Summary
Her presenterer vi en protokoll for isolasjon og dyrking av voksen rotte ventrikulær cardiomyocytes (ARVC). Isolerte ARVC kan brukes for kort og lang sikt dyrking. Isolasjon og dyrking av ARVC kan spille en nøkkelrolle i utviklingen av nye behandlingsregimer for hjerte sykdommer.
Abstract
I en intakt hjerte påvirke tilstøtende celler voksen cardiomyocytes. Med metoden for isolasjon og dyrking av voksen cardiomyocytes er en presis undersøkelse av virkemåten til disse cellene under spesifikke behandlinger og miljøer mulig. Dette manuskriptet presenterer en protokoll for vellykket isolasjon og dyrking av voksen rotte ventrikulær cardiomyocytes (ARVC).
Rotta er ofret av cervical forvridning under dyp anestesi. Deretter trekkes ut hjertet og aorta er avdekket. Deretter utføres perfusjon på Langendorff perfusjon systemet med kalsium uttømming og collagenase behandling. Etterpå blir ventrikkel vev hakket, re-sirkulerer, og filtrert, etterfulgt av tre sentrifugering trinn gradvis tillegg CaCl2 til fysiologiske kalsium konsentrasjon er nådd. ARVC er belagt celle kultur retter. Etter forfriskende celle kultur medium, kan ARVC dyrkes i opp til seks dager uten å endre serum inneholder kultur medium. Isolasjonen av ARVC er en kalsium følsom prosess. Små endringer i intracellulær kalsium konsentrasjon forårsake en nedgang i kvalitet og levedyktigheten til isolerte cellene.
Fersk isolert ARVC er rod formet. I de første dagene av dyrking mister stav-formet morfologi og form pseudopodia-lignende strukturer (spredning). Under denne morfologiske formasjonen ARVC først redusere deres kontraktile elementer etterfulgt av en reformasjon gjennom begrepsordbok stress fibrene og de novo sarcomerogenesis. Etter en uke dyrking, de fleste ARVC viser en utbredt opptreden med en tydelig synlig tvers striation. Denne prosessen er følsomme for intracellulær kalsium konsentrasjon, som behandling med ionomycin demper sprer seg. Viktige indikatorer i denne prosessen av de - og re - differentiation er β-myosin tunge kjede (β-MHC), oncostatin M (OSM) og swiprosin-1 (EFHD2). Nyere studier har antydet at cardiac re - og de differentiation oppstår under oppdrettsforholdene etterligner funksjoner sett i vivo under cardiac remodeling. Derfor spiller isolasjon og dyrking av ARVC en viktig rolle i å forstå biologi av cardiomyocytes.
Introduction
Voksen cardiomyocytes i vivo arbeid som en elektrisk syncytium basert på celle-celle kontakter mellom myocytter. I tillegg påvirkes de av tilstøtende celler som cardiac fibroblaster, endotelceller, nerveceller og inflammatoriske celler1. For å studere evne til cardiomyocytes å tilpasse organisasjonen intracellulær til endret opplastingsforhold, sett i løpet av hjerte-hypertrofi, som et første trinn fører til hjertesvikt, isolasjon og dyrking av voksen ventrikkel rotte cardiomyocytes (ARVC) er nødvendig2,3,4. Historisk ble cardiomyocytes først isolert fra embryonale chick hjerter5,6. Noen år senere, ble første isolering av terminalt differensiert cardiomyocytes beskrevet ved hjelp av kalsium uttømming7. Men disse voksen cardiomyocytes var ikke kalsium tolerant og kan derfor ikke brukes for funksjonell analyser. Til slutt, i 1976 en ny protokoll aktivert Powell og vri undersøke voksen ventrikulær cardiomyocytes under fysiologiske forhold8. Som et første skritt isolerte de voksen cardiomyocytes under lav kalsium konsentrasjon og deretter økt kalsium til fysiologiske konsentrasjoner i en trinnvis prosedyre. I dag, de fleste protokoller for isolasjon og dyrking av voksen cardiomyocytes arbeide med denne kalsium-protokollen og bruke collagenase på enzymatisk fordøyelsen av tett celle-celle kontakter1.
En vellykket dyrking er fosterets kalv serum (FCS) eller oncostatin M (OSM) nødvendig. ARVC utfører en de - og re - differentiation med omfattende strukturendringer inkludert sarcomere demontering og reformasjonen9,10,11,12. Denne prosessen er ledsaget av et nytt uttrykk av fetal-type gener som β-myosin tunge kjede (β-MHC), som kjent fra hypertrofi og en formasjon av pseudopodia-lignende strukturer, også kalt spre4,11, 13. videre swiprosin-1 (EFHD2), en nylig identifisert protein, spiller en viktig rolle under re differensiering av dyrket ARVC11. Resultatet ARVC i kultur forvandle omfattende, sammensatte celler, som spontant Vis sammentrekninger etter to til tre uker i kultur2,4,14.
Nyere funn har avdekket at cardiac re - og de differentiation som den forekommer under oppdrettsforholdene imiterer har sett i vivo under cardiac remodeling10,15. CARDIAC remodeling er en viktig prosess under hjerte sykdommer16. Som hjerte sykdommer er fortsatt den viktigste dødsårsaken i industrialiserte samfunn, en bedre forståelse av biologi voksen cardiomyocytes er viktig (som, 2015). Isolasjon og dyrking av ARVC kan bidra til å utvikle nye strategier og legemidler for behandling av hjerte sykdommer. Med dette manuskriptet tilbys en protokoll for isolasjon og dyrking av ARVC. Videre merkes kritiske deler av denne metoden under diskusjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
undersøkelsen er gjennomført i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr publisert av oss National Institute of Health (NIH publikasjonen nummer 85-23, revidert 1996). Generelt, mann wistar rotter alderen 3 til 4 måneder og med en gjennomsnittlig vekt på 250-350 g brukes for denne protokollen. En rotte hjertet er tilstrekkelig for 20 kultur retter (1 mL per fat, indre diameter: 35 mm) med en omtrentlig celle tetthet av 1,5 x 10 4 celler/1000 mm 2.
1. forberedelse av Media og reagenser
- kreatin-carnitine-taurin medium (CCT medium)
Merk: CCT medium er en kompleks medium basert på medium 199 med tillegg av kreatin og carnitine taurin.- Forberede 1 L middels 199: legge til 3,6 g Hepes og bland 1t. Deretter Legg 655.5 mg kreatin (5 mM), 395.4 mg carnitine (2 mM) og 625.5 mg taurine (5 mM). Carnitine og taurin endre pH til < 7. For å hemme veksten av forurensende celler, f.eks endotelceller eller fibroblaster, Legg 10 µM cytosine β-D-arabinofuranoside til medium. Justere pH med NaOH (2 mM) 7,4 og sterile filter medium. Lagre CCT mediet på 4 ° C.
- Powell medium
- For 1 L Powell medium, oppløse 6.43 g NaCl (110 mM) med 0,19 g KCl (2,5 mM), 0,16 g KH 2 PO 4 (1,2 mM), 0,3 g MgSO 4 7 H 2 O (1,2 mM), 5.96 g Hepes (25 mM), og 1,98 g D (+ )-Glukose monohydrat (10 mM) i Aqua sterilt. Justere pH med NaOH (2 M) 7,4 og sterile filter medium. Store Powell medium på 4 ° C.
- Veisalt (CaCl 2)
- forberede en 100 mM CaCl 2 løsning (50 mL) og forberede dele inneholder 500 µL CaCl 2. Fryse dele på -20 ° C.
- Utarbeidelse av kultur medium
- forberede tre celle kultur medier: Pre-Kontaktflate medium, plating medium og vask medium. Bruk CCT medium som grunnlag for alle tre medier (tabell 1). Beregne CCT medium med 1 mL per kultur parabol. Derfor forberede 20 mL CCT medium 20 kultur retter (indre diameter: 35 mm).
- Celle kultur plater: Coat hver celle kultur plate (indre diameter: 35 mm) med 1 mL Pre-Kontaktflate medium. Lagre belagt plater på 37 ° C over natten eller for minst 2 timer før du bruker.
2. Isolering av voksen Cardiomyocytes
- forberedelse av Langendorff perfusjon systemet
- plating medium og vask middels til 37 ° C. Defreeze en tube med 500 µL CaCl 2 og veie i 25 mg collagenase.
- Flush Langendorff perfusjon systemet med aqua sterilt, etterpå la Powell medium sirkulere systemet for 5 min.
- Fylle Langendorff perfusjon systemet med 80 mL Powell medium uten noen luft bobler og gass mediet med 95% oksygen.
- Forberede en tube (50 mL) med 40 mL Powell middels varme den 37 ° c og gass det med 95% oksygen.
- Forberede en tråd på ca 25 cm i lengde for å feste fjernet hjertet til kanyle.
- Avfette et barberblad med alkohol (70% av volumet) og sy det chopper. Klemme en plast plate i chopper.
- Utvinning av hjertet
- bedøve rotte mannlige wistar med 4 til 5% isoflurane og ofre det med cervical forvridning. Åpne magen bak kyst buen med en abdominal skjær og, med den samme saks, skjære gjennom membranen åpne bryst hulrom.
- Fjerne hjertet, lungene og thymus, ved å kutte over thymus svært skallen i bryst hulrom. Overføre materialet til iskald saltvann umiddelbart.
- Fjern lungene og thymus fra hjertet med en dissecting saks (stor) og ved fixating materialet med kapsel tang, overføre sistnevnte til en ny saltvann.
- Isolasjon
- fjerne overflødig vev, som rester av thymus, luftrør, fett og bindevev fra hjertet kapsel tang og en dissecting saks (store eller små). Avdekke aorta og bryte den med en dissecting saks (store eller små) mellom den første og andre branchial arch.
- Start drypper av Langendorff perfusjon. Plasser hjertet på kanyle av Langendorff perfusjon og fixate det først med en krokodille klemme og senere forberedt tråden. Skyll hjertet til den er fri for blod.
- Oppløse 25 mg Collagenase i 5-6 mL varm Powell medium og legge 12.5 µL CaCl 2 (30 µM).
- Lukker blodsirkulasjonen ved å flytte en glass trakt, som er forbundet med Langendorff perfusjon system over dryppende hjertet og Legg løst collagenase perfusjon systemet. Starte perfusjonsmåling for 25 min med en dråpe hastighet av 1 dråpe per sekund.
Merk: Under perfusjon, hjertet vil svelle og bli en voksaktig utseende. - Stopper perfusjon etter 25 min og fjerne hjertet fra Langendorff perfusjon systemet. Fjerne aorta, atria og bindevev fra hjertet og åpne høyre og venstre ventriklene.
- Hogge hjertet to ganger i en vinkel på 90 grader (Klippebredde: 0,7 mm; hastighet: 0,15 cm/s). Gjenta denne prosessen manuelt med to skalpeller for 10 s hver side.
- Overfører 12 mL av perfusjon medium til en ny tube (50 mL). Hell den celle slurry i dette mediet og fordøye celler i fem minutter på 37 ° C. Mix løsningen hvert minutt.
- Filtrerer løsningen med fordøyd hjertet gjennom en nylon maske (200 µm) inn i et nytt rør (50 mL).
- Sentrifuge filtrerte løsningen på 29 x g for 3 min. Forkast nedbryting og legge 6 mL varm Powell medium inkludert 12.5 µL CaCl 2 (250 µM) til celle pellets. Resuspend pellets gjennom glatt risting bevegelser. Sentrifuge igjen 29 x g i 2 min. Forkast nedbryting og legge 6 mL varm Powell medium erstattes med 25 µL CaCl 2 (500 µM). Oppløse celle pellet gjennom forsiktig risting bevegelser og legge til 12 mL varm Powell middels inkludert 120 µL CaCl 2 (1 mM). Sentrifuger for tredje gang på 16 x g for 1 min. Igjen, fjerne nedbryting.
- Celle pellet omgås forvarmes plating medium.
- Fjerne før plating medium fra kultur plater. Overføre 1 mL plating medium, inkludert den isolerte cardiomyocytes, til hver kultur plate. Inkuber frisk isolert cardiomyocytes ved 37 ° C i 1 h.
- Fjerne plating mediet fra kultur plater. Legg 1 mL vaske middels til hver kultur plate og lagre platene på 37 ° C opp til seks dager uten å endre medium.
- For å undersøke påvirkning av ulike kjemikalier og behandlinger på ARVC, oppdatere plating medium ved vask medium og deretter legge til ulike kjemikalier.
Merk: Vurdering * lys: hver celle forberedelser, 150-300 cardiomyocytes bør bli overvåket døgnet av * lys. Dele alt som telles cardiomyocytes i grupper etter utseendet (f.eks " stav-formet ", " rund ned ", " sprer seg ", og " uvanlig utseende "). Kategorien " spre " inkluderer alle cardiomyocytes med pseudopodia-lignende strukturer. " Uvanlig utseende " inkluderer alle ARVC med en uregelmessig overflate og ingen synlig intakt cellemembranen.
3. Eksempel Eksperimenter
- fluorescens/Immunofluorescence farging av voksen cardiomyocytes
- analyser morfologiske og strukturelle konverteringer av ARVC under dyrking av AC confocal laser mikroskopi. Bruk Phalloidin-TRITC for å undersøke F-utgangen strukturer i " stav-formet ", " rund ned ", og " spre " ARVC. Utføre flekk ifølge produsenten ' s-protokollen. Et eksempel på Phalloidin-TRITC flekker er gitt i referansen Nippert et al. 11. med fluorescens/immunofluorescence flekker, forskjeller i det de - og re - differentiation av kontraktile apparater i dyrket voksen cardiomyocytes mellom eksperimentelle behandlinger (f.eks med Swiprosin-1, ionomycin) kan undersøkes.
- Sanntid kvantitative RT-PCR (qRT-PCR)
- utføre qRT PCR undersøke endringer i mRNA uttrykk for ulike gener (f.eks OSM, Swiprosin-1, β-MHC) under dyrking av ARVC. Tilstrekkelig utvalgsstørrelsen, bruke større kultur retter (indre diameter: 60 mm) med 2 mL volum. ARVC av fem kultur retter gir en prøve. Utføre isolering av mRNA og transformasjonen av cDNA ifølge produsenten ' s protokollen.
- Immunoblot teknikker
- utføre Western blotter å undersøke endringer i protein uttrykk (f.eks for Swiprosin-1) under dyrking av ARVC. Bruke en kultur parabol (1 mL) per prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksen cardiomyocytes i kultur: Figur 1 viser en oversikt over ferske isolert voksen cardiomyocytes 2t etter siste vask. Ca 75% av alle cardiomyocytes hadde en stav-formet morfologi. De resterende 25% viste et uvanlig utseende med en runde morfologi og ingen synlig intakt cellemembranen (figur 1). På slutten av dyrking (dag 6), opptil 15% av alle cardiomyocytes viste spredning, 10% forble i en runde morfologi uten pseudopodia-lignende strukturer, og 75% av alle cardiomyocytes presentert et uvanlig utseende med en uregelmessig overflate og uten en synlig intakt celle membran (data ikke vist).
Figur 1: oversikt over ferske isolert rotten cardiomyocytes. Brøkdel av fersk isolert cardiomyocytes som viste en stav-formet morfologi utgjorde 75% av cardiomyocytes, i gjennomsnitt. De resterende 25% av celler presentert et uvanlig utseende med en uregelmessig overflate og ingen synlig intakt cellemembranen. Innspillingen ble utført av * lys 2t etter vask den ferske isolert cardiomyocytes. * Lys 2 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Med * lys virket fersk isolert ARVC stang formet og rundt 100 µm i størrelse (figur 2A). Fersk isolert ARVC som kontrakten spontant var ikke kalsium tolerant. Alle celler som var rundt og uten en synlig intakt cellemembranen var skadet og ikke levedyktig (figur 2A-B). I de følgende dagene mistet de fleste av stangen formet ARVC denne morfologi. Celler fikk avrundet med en synlig intakt cellemembranen. Disse ARVC var levedyktig. Starter på dag tre sistnevnte cellene dannet pseudopodia-lignende strukturer. Noen av disse ARVC holdt deres avrundet utseende under spredning (figur 2B). Andre konvertert til flat, polymorfe ARVC (figur 2B).
Figur 2: isolert rotten cardiomyocytes. (A) ferske isolert ARVC var vanligvis stav-formet. (B) etter seks dager i kultur, pseudopodia-lignende strukturer (spredning) var tydelig synlig i den nå avrundede ARVC. Noen ARVC forandret til en utbredt morfologi. ARVC med et uvanlig utseende vises en uregelmessig overflate og ingen synlig intakt cellemembranen. * Lys 10 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fersk isolert ARVC var vanligvis rod formet med en tydelig tvers striation (Figur 3, dagen 0). Endringer i celle morfologi ble observert i de følgende dagene i kultur. Først mistet ARVC alle sine kontraktile elementer (Figur 3dager 1 og 2). Dette ble etterfulgt av en reformasjon, implicating de novo sarcomerogenesis. Reformasjonen var innledes med dannelsen av pseudopodia-lignende strukturer (spre, Figur 3dager 3 til 6). De novo sarcomerogenesis startet med utseendet til utgangen stress fiber (Figur 3, dag 3). I tillegg montert begrepsordbok bunter dukket opp i regionen perinuclear og dannet nylig sarcomeres (Figur 3dager 4 og 5). Sistnevnte vokste langs preformed begrepsordbok stress fibrene i periferien (Figur 3, dag 6). På slutten av dyrking periode (dag 6a), en typisk tvers striation fra nylig montert sarcomeres i spredningen ARVC ble observert.
Figur 3: fluorescens farging. Det de - og re - differentiation av ARVC i kultur med 20% FCS vises. Fersk isolert ble ARVC med sine typiske rod form (dag 0) runde av nedverdigende sarcomeres i de første dagene av kultur (dag 1). De mistet alle sine kontraktile elementer (dag 2) etterfulgt av dannelsen av pseudopodia-lignende strukturer (spre; 3-5 dager) og påfølgende reformasjonen deres kontraktile elementer som angir de novo sarcomerogenesis (dag 6). På dag seks i kultur, kryss striation var tydelig synlig igjen (dag 6a). Flekker med Phalloidin-TRITC i henhold til produsentens protokoll; «arrows»: pseudopodia-lignende strukturer (eksemplet); *: utgangen bunter i regionen perinuclear (eksemplarisk vises). Deler av dette tallet er publisert i11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 viser den kinetiske av spredning under dyrking. Brøkdelen av ARVC viser pseudopodia-lignende strukturer på hver gang av eksamen gis som sprer seg i % (Figur 4). Spre startet rundt dag tre og økt stadig i løpet av dyrking. 14,7% ± 1.39% av alle telt ARVC viste pseudopodia-lignende strukturer etter seks dager i dyrking.
Figur 4: spre kinetic økning i cardiomyocytes med pseudopodia-lignende strukturer normalisert til alle telt cardiomyocytes (spre %) i løpet av seks dagers dyrking tid (n = 33 celle forberedelser). Dataene presenteres som betyr ± SEM. Dette tallet er publisert i11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Effekten av ionomycin på spredning av ARVC: Isolasjon og dyrking av ARVC er en kalsium følsom prosessen1,8. Behandling av ARVC med ionomycin (1 µM), noe som øker intracellulær kalsium konsentrasjon, forårsaket en signifikant (p ≤0.01) nedgang i dannelsen av pseudopodia-lignende strukturer sammenlignet med kontrollene (figur 5). Sammenliknet direkte, 17.19% ± 2.45% av alle telt ARVC viste sprer seg under kontroll forhold, men bare 9.87% ± 2,77% av alle telt ARVC dannet pseudopodia-lignende strukturer i nærvær av ionomycin (dag 6 av dyrking). Dermed redusert ionomycin sprer seg 42.58%.
= "jove_content" fo:keep-together.within-side = "1" >
Figur 5: spre kinetics behandling hos ionomycin. Behandling med ionomycin (1 µM) på dag 0 forårsaket en svært betydelig reduksjon i celle spredning i forhold til kontrollen. Dataene presenteres som betyr ± SEM; n = 4 celle forberedelser; Mann-Whitney-U test; * p ≤0.05; ** p ≤0.01 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I tillegg økte ionomycin andelen ARVC med et uvanlig utseende sammenlignet kontroll forhold (figur 6). I dag regnet seks, 71.11 ± 4.65% av alle ARVC behandlet med ionomycin viste et uvanlig utseende. Men under kontroll forhold, ble bare 51.35% ± 3,55% av ARVC kategorisert i denne gruppen.
Figur 6: ARVC med en usunn opptreden. Behandling med ionomycin (1 µM) på dag 0 forårsaket en betydelig økning i antall ARVC, som viste et uvanlig utseende. På dag 6 var forskjellen mellom kontrollen og ARVC behandlet med ionomycin betydelig. Dataene presenteres som betyr ± SEM; n = 4 celle forberedelser; Mann-Whitney-U test; * p ≤0.05 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
På dag 3 av dyrking, under behandling med ionomycin, avslørte qRT PCR en nedgang i mRNA uttrykk for β-MHC (p ≤0.01) og OSM, som begge spiller en bestemt rolle i de differensiering av ARVC (figur 7A og C). Swiprosin-1, en markør for re differensiering av ARVC var betydelig downregulated, også (figur 7B).
Figur 7: De - og re - differentiation av dyrket ARVC under behandling med ionomycin
(1 µM) dag 0 forårsaket en redusert mRNA uttrykk for oncostatin M (OSM) og β-MHC, som begge spiller nøkkelroller i de differensiering av voksen cardiomyocytes. I tillegg ble mRNA uttrykk for Swiprosin-1, en nøkkelspiller i re differensiering av voksen cardiomyocytes, også redusert med ionomycin behandling. Dag 3 av dyrking; Dataene presenteres som betyr ± SEM; n = 30 celle kultur plater per gruppe. Mann-Whitney-U test; * p ≤0.05; ** p ≤0.01 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Pre-Kontaktflate medium |
| 20 mL CCT medium |
| 2% vol. Penicillin/Streptomycin (400 μL) |
| 4% vol. FCS (800 μL) |
| Plating medium |
| 20 mL CCT medium |
| 2% vol. Penicillin/Streptomycin (400 μL) |
| Vask medium |
| 20 mL CCT medium |
| 2% vol. Penicillin/Streptomycin (400 μL) |
| Merk: 4% Vol. FCS før plating medium kan erstattes av 1 Vol.-% laminin (0,5 μg/cm2). I tillegg til utvikling av cardiomyocytes i flere dager legge 20 Vol.-% FCS til vask medium. Lagre plating medium og vask medium med 4-8 ° C før bruk. |
Tabell 1: kultur medier som brukes til cardiomyocyte isolasjon
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virkemåten til voksen cardiomyocytes i vivo er påvirket av mange interaksjon med andre celler (f.eksneurons endotelceller, fibroblaster, inflammatoriske celler) og den elektriske syncytium som utgjør1. Derfor krever studerer stress tilpasning av voksen cardiomyocytes utelukkende isolasjon og dyrking av ARVC. De viktigste effektene av isolering og dyrke ARVC er: 1) koble dem fra ekstracellulær matrix og celle-celle kontakter; 2) koble dem fra kontraktile stimuli; 3) tvinge dem til å tilpasse fra en tredimensjonal vev til todimensjonal omgivelser. Under disse forholdene, ARVC starte de - og re - differentiation som beskrevet ovenfor og utføre flere tilpasninger, som også vises under cardiac ombygging i vivo (β-adrenoceptor desensitization, sammensetting av sarcomeres, etc.) 4. derfor isolering av voksen cardiomyocytes representerer en gyldig metode å undersøke disse cellene og deres respons på ulike behandlinger. Denne informasjonen kan brukes senere til i vivo eksperimenter, som skulle hjelpe til å unngå unødvendige eksperimenter og redusere antall test dyr. Sikkert vil noen funn sett i vitro ikke oppstå i vivo (f.eks, dannelsen av pseudopodia-lignende strukturer). Eksisterende celle-celle-kontaktene i den elektriske syncytium vil hemme overdreven vekst under fysiologiske forhold17. Likevel, isolert og dyrket ARVC kan brukes til å undersøke virkemåten til voksen cardiomyocytes. I tillegg kan første studier av nye behandling strategier mot hjerte sykdommer hos mennesker utføres med ARVC.
Metoden beskrevet for isolasjon og dyrking av voksen cardiomyocytes inneholder noen kritiske punkter. For å oppnå vellykket resultat, må følgende elementer vurderes.
1. kalsium toleranse: historisk kalsium toleranse for voksen cardiomyocytes var en av de viktigste faktorene som fører til en vellykket isolasjon og dyrking av voksen cardiomyocytes1,7, 8. i dag, nettverksprotokoller opprettes slik dyrking under fysiologiske kalsium forhold1,3. Dette manuskriptet viser påvirkning av en endret intracellulær kalsium konsentrasjon på kvaliteten på isolerte ARVC. Ionomycin, som øker intracellulær kalsium konsentrasjoner, forårsaket en betydelig reduksjon i spredning og en betydelig økning i antall cardiomyocytes med et uvanlig utseende. Videre er det forårsaket en downregulation av de viktigste markørene for cardiac de - og re - differentiation: β-MHC, OSM og Swiprosin-1. Derfor hemmer endre intracellulær kalsium konsentrasjon under dyrking evnen til ARVC å tilpasse seg nye miljøer. Selv om noen ARVC kunne spre og tilpasse (9.87% ± 2,77% av alle telt ARVC; Figur 5), en nøyaktige undersøkelser av ARVC under disse forholdene er ikke mulig. Derfor for presis isolering og dyrking av ARVC skal en etablert kalsium-protokollen brukes. I tillegg bør det sikres at ingen av de undersøkte behandlingene forstyrre kalsium hemostasen av ARVC.
2. collagenase: det finnes ulike grupper av collagenase. Hver gruppe viser forskjeller i kvalitet og effektivitet1. Forfatterne anbefaler derfor bestilling og testing av prøver av forskjellige bunker. I tillegg brukes fordøyelsen og mengden collagenase av hver ny gruppe må vurderes separat. Følgelig kan konsentrasjonen og tiden fordøyelsen i protokollen beskrevet variere litt til andre protokoller.
3. tid før hjertet perfusjonsmåler: for å sikre ARVC av høy kvalitet, tiden mellom utpakking hjertet fra kroppen og starten av perfusjon med Langendorff systemet skal være så kort som mulig. Lengre tid forårsaker skade til hjertet og gir mange ikke-levedyktige ARVC.
I tillegg oppvarming perfusjon løsningen under perfusjon og fordøyelsen i 5 minutter etter hakking vevet er viktig å gir et godt resultat. For å unngå unødvendig skade av biologisk vev, bør det håndteres forsiktig på all-time poeng. Videre, det skal påpekes at behandling med OSM eller lave konsentrasjoner av FCS også aktivere ARVC til de - og re - differentiate4,10,18,19. Men uten disse nutritive behandlinger, ARVC degenerert innen noen dager2.
I konklusjonen, er isolasjon og dyrking av ARVC en følsom metode som tilbyr en rekke muligheter til å undersøke virkemåten til voksen cardiomyocytes eksklusivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Resultatene som vises er en del av doktorgrad Avhandlingen Franziska Nippert.
Acknowledgments
Forfatterne takke Nadine Woitasky og Peter Volk for teknisk assistanse. I tillegg takker forfatterne fru Claudia Lorenz (medisinsk skribent, ACCEDIS) for henne hjelp i å forberede manuskriptet. Dette manuskriptet ble økonomisk støttet av DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -D. Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , Springer International Publishing AG Switzerland. (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. Fabbro, D., McCormick, F. 290, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P.
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , Garland Science Taylor and Francis Group. New York, NY. (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
