (Figura 1). Alla fine della coltivazione (giorno 6), fino al 15% di tutti i cardiomiociti ha mostrato diffusione, circa il 10% è rimasto in una morfologia rotonda senza pseudopodi-come le strutture, e 75% di tutti i cardiomiociti ha presentato un aspetto insolito, con una superficie irregolare e senza una membrana delle cellule intatta rilevabile (dati non mostrati).
Figura 1: Panoramica di recente isolate ratto cardiomiociti. La frazione di recente isolate cardiomiociti che ha mostrato una morfologia a forma di bastoncello ammontava a 75% di cardiomiociti, in media. Il restante 25% delle cellule ha presentato un aspetto insolito con una superficie irregolare e non rilevabile membrana delle cellule intatta. Registrazione è stata condotta da microscopia chiara 2 h dopo il lavaggio i cardiomiociti isolati appena. La microscopia chiara 2 ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Con microscopia chiara, appena isolate ARVC è apparso rod a forma e dimensioni (Figura 2A) di circa 100 µm. Appena isolato ARVC che si contraggono spontaneamente non erano calcio tollerante. Tutte le cellule che erano tondo e senza membrana delle cellule intatta rilevabile sono stati danneggiati e non vitali (Figura 2A-B). Nei giorni seguenti, la maggior parte dell'asta a forma di ARVC perso questa morfologia. Le cellule ha arrotondate con una membrana delle cellule intatta rilevabile. Questi ARVC erano vitali. A partire da tre giorni le cellule posteriori formata pseudopodi-come le strutture. Alcuni di questi ARVC mantenuto il loro aspetto arrotondato durante diffusione (Figura 2B). Altri convertiti in piatto, ARVC polimorfici (Figura 2B).
Figura 2: Isolated cardiomyocytes del ratto. (A) ARVC recente isolati sono stati in genere bastoncello. (B) dopo sei giorni nella cultura, erano chiaramente rilevabili nella ARVC ora arrotondati pseudopodi-come le strutture (diffusione). Alcuni ARVC completamente cambiato per una morfologia diffusa. ARVC con un'apparenza insolita visualizzata una superficie irregolare e non rilevabile membrana delle cellule intatta. La microscopia chiara 10 ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Appena isolato ARVC erano in genere tondino sagomato con una striatura trasversale chiaramente visibile (Figura 3, giorno 0). Cambiamenti nella morfologia delle cellule sono stati osservati durante i giorni seguenti nella cultura. In primo luogo, ARVC perso tutti i loro elementi contrattili (Figura 3, giorni 1 e 2). Ciò è stata seguita da una riforma, implicando de novo sarcomerogenesis. La riforma è stata preceduta dalla formazione di pseudopodi-come le strutture (diffusione, Figura 3, giorni 3-6). De novo sarcomerogenesis iniziato con la comparsa di fibre di stress di actina (Figura 3, giorno 3). Inoltre, fasci di actina è comparso nella regione perinucleare e formata recentemente assemblato sarcomeri (Figura 3, giorni 4 e 5). Quest'ultimo è cresciuto lungo le fibre di actina preformato stress in periferia (Figura 3, giorno 6). Alla fine del periodo di coltivazione (6a giornata), è stata osservata una tipica striatura trasversale da sarcomeri appena assemblati nella diffusione ARVC.
Figura 3: fluorescenza macchiatura. La de - e re - differentiation di ARVC nella cultura con 20% FCS è mostrato. Appena isolato ARVC con la loro forma tipica asta (giorno 0) è diventato rotondo degradando sarcomeri durante i primi giorni della cultura (giorno 1). Hanno perso tutti i loro elementi contrattili (giorno 2) seguiti dalla formazione di pseudopodi-come le strutture (diffusione; Giorni 3-5) e la successiva riforma dei loro elementi contrattili che indica sarcomerogenesis de novo (giorno 6). Al sesto giorno nella cultura, striatura trasversale era chiaramente rilevabile nuovamente (6a giornata). Colorazione con falloidina-TRITC secondo il protocollo del produttore; "frecce": pseudopodi-come le strutture (esempio); *: fasci di actina nella regione perinucleare (esemplare illustrato). Parti di questa figura sono pubblicati in11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 Visualizza la cinetica del processo di diffusione durante la coltivazione. La frazione di ARVC risultati pseudopodi-come le strutture in ogni momento dell'esame è dato come diffusione in % (Figura 4). Diffusione iniziato circa tre giorni e ha aumentato costantemente durante il periodo di coltivazione. 14,7% ± 1,39% di ARVC contati tutti hanno mostrato pseudopodi-come le strutture dopo sei giorni in coltivazione.
Figura 4: diffusione cinetico aumento nei cardiomyocytes con pseudopodi-come le strutture normalizzate in tutti i cardiomiociti contati (diffusione in %) durante sei giorni di tempo di coltivazione (n = 33 preparazioni di cellule). I dati sono presentati come mezzi ± SEM Questa figura è pubblicata in11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Effetto di ionomicina sulla diffusione di ARVC: L'isolamento e la coltura di ARVC è un processo delicato di calcio1,8. Trattamento di ARVC con ionomicina (1 µM), che aumenta la concentrazione di calcio intracellulare, ha causato una diminuzione significativa (p ≤ 0,01) nella formazione di pseudopodi-come le strutture rispetto ai controlli (Figura 5). Quando confrontato direttamente, 17,19% ± 2,45% di tutti i contati ARVC ha mostrato diffusione nelle circostanze di controllo ma solo 9,87% ± 2,77% di tutti i contati ARVC formato pseudopodi-come le strutture in presenza di ionomicina (giorno 6 di coltivazione). Così, Ionomicina ridotta diffusione 42,58%.
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Figura 5: diffusione cinetica nell'ambito del trattamento con lo ionomycin. Trattamento con ionomicina (1 µM) al giorno 0 ha causato una riduzione altamente significativa nella cella diffusione rispetto al controllo. I dati sono presentati come mezzi ± SEM; n = 4 preparazioni di cellule; Test di Mann-Whitney-U; * p ≤ 0.05; * * p ≤ 0,01 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Inoltre, Ionomicina ha aumentato la percentuale di ARVC con un'apparenza insolita rispetto alle condizioni di controllo (Figura 6). Al giorno sei, 71,11% ± 4,65% di tutti i contati ARVC trattati con ionomicina ha mostrato un aspetto insolito. Tuttavia, in condizioni di controllo, solo 51,35% ± 3,55% dell'ARVC sono stati categorizzati in questo gruppo.
Figura 6: ARVC con un aspetto malsano. Trattamento con ionomicina (1 µM) al giorno 0 ha causato un aumento significativo del numero di ARVC, che ha mostrato un aspetto insolito. Al giorno 6, la differenza tra controllo e ARVC trattati con ionomicina era significativa. I dati sono presentati come mezzi ± SEM; n = 4 preparazioni di cellule; Test di Mann-Whitney-U; * p ≤ 0.05 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Al giorno 3 di coltivazione, nell'ambito del trattamento con ionomicina, qRT-PCR ha rivelato una diminuzione nell'espressione del mRNA di β-MHC (p ≤ 0,01) e OSM, che entrambi svolgono un ruolo distinto nella de-differenziazione di ARVC (figura 7A e C). Swiprosin-1, un indicatore per la re-differenziazione di ARVC downregulated significativamente, troppo (figura 7B).
Figura 7: De - e re - differentiation di ARVC coltivati nell'ambito del trattamento con ionomicina
(1 µM) al giorno 0 causato un mRNA diminuita espressione di oncostatin M (OSM) e β-MHC, che entrambi giocano un ruolo chiave nella differenziazione dei momenti di cardiomiociti adulti. Inoltre, l'espressione del mRNA di Swiprosin-1, un giocatore chiave nella re-differenziazione di cardiomiociti adulti, inoltre è stata diminuita dal trattamento ionomicina. 3 ° giorno di coltura; I dati sono presentati come mezzi ± SEM; n = 30 piastre per colture cellulari per ogni gruppo; Test di Mann-Whitney-U; * p ≤ 0.05; * * p ≤ 0,01 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Pre-placcatura medio |
| 20 mL di terreno di CCT |
| 2% vol. penicillina/streptomicina (400 μL) |
| Vol. 4% FCS (800 μL) |
| Medio di placcatura |
| 20 mL di terreno di CCT |
| 2% vol. penicillina/streptomicina (400 μL) |
| Lavaggio medio |
| 20 mL di terreno di CCT |
| 2% vol. penicillina/streptomicina (400 μL) |
| Nota: 4% vol. FCS in mezzo pre-placcatura può essere sostituito da 1 Vol.-% laminina (0,5 μg/cm2). Per la coltivazione di cardiomiociti per diversi giorni è inoltre possibile aggiungere 20 Vol.-% FCS nel supporto di lavaggio. Memorizzare placcatura medium e lavaggio medio di 4-8 ° C fino a usando. |
Tabella 1: mezzi di coltura utilizzati per l'isolamento dei cardiomiociti
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Discussion
Il comportamento di cardiomiociti adulti in vivo è influenzato da molte interazioni con altre cellule (ad es., neuroni, cellule endoteliali, fibroblasti, cellule infiammatorie) e il sincizio elettrico che formano1. Pertanto, studiare esclusivamente adattamento allo stress dei cardiomiociti adulti richiede l'isolamento e la coltura di ARVC. I principali effetti di isolare e coltivare ARVC sono: 1) disconnetterli dalla matrice extracellulare e contatti cellula-cellula; 2) eseguire la disconnessione da stimoli contrattili; 3) costringendoli ad adattarsi da un tessuto tridimensionale al ambiente bidimensionale. In queste condizioni, ARVC avviare de e re differentiation come descritto sopra e realizzare gli adattamenti più, che inoltre sono veduti durante il cardiaco che ritocca in vivo (β-adrenoceptor desensibilizzazione, rimontaggio di sarcomeri, ecc.) 4. di conseguenza, l'isolamento dei cardiomiociti adulti rappresenta un valido metodo per indagare su queste cellule e la loro risposta ai diversi trattamenti. Queste intuizioni possono essere utilizzate in seguito per in vivo esperimenti, che aiuti a evitando inutili esperimenti e riducendo il numero di animali da esperimento. Certamente, alcuni risultati veduti in vitro non si verificherà in vivo (ad esempio, la formazione di pseudopodi-come le strutture). Il cella-cella-contatti esistenti all'interno del sincizio elettrico ostacolerà la crescita eccessiva sotto condizioni fisiologiche17. Tuttavia, ARVC isolato e coltivato può essere utilizzato per studiare il comportamento dei cardiomiociti adulti. Inoltre, prime sperimentazioni di nuove strategie di trattamento contro le malattie cardiache negli esseri umani possono essere condotte con ARVC.
Il metodo descritto per l'isolamento e la coltura di cardiomiociti adulti contiene alcuni punti critici. Per ottenere risultati di successo, i seguenti elementi devono essere considerati.
1. tolleranza di calcio: storicamente, la tolleranza di calcio di cardiomiociti adulti fu uno dei fattori più critici che portano a un successo isolamento e coltura di cardiomiociti adulti1,7, 8. al giorno d'oggi, i protocolli sono stabilite per assicurare la coltivazione sotto condizioni fisiologiche calcio1,3. Questo manoscritto Mostra l'influenza di una concentrazione di calcio intracellulare modificati sulla qualità di ARVC isolata. Ionomicina, che aumenta le concentrazioni di calcio intracellulare, ha provocato una diminuzione significativa nella diffusione e un significativo aumento del numero dei cardiomiociti con un'apparenza insolita. Inoltre, ha causato un downregulation degli indicatori chiavi per cardiaco de - e re - differentiation: β-MHC, OSM e Swiprosin-1. Di conseguenza, modificando la concentrazione di calcio intracellulare durante la coltivazione ostacola la capacità di ARVC di adattarsi ai nuovi ambienti. Anche se alcuni ARVC erano in grado di diffondere e adattare (9,87% ± 2,77% di tutte le ARVC contati; Figura 5), un'indagine accurata di ARVC in queste condizioni non è possibile. Di conseguenza, per un preciso isolamento e coltura di ARVC deve essere utilizzato un protocollo stabilito del calcio. Inoltre, occorre garantire che nessuno dei trattamenti studiati interferiscono con l'emostasi di calcio di ARVC.
2. collagenosi: sono disponibili diversi lotti di collagenasi. Ogni batch viene illustrato le differenze nella qualità e l'efficacia1. Pertanto, gli autori raccomandano l'ordinazione e analisi di campioni di lotti diversi. Inoltre, il tempo di digestione e la quantità di collagenasi di ogni nuovo lotto utilizzato esigenze deve essere valutata separatamente. Di conseguenza, la concentrazione e il tempo di digestione nel protocollo descritto può differire leggermente ad altri protocolli.
3. tempo fino ad aspersione di cuore: per garantire un'elevata qualità di ARVC, il tempo tra l'estrazione il cuore dal corpo e l'inizio della perfusione con il sistema di Langendorff dovrebbe essere più breve possibile. Un tempo prolungato provoca danni al cuore e si traduce in un maggior numero di ARVC non vitali.
Inoltre, il riscaldamento la soluzione di perfusione durante la perfusione e la digestione per 5 minuti dopo tritare il tessuto è essenziale per ottenendo un buon risultato. Per evitare inutili danni dei tessuti biologici, devono essere maneggiato con cura presso punti di tutti i tempi. Inoltre, si deve sottolineare che il trattamento con OSM o concentrazioni più basse di FCS anche abilitare ARVC a de e re differentiate4,10,18,19. Tuttavia, senza questi trattamenti nutritivi, ARVC degenerato entro pochi giorni2.
In conclusione, l'isolamento e la coltura di ARVC è un metodo sensibile che offre una varietà di possibilità di studiare il comportamento dei cardiomiociti adulti esclusivamente.
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Disclosures
I risultati mostrati sono parte della tesi dottorale di Franziska Nippert.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Nadine Woitasky e Peter Volk per assistenza tecnica. Inoltre, gli autori ringraziano la signora Claudia Lorenz (scrittore medico, ACCEDIS) per il suo aiuto nella preparazione del manoscritto. Questo manoscritto è stato sostenuto finanziariamente da DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
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