Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

PH הרומן חוץ גופית ב- Live-הדמיה בתיווך וזמינותו של אסטרוציט Phagocytosis-שימוש Synaptosomes מצומדת-מחוון

doi: 10.3791/56647 Published: February 5, 2018

Summary

פרוטוקול זה מציג במבחנה הדמיה לחיות phagocytosis assay כדי למדוד את יכולת phagocytic של האסטרוציטים. עכברוש מטוהרים האסטרוציטים מיקרוגלייה משמשים יחד עם synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH. שיטה זו ניתן לזהות בזמן אמת קינטיקה היבלעות והשפלה ומספקת פלטפורמה הקרנה מתאימים כדי לזהות גורמים להתכוונן אסטרוציט phagocytosis.

Abstract

האסטרוציטים סוג התא העיקריים במוח, צור קשר ישירות הסינפסות וכלי הדם. אמנם היה נחשב microglial תאים תאים חיסוניים העיקריים של phagocytes רק במוח, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי האסטרוציטים ישתתפו גם תהליכים phagocytic שונים, כגון סינפסה התפתחותיות לביעור ואישור של פלאק עמילואיד ביתא מחלת אלצהיימר (AD). למרות ממצאים אלה, את היעילות של אסטרוציט היבלעות והשפלות של המטרות שלהם לא ברור של מיקרוגלייה. חוסר מידע הוא בעיקר בשל היעדר מערכת assay שבו קינטיקה של phagocytosis אסטרוציט ו מיקרוגלייה-בתיווך דומות בקלות. כדי להשיג מטרה זו, פיתחנו לטווח ארוך הדמיה לחיות במבחנה phagocytosis assay כדי להעריך את יכולת phagocytic של האסטרוציטים מטוהרים, מיקרוגלייה. זה assay, זיהוי בזמן אמת של היבלעות והשפלה הוא אפשרי באמצעות pH מצומדת מחוון synaptosomes, אשר פולטים פלואורסצנטי אדום בהיר ב organelles חומצי, כגון lysosomes. Assay הרומן שלנו מספקת זיהוי פשוטה ויעילה של phagocytosis באמצעות הדמיה לחיות. בנוסף, זה וזמינותו phagocytosis במבחנה יכול לשמש כפלטפורמה ההקרנה כדי לזהות חומרים כימיים ותרכובות שניתן לשפר או לעכב את יכולת phagocytic של האסטרוציטים. כמו גיזום סינפטית תקלה והצטברות חלבונים פתוגניים הוכחו לגרום הפרעות נפשיות או מחלות ניווניות, כימיקלים, תרכובות לווסת את יכולת phagocytic של תאי גליה אמור לסייע בטיפול שונים הפרעות נוירולוגיות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

גלייה, אשר מתייחסות הלא-טמפרמנט תאים במוח, הם סוג התא העיקריים במערכת העצבים המרכזית (CNS). בעבר, גלייה היו נחשבים תאים התומכים גרידא, בעיקר לשחק בתפקידים פסיביים בשמירה על הישרדות עצביים ומאפיינים סינפטית הבזליים. עם זאת, ראיות המתעוררים חשף כי גלייה ממלאים תפקידים פעילים יותר בהיבטים שונים של הנוירו-ביולוגיה, כגון שמירה על הומאוסטזיס המוח, מתווכים סינפסה היווצרות1,2,3 וסינפסה חיסול4,5, להתכוונן הפלסטיות הסינפטית6,7. גלייה ב מערכת העצבים כוללים האסטרוציטים, מיקרוגלייה oligodendrocytes להפוך. בין תאים אלה, האסטרוציטים מיקרוגלייה הוכחו ממלאים תפקידים phagocytic על ידי שתבלע הסינפסות4,5, מוות תאים8, פסולת עצבית9ו חלבונים פתוגניים, כגון בטא עמילואיד שלטי10,11. במוח המתפתח, האסטרוציטים לחסל סינפסות הגבי גרעין הברך הצדי (dLGN) עד MERTK ותלוי MEGF10 phagocytosis4. באופן דומה, מיקרוגלייה גם לחסל את הסינפסות מצופים C1q בשלבים התפתחותיים דרך המפל המשלים הקלאסית5. מעניין, הוצע כי פגמים סינפסה גיזום ניתן לאחד היזמים של מספר הפרעות נוירולוגיות. לדוגמה, הוכח כי מוטציות בגן רכיב המשלים 4 (C4), מה שמעלה גיזום סינפסה בתיווך המשלים על-ידי מיקרוגלייה, משויכים מאוד השכיחות של סכיזופרניה בני12. עיתון האחרונות הראו גם כי מסלול המשלים הקלאסית hyperactivated בשלבים חניכה של AD, גורם לאבדן מוקדם סינפסה זו מחלה13.

לעומת phagocytosis בתיווך מיקרוגלייה, אם phagocytosis בתיווך אסטרוציט תורמת החניכה, התקדמות של הפרעות נוירולוגיות שונות הוא פחות ברור. עם זאת, עיתון האחרונות עולה כי גורמים לשנות את הקצב של גיזום סינפסה נורמלי על ידי האסטרוציטים עלול לשבש את המוח הומאוסטזיס, לתרום הרגישות, פתולוגיה לספירה14. הקצב של גיזום סינפסה על ידי האסטרוציטים בעוצמה נשלטת על ידי ספקיות isomers, עם אלל מגן עבור המודעה (ApoE2) בחריפות שיפור הקצב ואת הסיכון אלל עבור המודעה (ApoE4) באופן משמעותי להורדת הקצב. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים ביטוי ApoE4 שהצטברו C1q סינפטית הרבה יותר מאשר השליטה או עכברים ApoE2 14. נתונים אלו מראים כי ליקויי phagocytosis בתיווך אסטרוציט בתחילת המודעה המוח עלול לגרום ההצטברות של פסולת senescent מצופים C1q הסינפסות/סינפטית שמפעיל phagocytosis microglial בתיווך המשלים, נהיגה ניוון סינפטית . הקיבולת phagocytic לקוי של האסטרוציטים ב ApoE4 נושאות עשוי גם לתרום הצטברות הפלאק בטא עמילואיד במוח מושפע לספירה לא מבוקרת.

בנוסף, הוכח כי תאי גליה במוח דרוזופילה בגילאי לאבד את יכולת phagocytic בשל ירידה תרגום של דרייפר, homolog של Megf10 האסטרוציטים להשתמש עבור phagocytosing הסינפסות. שחזור דרייפר רמות הציל את יכולת phagocytic של תאי גליה, אשר מסומנת ביעילות פסולת עצב פגומים במוח בגילאי במידה דומה עד כדי כך במוח הצעיר, המציין כי הזדקנות-induced שינויים בקיבולת phagocytic האסטרוציטים עשוי לתרום להפרעה של המוח הומאוסטזיס15.

בהתבסס על הממצאים החדשים, להתכוונן מקיבולת האסטרוציטים phagocytic עשוי להיות אסטרטגיית טיפולית אטרקטיבי כדי למנוע ולטפל בהפרעות נוירולוגיות שונות. בהקשר זה, היו מספר ניסיונות לשפר את יכולת phagocytic של האסטרוציטים, לדוגמה, על-ידי גרימת לחומצי lysosomes עם חלקיקים חומצי16 , overexpressing גורם שעתוק EB (TFEB), אשר ניתן לשפר ליזוזום להן17. למרות נסיונות אלו, זה עדיין לא ברור איך האסטרוציטים ותאים microglial נבדלים קינטיקה phagocytic שלהם, אם אנחנו צריכים להגדיל או להקטין את קיבולות phagocytic שלהם למחלות שונות.

בנייר זה, אנו מציגים וזמינותו של הרומן במבחנה לגילוי מקיבולת האסטרוציטים phagocytic בזמן אמת. הנתונים מראים שונים קינטיקה של היבלעות והשפלה האסטרוציטים ו מיקרוגלייה. בינוני אסטרוציט ממוזגים (ACM), אשר מכיל גורמים המופרש מן האסטרוציטים, חיוני phagocytosis יעיל של האסטרוציטים והן מיקרוגלייה. יתר על כן, Megf10, קולטן phagocytic האסטרוציטים, על homolog של סיד-1 , דרייפר, ממלא תפקידים חיוניים phagocytosis בתיווך אסטרוציט8,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי קוריאה מתקדמים במכון למדע, טכנולוגיה חיה טיפול מוסדי, שימוש הוועדה (IACUC), KA2016-08.

1. synaptosome טיהור

הערה: הליכים אלה מותאמים מן הנייר שפורסמו בעבר19 עם מספר שינויים על מנת לשפר את התשואה של מטוהרים synaptosomes (איור 1).

  1. להכין מדיה הדרגתיות צפיפות מקוטע.
    1. מניחים את הדברים הבאים על הקרח: 3%, 10% ו-23% צפיפות פתרונות הדרגתיות במאגר מעבר צבע (להביא 250 מ של מים עם 109.54 גר' סוכרוז, 606 מ ג של טריס 5 מ של 0.2 מ' EDTA, pH 7.4); מאגר homogenizing (להוסיף 25 מ של 4 x מאגר הדרגתיות, µL 500 של 50 מ מ DTT לתוך 74.5 מיליליטר מים); מהמגן ומכתש.
      הערה: פתרון הדרגתי צפיפות והכנות מוצגים בטבלה 1. כדי להכין 3%, 10% ו-23% צפיפות פתרונות מעבר צבע, להשתמש בפתרון ההדרגתי צפיפות raw.
    2. להכין 6 צינורות צנטריפוגה סופר ברורים לכל שלושה עכברים בוגרים.
    3. להוסיף 3 מ"ל של פתרון הדרגתי של צפיפות 23% על החלק התחתון של כל שפופרת צנטריפוגה עם פיפטה 1-mL. ואז, לאט לעשות שכבה עם 3 מ"ל של 10% צפיפות פתרון מעבר צבע על הפתרון הדרגתיות 23% צפיפות עם מרעה פיפטה, 1-mL פיפטה. לבסוף, להוסיף 3 מ"ל של 3% צפיפות פתרון מעבר צבע על העליונה. בשלב זה, השתמש בזהירות כדי להימנע היכרות עם בועות.
    4. לכסות את הצינורות צנטריפוגה בניילון נצמד ולשמור על הצינורות על קרח.
  2. Precool, צנטריפוגה מהירה ו ultracentrifuge ל 4 ° C.
  3. לחטא ציוד כירורגי (הפעלה מספריים, מספריים האביב Castroviejo, מלקחיים מעוקלים) עם 70% אתנול. להכין גביע זכוכית קטנים עם 25 מ של מאגר homogenizing על הקרח ולשקול את הספל.
  4. לחלץ את השכל מ עכברים זכר שלושה מבוגרים (כ 12 שבועות).
    1. לנקוע את חוליות וחותכים את הצוואר עם ההפעלה מספריים. לקלף את העור של ראש גולגולת לאורך האמצע באמצעות מספריים הפעלה ומלקחיים מעוקל. לסלק את הריח נורות, המח במספריים האביב Castroviejo.
  5. להכניס את המוח הנותרים. הספל עם מלקחיים מעוקל ולשקול את השכל. יש לשטוף את המוח מספר פעמים עם מאגר homogenizing קר כקרח כדי להסיר דם על פני השטח של המוח.
    הערה: בעבר, 9 מ של מאגר homogenizing עד 1g של רקמות המוח הומלץ.
  6. להוסיף 4 מ של homogenizing מאגר של 1g של רקמות המוח כדי המליטה מהמגן. בזמן homogenizing את השכל, להוסיף homogenizing מאגר עד 8 מ ל.
  7. לחלק homogenate של שני צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה מ-. רוחצים המליטה עם 1 מ"ל של מאגר homogenizing טריים את להוסיף את הצינורות.
    שים לב: המשך הצעדים 1.3-1.7 מהר ככל האפשר. פחות מ 20 דקות מומלץ.
  8. Centrifuge את homogenates צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה ב 1000 g x 10 דקות ב 4 ° C עם בלמים איטית יותר.
    הערה: הגדרת קצב ההאטה (בלם)-שתיים או שלוש כאשר הקצב המרבי של ההאטה תשע.
  9. בזהירות להוסיף את תגובת שיקוע שפופרת 50-mL החדש ולהוסיף עד 12 מ של מאגר homogenizing.
  10. לאט ובזהירות פיפטה 2 מ של תגובת שיקוע מדולל על הפתרון הדרגתיות צפיפות 3% עם פיפטה 1-mL ומניחים הצינורות על קרח.
  11. צנטריפוגה-31,000 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C בלי בלמים.
    הערה: הגדרת הקצב ההאטה באחד (אפס) או חוף.
  12. במקום הצינורות על הקרח ולאסוף את השבר synaptosome בין פתרון הדרגתי של צפיפות 23% 10% צפיפות פתרון מעבר צבע עם פיפטה 2-mL לתוך צינור 50-mL. להוסיף סוכרוז קפואים/EDTA מאגר עד 80 מ ל, מחלקים אותו 4 שפופרות צנטריפוגה במהירות גבוהה מל.
    הערה: ראה איור 3 synaptosomes fractionated עם מעברי צבע עם תוויות.
  13. צנטריפוגה ב g x 20,000 למשך 30 דקות ב- 4 הלעפה תרוטרפמט עם הפסקות פחות.
    הערה: לקבוע את קצב ההאטה פעמיים או שלוש כאשר הקצב המרבי של ההאטה תשע.
  14. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה 1-mL, resuspend בגדר synaptosome עם 1 מ"ל של מול מאגר פיזיולוגיים (140 מ מ NaCl, 3 מ מ אשלגן כלורי, MgCl 1.2 מ מ2, 1.2 מ מ NaH2PO4, 10 מ מ HEPES ו 10 מ מ גלוקוז, pH 7.4)20. להוסיף 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד 10% מול מאגר פיזיולוגיים (הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד: 5%) לאסוף את synaptosomes לתוך שפופרת 50-mL צנטריפוגה מהירה אחת.
  15. 1 מ"ל aliquot לתוך צינורות 1.5-mL. מודדים את ריכוז חלבון synaptosomes באמצעות וזמינותו ברדפורד.
  16. להקפיא את הצינורות ובמהירות לאחסן הצינורות במקפיא עמוק-80 ° C עד ה-pH מחוון ההטיה.

2. pH ההטיה מחוון

  1. צנטריפוגה 1.5-mL צינורות עם synaptosomes ב g x 21,092 למשך 3-4 דקות ב 4 º C.
  2. הסר את תגובת שיקוע, להוסיף 200 µL של 0.1 M נה2CO3 ולערבב היטב על ידי pipetting.
    הערה:2CO נה3 נוספה כדי להעלות את רמת ה-pH כמו succinimidyl אסתר באופן היעיל ביותר מגיב עם ראשי אמינים ב- pH בסיסי מעט.
  3. להוסיף 2 µL של מחוון ה-pH צינור ובעדינות מערבולת.
    התראה: שימוש µL 1 של pH אינדיקטור לכל 0.3 מ ג של synaptosome פתרון.
  4. למזער חשיפה קלה על ידי כיסוי הצינורות ברדיד אלומיניום, תקופת דגירה אותם של 1-2 h בטמפרטורת החדר (RT) ב שייקר טוויסט עם עצבנות עדין-30-40 סל ד.
  5. לעצור את העצבנות ולהוסיף 1 מ"ל של DPBS.
  6. Centrifuge הצינורות ב g x 21,092 למשך 1-2 דקות.
  7. הסר את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של DPBS כדי resuspend בגדר מאת pipetting עדין.
  8. חזור על שלבים 2.6-2.7 לפחות שבע פעמים כדי להסיר את מחוון ה-pH לא מאוגד.
  9. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר עם 200 µL של DPBS עם דימתיל סולפוקסיד 5%.
    הערה: בשלב זה, כל synaptosomes הם שאינם פונקציונליים. יש לנו אישר כי phosphatidylserine (PS) נחשף הממברנה החיצונית של synaptosomes, אשר מתפקד בתור "לאכול-לי" אות (איור 4).

3. האסטרוציטים וטיהור מיקרוגלייה

הערה: פרוטוקול זה לטיהור אסטרוציט היא ממאמרו של נייר שפורסמו בעבר21. ב פרוטוקול זה, מתואר הטיהור של עכברוש האסטרוציטים, מיקרוגלייה. ההליכים הספציפיים לטיהור האסטרוציטים העכבר ו מיקרוגלייה מתוארים גם בהערות.

  1. יום לפני טיהור
    1. להכין מנות התרבות תאים מצופים מראש פתרונות.
    2. הכינו צלחות פטרי 145 מ מ x 20 מ מ עם מ 25 ל 50 מ"מ טריס-HCl (pH 9.5). מקום הטיפול נוגדן ראשית או משנית הפטרי בנפרד כמתואר להלן. דגירה המנות במקפיא למשך הלילה.
      צלחת BSL-1: 20 µL של 5 מ"ג/מ"ל BSL-1 (Griffonia simplicifolia לקטין)
      צלחת משנית בלבד: µL 60 2.4 mg/mL עז אנטי עכבר IgG + IgM (H + L)
      CD45 צלחת: 60 µL של 2.4 mg/mL עז אנטי עכבר IgG + IgM (H + L)
      O4 המנה: 60 µL של 2.4 mg/mL עז אנטי עכבר IgM (ממוצע-שרשרת ספציפי)
      Itgb5 צלחת (Integrin β5) עבור האסטרוציטים עכברוש: 60 µL של 2.4 mg/mL עז אנטי עכבר IgG + IgM (H + L)
      הערה: כדי לחבר נוגדן משני פני הידרופובי הפטרי, מצורף איטית בטמפרטורות נמוכות מומלץ. עם זאת, זה אפשרי להרגיע את צלחת פטרי עם נוגדנים משניים עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. נוגדנים עבור אסטרוציט panning משמשים באופן שונה בהתאם למין החיה; לדוגמה, HepaCAM הבישול האסטרוציטים העכבר: 60 µL של 2.4 mg/mL עז אנטי עכבר IgG + IgM (H + L)
  2. יום של טיהור
    1. להתכונן immunopanning.
    2. הכן טורפדו 50-mL ולהוסיף מניות הצינורות. הכנה מפורטת פתרון מניות מוצגת בטבלה 1.
      1. הכן צינור 1 (אנזים): 22 מ ל אנזים מניות (אנזים מניות: 1 x של ארל מאוזנת תמיסת מלח (EBSS)+0.46% D (+)-גלוקוז + 26 מ מ NaHCO3 ו0.5 מ מ EDTA).
      2. הכן צינור 2 (נמוך Ovo): 42 מ של מניות מעכב (מעכב מניות: 1 x D EBSS+0.46% (+)-גלוקוז + 26 מ מ NaHCO3).
      3. הכן צינור 3 (גבוהה Ovo): 10 מ של מניות מעכב.
    3. לצרף 0.22-מיקרומטר סביבונים קצות פיפטות 2-mL מחובר טנק2 (95% O2 ו- 5% CO2) CO. בועה CO2 לתוך צינורות 1-3. תפסיק מבעבעים כשמתברר הפתרונות של תפוז.
    4. להשלים את הפתרונות.
      התראה: להשלים, דגירה הפתרון צינור 1 ב 34 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני השימוש להפעלת האנזים.
      1. הכן צינור 1 (אנזים): 22 מ ל אנזים מניות + 180 U פפאין + 0.004 g L-ציסטאין.
      2. הכן צינור 2 (נמוך Ovo): 42 מ של מעכב מניות + 3 מ"ל של Ovo נמוך + 200 µL של DNase.
      3. הכן צינור 3 (גבוהה Ovo): 10 מ של מעכב מניות + 2 מ של Ovo גבוהה + 20 µL של DNase.
      4. הכן צינור 4 (0.2% BSA): 19 מ של 1 X DPBS + 1 מ"ל של BSA 4% + 8 µL של DNase.
      5. הכן צינור 5 (0.02% BSA): 45 מ של 1 X DPBS + 5 מ של צינור 4 + 50 µL של DNase.
    5. מחממים מים טורקי, חום בלוק ב 34 מעלות צלזיוס.
  3. תמצית קליפת חולדה.
    1. לחטא ציוד כירורגי עם 70% אתנול והכן מ מ 100 צלחות פטרי עם DPBS.
    2. להכין קופסת אקרילי. לשים 2-3 שכבות של רקמות בחלק התחתון של תיבת ולהוסיף 1 מ"ל של איזופלוריין לתוך התיבה.
    3. עזים ומתנגד הגורים עבור 20-40 s בתיבה ואשר ההרדמה על ידי צביטה רגל עם מלקחיים. לחשוף את הלב22 , perfuse הגורים באמצעות מזרק 10-mL עם DPBS.
      הערה: זלוף משמש כדי למנוע זיהום תאי הדם במהלך השלב השתוותם מיקרוגלייה.
    4. חתך קו של הכלבלב צוואר הרחם העליון של הצוואר עם מספריים הפעלה, פצעים וחתכים בעור הראש לאורך הקו האמצעי. אעשה חתך על הגולגולת לאורך הקו האמצעי ופתח את הגולגולת עם מלקחיים מעוקל.
    5. בלו המוח הקטן עם מספריים האביב Castroviejo. להוציא את המוח הנותר ומניחים אותו בצלוחית 100-מ מ מלא DPBS.
    6. הסר בתחומים אחרים כגון ההיפוקמפוס של המוח האמצעי של קליפת במספריים האביב Castroviejo תחת המיקרוסקופ. הסר את קרומי המוח עם מלקחיים משובחים.
    7. להעביר את קליפת המוח לתוך תבשיל 60 מ מ חדש ולהסיר את DPBS שנותרו בצלחת. קוצצים את הרקמה עם להב מספר 10.
  4. מביצועם קליפת להשעיה תא בודד
    1. שופכים את הפתרון צינור 1 מסוננים לתוך תבשיל 60 מ מ ולהוסיף 50 µL של DNase1. מערבולת הפתרון בצלחת.
      הערה: DNase משמש כדי לעכב צבירה של ה-DNA של תאים קרע.
    2. למקם את המנה גוש חום 34 ° C, לכסות את זה עם מכסה שיש לו חור באמצע. להשתמש במלחם לעשות החור במכסה הפטרי 60 מ מ.
    3. להתחבר 22-מיקרומטר סביבונים צינור מיכל של2 CO ולמקם את הטיפ מסנן לתוך החור.
    4. דגירה המנה ב 34 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות מערבולת הפתרון בצלחת כל 10-15 דקות.
  5. סיום הכנת המנות פנורמית.
    1. הסר את הכלים השתוותם זה מצופה נוגדנים משניים מהמקפיא ביום מבעוד מועד. להשאיר את המנה BSL-1 ואת המנה נוגדן בלבד משני-RT.
    2. לרחוץ כלים אחרים שלוש פעמים עם 20 מ של DPBS.
    3. שופכים כמות מספקת של 0.02% BSA לתוך הכלים. מניחים נוגדנים ספציפיים הראשי הכלים המתאימים:
      תבשיל CD45: 12 מ ל BSA 0.02% + 20 µL של 0.5 מ"ג/מ"ל העכבר אנטי חולדה CD45
      תבשיל Itgb5: 12 מ ל BSA 0.02% + 20 µL של 0.5 מ"ג/מ"ל Itgb5
      O4 המנה: 8 מ של BSA 0.02%, 4 מ של נוגדן O4
      הערה: עבור immunopanning העכבר, להשתמש בעכבר אנטי חולדה CD45 (0.5 mg/mL) עבור מיקרוגלייה ו- HepaCAM (0.5 mg/mL) עבור האסטרוציטים.
    4. הכנת 30 מ של 30% FBS עם neurobasal מדיה ו- 10 מ"ל של 1 X EBSS. לחמם שני פתרונות באמבט מים 34 מעלות צלזיוס.
  6. לעכב את התגובה פפאין.
    1. העברת רקמות שטופלו פפאין צינור 50-mL. המתן הרקמות להתיישב. האחות נוזלית ביניקה.
    2. להוסיף 4 מ"ל של Ovo נמוכה פתרון הצינור ו מערבולת הפתרון לשטוף את התאים.
    3. חזור על צעדים 3.6.1-3.6.2 שלוש פעמים כדי לעצור את תגובת האנזים.
  7. Triturate הרקמות בקליפת המוח.
    1. להוסיף 6 מ של Ovo נמוך לאמבטיה. האחות ולשחרר את רקמות במהירות בעזרת פיפטה 5-mL.
      התראה: לא להציג את בועות.
    2. להכין שפופרת 50-mL החדש, הוסף 5 מ של Ovo נמוך. איסוף תאים בודדים צינור חדש.
    3. חזור על צעדים 3.6.1-3.6.2 פעמיים ולשנות את פיפטה 5-mL פיפטה 1-mL.
    4. חזור על trituration עד יותר מ 95% של הרקמות אינם גלויים.
    5. להכין שכבה של Ovo גבוהה פתרון מתאי צינור 3 עם פיפטה 10-mL מתחת המכילות Ovo נמוך חלופה מועדפת.
    6. צנטריפוגה ב g x 190 במשך 6 דקות עם מספר בלמים.
      הערה: הגדרת קצב ההאטה-אחד או שניים כאשר הקצב המרבי של ההאטה תשע.
  8. פילטרט של תאים בודדים.
    1. בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע ביניקה, ולאחר מכן resuspend בגדר עם 3 מ"ל של 0.02% פתרון BSA עם פיפטה 1-mL.
    2. להוסיף 0.02% BSA פתרון עד 9 מ ל.
    3. להכין את שפופרת 50-mL החדש 20-מיקרומטר תא מסננת על גבי הצינור. הרטב את מסננת תא עם 1 מ"ל של 0.02% BSA פתרון.
    4. העברת התליה תא בודד לתוך מסננת התא. לסנן 1 מ"ל בכל פעם.
    5. לשטוף את מסננת תא עם 3 מ"ל של 0.02% BSA פתרון. לא עושים יותר מ 15 מ"ל של התליה תא בודד מסוננים.
    6. דגירה הצינורית בתוך אמבט המים 34 מעלות צלזיוס למשך 45-60 דקות להתאוששות התא. הצעד שחזור התא מאפשר relocalization של חלבונים פני שטח התא למוח.
  9. לבצע גלילה רציפה של התאים.
    1. לשטוף את הצלחת השתוותם CD45 שלוש פעמים עם 20 מ של DPBS. לשטוף בכל מנה שלוש פעמים עם 20 מ של DPBS מיד לפני השימוש.
    2. שופכים את התליה תא בודד לתוך CD45 פאנינג מאכל. להשאיר את המנה עבור 28 דקות ומנערים את המנה עבור 14 דקות. כדי להסיר תאים לא מאוגד מלמטה, לנער בזהירות את המנה.
    3. העברת התליה תא למנה משנית בלבד. לחכות 20 דקות ומנערים היטב את המנה למשך 10 דקות. כדי להשיג מיקרוגלייה מתוך קערה CD45, עבור לשלב 3.9.2.
    4. העברת התליה תא לתוך המנה BSL-1. להשאיר את המנה למשך 10-12 דקות.
    5. העברת לתוך המנה O4. לחכות 20 דקות ומנערים למשך 10 דקות.
    6. להעביר המנה Itgb5. להשאיר את המנה למשך 40 דקות ומנערים בעדינות כל 10 דקות.
      הערה: עבור העכבר panning, להעביר התליה תא לתוך המנה HepaCAM.
  10. ניתוק התאים מתוך קערה.
    1. מיקס 400 µL של טריפסין (30,000 U/mL ב EBSS) עם preincubated 8 מ ל 1 X EBSS.
    2. שופכים התליה תא משפחתי בצלחת לתוך דלי פסולת.
    3. לשטוף את הצלחת שמונה פעמים עם DPBS.
    4. שופכים 8 מ של EBSS עם טריפסין לתוך קערה.
    5. דגירה המנה למשך 5-10 דקות בחממה 37 º C. תקופת דגירה של 10 דקות עבור המנה CD45 ו- 5 דקות על המנות Itgb5 ו- HepaCAM.
    6. הקש על המנה ולבחון את המנה תחת מיקרוסקופ.
      הערה: אם יש רוב האסטרוציטים אינו מנותק, תחזיר את המנה לתוך החממה למשך עוד 5 דקות.
    7. למזוג 10 מ"ל של 30% FBS לתוך המנה לנטרל טריפסין.
    8. פיפטה למעלה ולמטה לתוך המנה כולה כדי לנתק האסטרוציטים או מיקרוגלייה.
    9. העברת הפתרון לתוך צינור 50-mL.
    10. להוסיף 10 מ של 30% FBS ו 200 µL של DNase לתוך קערה. ניתוק התאים שוב. DNase משמש כדי לעכב צבירה של ה-DNA של תאים קרע.
    11. העברת הפתרון לתוך הצינור. אם התאים נשארים בצלחת, להוסיף עוד 10 מ"ל של 30% FBS ולנתק את התאים שוב.
  11. צלחת את התאים.
    1. Centrifuge את הצינור ב g x 213 למשך 10 דקות.
    2. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא עם מדיה.
      הערה: השתמש immunopanned אסטרוציט בסיסי מדיה (IP-ABM) עבור האסטרוציטים ומדיה מיקרוגלייה ברשתית בסיסי (MBM) עם immunopanned ממוזגים אסטרוציט מדיה (IP-ACM) עבור מיקרוגלייה. IP-ABM ויצירות MBM מוצגים בטבלה של חומרים.
    3. לספור את התאים עם hemocytometer.
    4. צלחת את האסטרוציטים ואת מיקרוגלייה בנפרד בתוך צלחות מצופה PDL.
      הערה: להכין את הצלחת מצופים PDL לפני השימוש. כדי להכין צלחות מצופה PDL, להוסיף 50 µL של 1 מ"ג/מ"ל פולי-D-ליזין 5 מ ל מים מזוקקים, שופכים כמות מספקת של פתרון לתוך קערה/הצלחת היטב, לחכות 30 דקות לשטוף את הצלחת/צלחת שלוש פעמים עם מים מזוקקים.
    5. דגירה לצלחת. לשנות את מחצית התקשורת כל 7 ימים עבור האסטרוציטים ו- 3 ימים עבור מיקרוגלייה.

4. לאסוף את ה-IP-ACM

  1. להכין תבשיל 100-מ מ כאשר האסטרוציטים confluent יתר על המידה.
  2. למחוק את התקשורת, כדי לבשל שלוש פעמים עם 10 מ"ל של DPBS.
  3. שופכים 15 מ"ל של חלבון נמוכה מדיה לתוך קערה.
    הערה: ההרכב מדיה חלבון נמוכה מוצגת טבלה של חומרים.
  4. תקופת דגירה המנה של 7 עד 10 ימים בחממה 37 º C.
  5. לאסוף ולרכז את התקשורת עם 10k (או 30k) צנטריפוגלי מסנן צינורות.
  6. Centrifuge הצינורות ב g x 851-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: Centrifuge הצינורות עד התקשורת שנותרו פחות מ 1 מ"ל.
  7. איסוף מרוכז מדיה (IP-ACM) לתוך צינור 1.5-mL החדש.
  8. למדוד את הריכוז של ה-IP-ACM באמצעות ניתוח כמותי

5. phagocytosis הדמיה לחיות Assay (איור 2)

  1. להכין צלחת 24-טוב (או כל צלחת/מנה כי הוא מוכן לחיות-הדמיה) ב האסטרוציטים אילו הם confluent (בדרך כלל, 7 עד 10 ימים של דגירה לאחר הטיהור הוא אידיאלי לייצוב תאי).
  2. מסיר את המדיה כל היטב ולשטוף הבארות עם 1 מ"ל של DPBS, שלוש פעמים. כדי למזער חשיפה אוויר, לשטוף הבארות במהירות.
  3. הוסף µL 300 של IP-ABM עם 5 µL של synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH וגורמים נוספים כגון ה-IP-ACM זה יכול לווסת תא גליה phagocytosis.
  4. דגירה על צלחת חממה2 CO למשך 40 דקות. שלב זה מאפשר ה-pH synaptosomes מצומדת מחוון להתיישב לתחתית של הלוחות.
  5. להסיר את התקשורת עם synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH לא מאוגד ולשטוף כל טוב עם 1 מ"ל של DPBS, שלוש פעמים.
    התראה: הדבר בחומרה. כדי למזער חשיפה אוויר, לשטוף הבארות במהירות.
  6. להוסיף 500 µL של IP-ABM עם גורמים נוספים כדי לבדוק לתוך הבארות.
  7. לקחת את הצלחת מכשיר הדמיה לחיות ולבחור עמדות. כוונן פוקוס, זמן החשיפה, בהירות וכוח LED.
    הערה: ההגדרות עבור זמן החשיפה, בהירות וכוח LED הם משתנה בהתאם עוצמת קרינה פלואורסצנטית מטרת הניסוי. ב וזמינותו הדמיה לחיות עם synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH, אנחנו בדרך כלל להגדיר ערכים אלה כדלקמן: חשיפה: ~ 150-200 ms, בהירות: 15 והובילה חשמל: 4-6.
  8. להגדיר פורמט התמונה מרווח הזמן, המספר הכולל של מחזורי עבור הדמיה לחיות. להגדיר את מרווח הזמן ל- 1 או 2 h תלוי כמה תפקידים שנבחרו. 2 ביממה במרווחים מומלצים כאשר יותר מ-150 משרות שנבחרו עבור הדמיה לחיות.
  9. התחל את הניסויים הדמיה לחיות.
  10. לנתח את הנתונים.
    1. פתח את התוכנית פיג'י.
    2. ייבוא רצף תמונות. להמיר תמונות בגווני אפור של 8 סיביות.
    3. לבצע רקע חיסור עם מסתובב בר ברדיוס של 50 פיקסלים.
    4. להתחיל זמן סדרה מנתח V3 תוספים.
      הערה: הכתובת עבור הזמן סדרה מנתח V3 תוספים מוצגת טבלה של חומרים.
    5. גרור האזור של עניין (ROI) התמונה ולחץ על הוסף במנהל ROI.
    6. לחץ על "Get עוצמה הכולל" בסדרת הזמן V3_0.
    7. לשמור את התוצאות ולשלב את הנתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ב זה במבחנה phagocytosis assay עם הדמיה לחיות לטווח ארוך, השתמשנו synaptosomes מן homogenates מוח העכבר למבוגרים, אשר הופרדו בפתרון ההדרגתי בין פתרון הדרגתי 23% ו- 10% הפתרון מעבר צבע באמצעות ultracentrifugation ( איור 3). לאחר ההכנה, synaptosomes חשופות PS בקרום החיצוני שלהם (איור 4), רומז כי הם איבדו את תפקידם, יכול להיות מוכר על ידי קולטנים PS האסטרוציטים ו מיקרוגלייה. כמוצג באיור5, synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH הנפלטים פלואורסצנטי אדום בהיר כאשר הם היו נבלע על ידי האסטרוציטים. השוואה בזמן אמת של הקיבולות היבלעות והשפלה של תאי גליה אפשרי על ידי לקיחת תמונות מרובות של רועי כל h 1 או 2 (הסרט משלים 1, 2 הסרט משלים). בשיטה זו, להדגים שונות קינטיקה של phagocytosis אסטרוציט ו מיקרוגלייה-בתיווך (איור 6). כדי לכמת phagocytosis של תאי גליה, נמדדה האזור (2מיקרומטר) של האות פלואורסצנטי אדום, אשר נקרא האינדקס phagocytic איור 6B , איור 7. למרות האסטרוציטים שנראה יעיל ב phagocytosing כמויות גדולות של synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH, מיקרוגלייה היו מהירים ב שתבלע ומבזה synaptosomes (איור 6B). מיקרוגלייה הראה pH המרבי מחוון העוצמה ב- 26 h לאחר טיפול synaptosome מצומדת מחוון ה-pH, ואילו האסטרוציטים הראה המקסימלי שלהם ב- 45 h (p-הערך < 0.05, ANOVA דו-כיווני בין אסטרוציט עם 1 X ACM מיקרוגלייה עם 1 X ACM). באופן דומה, תאים microglial הראו הפחתה 20.7% ב- pH הכולל מחוון עוצמת 40 h לאחר נקודת שיא, ואילו האסטרוציטים הראו ירידה של 17% ב- pH הכולל מחוון עוצמת במהלך אותה תקופת זמן. מעניין, הנתונים שלנו הראה כי מופרש אסטרוציט גורמים, אשר נכללו ב- ACM, הם חיוניים להגדלת בשני phagocytosis אסטרוציט ו מיקרוגלייה-בתיווך (איור 6B). האסטרוציטים הוכחו לשחרור מולקולות גישור, כגון MFGE8, GAS6, חלבונים, אשר ניתן לגשר, זירוז האינטראקציות בין רצפטורים phagocytic, "לאכול-לי" אותות כגון PS23. כפי שהוזכר לעיל, האסטרוציטים לחסל את הסינפסות דרך ה MERTK ו- MEGF10 מסלולים4. MEGF10 בא לידי ביטוי רק על ידי האסטרוציטים במוח ונוטלת סינפסה היבלעות דרך ההכרה "לאכול-לי" אותות עם זהות לא ידועה. מסכים עם ממצאים קודמים, וזמינותו הראה כי בהשוואה עם פראי-סוג (WT) העכבר האסטרוציטים, Megf10 הנוק-אאוט (KO) העכבר האסטרוציטים דיבוק ההפנייה phagocytic קיבולת (איור 7). לעומת האסטרוציטים WT, הראה האסטרוציטים Megf10 KO כ 40% ירידה ב- pH הכולל מחוון עוצמת בנקודת שיא (31 h) (איור 7).

Figure 1
איור 1. סכמטי של טיהור אסטרוציט בשיטות immunopanning. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. סכמטי של phagocytosis הדמיה לחיות assay. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. Fractionation homogenate המוח נציג פתרונות מעבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. להחליפן בתמונות של PS חשופים synaptosomes. (א) א שדה בהיר תמונה של האסטרוציטים עם synaptosomes. Synaptosomes מחוברים האסטרוציטים. דימוי פלורסנט (B) A synaptosomes tdTomato-חיובית, אשר כבר טהור מכל עכבר לבטא tdTomato המוח. (ג) pSIVA נקשר PS, אשר חשופים הממברנה החיצונית של synaptosome, והוא פולט קרינה פלואורסצנטית ירוק. PS (D) זוהה על ידי pSIVA (ירוק) הוא שותף מקומי עם synaptosomes tdTomato-חיוביות (אדום). סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. נציג שדה בהיר ותמונות פלורסנט של האסטרוציטים עם pH synaptosomes מצומדת מחוון-שתי נקודות זמן. ה' 11 לאחר הטיפול (פאנל התחתונה), synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH הם נבלע על ידי האסטרוציטים, פולטים פלואורסצנטי אדום בעוד שהם עושים לא-1 h לאחר הטיפול (החלונית העליונה). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6. קינטיקה phagocytic של עכברוש האסטרוציטים, מיקרוגלייה באמצעות הדמיה לחיות לטווח ארוך. (א) A תרשים סכמטי של במבחנה phagocytosis assay באמצעות האסטרוציטים מטוהרים מיקרוגלייה יחד עם synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH. שימו לב כי לפני נלקחים תמונות בשידור חי, synaptosomes לא מאוגד נשטפו לאחר 40 דקות של דגירה. (B) נציג גרפים המראים את קינטיקה היבלעות והשפלה של האסטרוציטים, מיקרוגלייה. ACM, אשר מכיל גורמים מופרש אסטרוציט, משפר באופן משמעותי בשני ספיגת synaptosome אסטרוציט ו מיקרוגלייה-בתיווך. אסטרוציט: שליטה לעומת אסטרוציט עם ACM 1 X, * * *, Tukey של מבחן השוואות מרובות. מיקרוגלייה: שליטה לעומת מיקרוגלייה עם ACM 1 X, * * *, Tukey של מבחן השוואה מרובים. קווי שגיאה מציינים S.E.M. *p ≤ 0.05, * * * p ≤ 0.0001, ANOVA דו-כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7. ירידה phagocytic קיבולת של Megf10 KO האסטרוציטים עכבר עם 1 X ACM לעומת זו של WT האסטרוציטים עכבר עם 1 X ACM- WT לעומת האסטרוציטים Megf10 KO עם 1 X ACM, * * *, ANOVA דו-כיווני. קווי שגיאה מציינים S.E.M. * p ≤ 0.05, * * p ≤ 0.01, * * * p ≤ 0.001 ANOVA דו-כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1: מתכונים פתרון. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה סרט 1. סרטון הדמיה לחיות נציג מציג phagocytosis של pH synaptosomes מצומדת מחוון על ידי האסטרוציטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הסרט משלים 2. סרטון הדמיה לחיות נציג המציג phagocytosis של pH synaptosomes מצומדת מחוון על ידי תאים microglial. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

במאמר זה, נציג שיטות לטווח ארוך הדמיה לחיות במבחנה phagocytosis assay באמצעות גלייה מטוהרים synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH. אנחנו מראים כי בהשוואה מיקרוגלייה, האסטרוציטים בעלי קיבולת היבלעות והשפלה שונים במהלך phagocytosis של synaptosomes. בנוסף, הנתונים שלנו מראים כי מופרש אסטרוציט גורמים, אשר מכילים מולקולות גישור כגון GAS6, חלבונים ו- MEGE8, הם חיוניים עבור יעיל phagocytosis תלויי-PS של תאי גליה במוח. יתר על כן, Megf10 KO האסטרוציטים להראות phagocytosis פגומה של synaptosomes.

כדי לבצע בהצלחה את הניסוי הזה, DPBS וכלי תקשורת צריך להירכש בקפידה במהלך השלבים כביסה (סעיף 5). ראשי תרבותי האסטרוציטים ו מיקרוגלייה, במיוחד מיקרוגלייה, הם פגיעים לחשיפה אוויר. לכן, צמצום מרווחי הזמן בין שלבי הכביסה הוא קריטי עבור שמירה על תאים חיים. הגדרת הדמיית לחיות לטווח ארוך עם מכשירי הדמיה לחיות, מיקוד ידני מומלץ כיוון פוקוס אוטומטי עשוי להגדיל את זמן החשיפה לייזר/LED, אשר עלול לגרום נזק לתאים.

בשיטה זו, פרוטוקול טיהור synaptosome19 הוא שונה במקצת. המאמר מפריד פתרונות מעבר צבע לתוך 3%, 10%, 15% ו- 23%. עם זאת, הקמנו פתרונות מעבר צבע 3%, 10% ו-23% כדי להגדיל את התשואה של synaptosomes מטוהרים. ההוראות עבור immunopanning האסטרוציטים ותאים microglial גם שינוי בשיטה זו. המטרה של המקור panning פרוטוקול21 היא לטהר רק האסטרוציטים ולהשתמש BSL-1, משני בלבד, CD45, O4 ו- Itgb5 (HepaCAM על העכבר) כסדר immunopanning. מאז צלחות BSL-1 ומשנית בלבד יסיר תאי אנדותל, כמו גם מיקרוגלייה, שינינו את הסדר CD45, משני בלבד, BSL-1, O4 של Itgb5 (HepaCAM על העכבר) כדי להגדיל את התשואה של מיקרוגלייה מ CD45 פאנינג מאכל. ב פרוטוקול זה, אנחנו גם perfused SD עכברוש הגורים (~ P7-P10) עם DPBS דרך מערכת הדם כדי להסיר תאי דם שונים כדי למזער את הזיהום של אוכלוסיות שאינן-microglial CD45-חיוביות.

ישנם מספר יתרונות של וזמינותו phagocytosis במבחנה . מחוון ה-pH בשימוש ההטיה synaptosome פולט רק פלואורסצנטי אדום בתנאי pH נמוך. לכן, בעת עיבוד נתונים, אנחנו יכולים ישירות לכמת פלואורסצנטי אדום כאות של אירועים phagocytic ללא הליך quenching להסיר רקע אותות או ניתוח ההדמיה מורכב כדי לקבל אותות משותפת לשפות אחרות של חומר אפף בפנים של phagocytes. בנוסף, שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר phagocytosis גליה על ידי לקיחת תמונות בעוצמה מחוון ה-pH בטווח רועי נתון בנקודות זמן מרובים. על ידי יצירת גרף בעוצמה מחוון ה-pH ל-100 h, היבלעות, כמו גם השפלה קיבולות ניתן בקלות לנטר בין תאים שונים ותנאים. יתרון נוסף הוא השימוש synaptosomes. מאחר האסטרוציטים ensheathe synapses כל הזמן עם קנס שלהם תהליכים, להיות מוצג להחריב הסינפסות ויוו4, באמצעות synaptosomes מתאימה מאוד למדידת במבחנה phagocytic הקיבולת של האסטרוציטים. בסופו של דבר, זה וזמינותו phagocytosis במבחנה יש פוטנציאל להיות מפותח ללמוד phagocytosis גליה של המיאלין פסולת או עמילואיד ביתא, אשר קשורה להפרעות נוירולוגיות שונות.

עם הגדלת תוחלת החיים, עלייה דרמטית במספר של חולים עם מחלות ניווניות הוא בלתי נמנע. סינפסה אובדן דרך תאי גליה היא אחד הגורמים המובילים13,מחלות ניווניות מספר14. בנוסף, גיזום סינפסה חריג, חוסר איזון של הומאוסטזיס המוח יכול להיות משויך phagocytosis גליה פגמים. לכן, זיהוי גורמים ותרכובות בהן שולטת הקיבולות היבלעות והשפלה של האסטרוציטים יכול להיות קריטי למציאת טיפולים מוצלחים בהפרעות נוירולוגיות שונות. מאז זה וזמינותו phagocytosis במבחנה ניתן לשנות בקלות עם צלחות multiwell, שיטה זו יכול לשמש פלטפורמה מתאימה עבור הקרנות שונות כדי לזהות גורמים כגון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים יונג יון-ג'ו לתמיכה ניסיוני שלה במהלך טיהור synaptosome ופארק Jungjoo על תמונות של synaptosomes עם חשיפה PS. בנוסף, אנו מודים לכל החברים במעבדה של צ'ונג לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (ה-NRF-2016M3C7A1905391 ו- NRF-2016R1C1B3006969) (וו-S. ג).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synaptosome purification
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 BIO-RAD 5000202
pH indicator conjugation
Dimethyl sulfoxide(DMSO) LPS solution DMSO100
pHrodo red, succinimidyl ester Molecula probes P36600
Immunopanning
10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) Sigma E7510
Bovine serum albumin Bovogen BSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase) Worthington Is002007
(DMEM) Gibco 11960-044
(dPBS) Welgene LB001-02
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) Vector Labs L-1100
Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) Jackson ImmunoResearch 115-005-044
Goat anti-mouse IgM (μ-chain) Jackson ImmunoResearch 115-005-020
Heparin-binding epidermal growth factor Sigma E4643
Human HepaCAM antibody R&D systems MAB4108
Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) eBioscience 14-0497-82
L-cysteine Sigma C7880
L-glutamate Gibco 25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC) Sigma A8199
Neurobasal media Gibco 21103-049
O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) Bansal et al.23
Papain Worthington Is003126
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Pluristrainer 20 μm PluriSelect 43-50020-03
Poly-D-lysine Sigma P6407
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Purified rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen 550539
Purified mouse anti-rat CD45 BD Pharmingen 554875
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Sodium selenite Sigma S5261
Transferrin Sigma T1147
Trypsin Sigma T9935
Trypsin inhibitor Worthington LS003086
Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) Beckman Coulter 344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) PALL MAP010C37
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) PALL MAP030C37
Phagocytosis live imaging assay
Juli stage NanoEntek
Time Series Analyzer V3 plugins https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164, (1-2), 183-196 (2016).
  2. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486, (7403), 410-414 (2012).
  3. Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13, (1), 22-24 (2010).
  4. Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504, (7480), 394-400 (2013).
  5. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, (4), 691-705 (2012).
  6. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539, (7629), 428-432 (2016).
  7. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155, (7), 1596-1609 (2013).
  8. Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36, (19), 5185-5192 (2016).
  9. Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28, (1), 20-33 (2014).
  10. Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8, (1), 301-311 (2013).
  11. Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model. Cell. 160, (6), 1061-1071 (2015).
  12. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530, (7589), 177-183 (2016).
  13. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352, (6286), 712-716 (2016).
  14. Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (36), 10186-10191 (2016).
  15. Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
  16. Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. (2015).
  17. Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34, (29), 9607-9620 (2014).
  18. Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
  19. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, (11), 1718-1728 (2008).
  20. Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96, (3), 656-668 (2006).
  21. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, (5), 799-811 (2011).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, (1), 264-278 (2008).
PH הרומן <em>חוץ גופית ב-</em> Live-הדמיה בתיווך וזמינותו של אסטרוציט Phagocytosis-שימוש Synaptosomes מצומדת-מחוון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).More

Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter