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Neuroscience

Un romanzo In Vitro Live-imaging dosaggio del Astrocyte-mediata fagocitosi utilizzando pH indicatore-coniugato sinaptosomi

doi: 10.3791/56647 Published: February 5, 2018

Summary

Questo protocollo presenta un in vitro live-imaging test di fagocitosi per misurare la capacità fagocitica dei astrocytes. Microglia e astrociti di ratto purificati vengono utilizzati insieme a sinaptosomi coniugato con indicatore di pH. Questo metodo in grado di rilevare in tempo reale engulfment e degradazione cinetica e fornisce una piattaforma di screening adatto per identificare i fattori che influenzano la fagocitosi di astrociti.

Abstract

Gli astrociti sono del tipo di cellule principali nel cervello e contattare direttamente le sinapsi e vasi sanguigni. Anche se le cellule microglial sono state considerate le principali cellule del sistema immunitario e fagociti solo nel cervello, recenti studi hanno dimostrato che gli astrociti anche partecipano a vari processi fagocitici, come eliminazione sinaptica inerente allo sviluppo e liquidazione dei placche di beta amiloide nel morbo di Alzheimer (annuncio). Nonostante questi risultati, l'efficienza di engulfment Astrocita e degradazione dei loro obiettivi è chiari rispetto a quello di microglia. Questa mancanza di informazioni è per lo più a causa della mancanza di un sistema di test in cui la cinetica della fagocitosi mediata da astrociti e microglia sono facilmente paragonabili. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo sviluppato un test a lungo termine live-imaging in vitro fagocitosi per valutare la capacità fagocitica di purificato astrociti e microglia. In questa analisi, rilevamento in tempo reale di engulfment e degradazione è possibile tramite sinaptosomi coniugato con indicatore di pH, che emettono fluorescenza rosso brillante in organelli acidi, come ad esempio i lisosomi. La nostra analisi novella fornisce rilevamento semplice ed efficace di fagocitosi attraverso live-imaging. Inoltre, questo test di fagocitosi in vitro utilizzabile come una piattaforma di screening per identificare le sostanze chimiche e composti che possono migliorare o inibire la capacità fagocitica dei astrocytes. Come disfunzione sinaptica potatura e accumulo di proteine patogene sono stati indicati per causare disturbi mentali o malattie neurodegenerative, prodotti chimici e composti che modulano la capacità fagocitica delle cellule glial dovrebbero essere utile nel trattamento di varie disturbi neurologici.

Introduction

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Le cellule gliali, che si riferiscono alle cellule non eccitabili nel cervello, sono il tipo principali delle cellule nel sistema nervoso centrale (SNC). In precedenza, le cellule glial erano considerate come semplici cellule di supporto che principalmente giocano un ruolo passivo nel mantenimento della sopravvivenza neuronale e sinaptica basale proprietà. Tuttavia, la prova emergente ha rivelato che le cellule gliali svolgono i ruoli più attivi in vari aspetti della neurobiologia, quali il mantenimento dell'omeostasi del cervello, mediando sinapsi formazione1,2,3 e sinapsi eliminazione4,5e modulante plasticità sinaptica6,7. Astrociti, microglia ed oligodendrociti sono cellule gliali del SNC. Tra queste cellule, astrociti e microglia hanno dimostrato di svolgere ruoli fagocitici inghiottendo sinapsi4,5, di cellule apoptotiche8, detriti neurali9e proteine patogene, quali amiloide beta le piastre10,11. Nel cervello in via di sviluppo, gli astrociti eliminano sinapsi nel nucleo genicolato laterale dorsale (missilistico) attraverso fagocitosi di MERTK - e MEGF10-dipendente4. Allo stesso modo, le microglia eliminano anche rivestite con C1q sinapsi durante fasi di sviluppo attraverso il classico del complemento cascata5. Interessante, è stato suggerito che i difetti in potatura sinapsi possono essere uno degli iniziatori di parecchi disordini neurologici. Ad esempio, è stato indicato che le mutazioni nel componente del complemento 4 (C4), che aumenta la potatura sinapsi complemento-mediata da microglia, sono fortemente associate con la prevalenza della schizofrenia negli esseri umani12. Una carta recente inoltre ha dimostrato che la via classica del complemento è iperattivata nelle fasi di iniziazione dell'annuncio e induce la perdita di sinapsi iniziale in questa malattia13.

Confrontato con la fagocitosi mediata da microglia, se fagocitosi mediata Astrocita contribuiscono all'avvio e alla progressione di vari disturbi neurologici è meno chiaro. Tuttavia, un recente documento suggerisce che fattori che alterano il tasso di potatura normale sinapsi dai astrocytes possono interferire con l'omeostasi del cervello e contribuiscono alla suscettibilità e patologia DC14. Il tasso di potatura di sinapsi dai astrocytes potentemente è controllato dagli isomeri di ApoE , con un allele protettivo per annuncio (ApoE2) migliorando fortemente il tasso e un allele di rischio per l'annuncio (ApoE4) abbassando significativamente il tasso. Inoltre, topi transgenici che esprimono ApoE4 accumulato C1q sinaptica molto di più rispetto a controllo o ApoE2 topi14. Questi dati suggeriscono che alterata fagocitosi Astrocita-mediata nei primi cervello dell'annuncio può indurre l'accumulo di detriti senescenti rivestite con C1q sinapsi/sinaptica che attiva la fagocitosi microglial complemento-mediata, degenerazione sinaptica di guida . L'alterata capacità fagocitica dei astrocytes nei portatori ApoE4 può anche contribuire all'accumulo incontrollato delle placche di beta amiloide nel cervello colpite AD.

Inoltre, esso ha dimostrato che le cellule gliali nel cervello invecchiato Drosophila perdono la loro capacità fagocitica grazie alla traduzione in diminuzione di Draper, un omologo di Megf10 che gli astrociti utilizzano per phagocytosing sinapsi. Il ristabilimento dei livelli di Draper salvato la capacità fagocitica delle cellule gliali, che efficacemente ha eliminato detriti axonal danneggiati nel cervello invecchiato in simile misura come quello nel cervello giovane, che indica che invecchiamento indotto da alterazioni nella capacità fagocitica di gli astrociti possono contribuire alla rottura del cervello omeostasi15.

Basato su queste nuove scoperte, modulando la capacità fagocitica dei astrocytes può essere una strategia terapeutica attraente per prevenire e curare vari disturbi neurologici. A questo proposito, ci sono stati diversi tentativi per migliorare la capacità fagocitica dei astrocytes, ad esempio, inducendo l'acidificazione dei lisosomi con nanoparticelle acide16 e che overexpressing EB (IL2RG), che può migliorare il fattore di trascrizione lisosoma biogenesi17. Nonostante questi tentativi, non è ancora chiaro come astrociti e microglia differenze nella loro cinetica fagocitica e se dovremmo aumentare o diminuire la loro capacità fagocitica in varie malattie.

In questa carta, presentiamo un'analisi novella in vitro per la rilevazione della capacità fagocitica dei astrocytes in tempo reale. I dati mostrano diversa cinetica di engulfment e degradazione in astrociti e microglia. Astrocita-condizionato mezzo (ACM), che contiene fattori secreti dagli astrociti, è essenziale per la fagocitosi efficace di astrociti e microglia. Inoltre, Megf10, un recettore fagocitico in astrocytes e un omologo di Ced-1 e Draper, gioca ruoli critici nella fagocitosi mediata Astrocita8,18.

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Protocol

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati da The Korea Advanced Institute of Science e tecnologia istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC), KA2016-08.

1. synaptosome purificazione

Nota: Queste procedure sono adattate da un articolo precedentemente pubblicato19 con varie modifiche per migliorare la resa di sinaptosomi purificati (Figura 1).

  1. Preparare i supporti gradiente discontinuo densità.
    1. Inserire le seguenti operazioni sul ghiaccio: 3%, 10% e 23% soluzioni gradienti di densità nel buffer di gradiente (portare a 250 mL di acqua con 109,54 g di saccarosio, 606 mg di Tris e 5 mL di EDTA 0.2 M, pH 7.4); buffer di omogeneizzazione (aggiungere 25 mL di buffer di gradiente: 4x e 500 µ l di 50 mM DTT in 74,5 mL di acqua); omogeneizzatore mortaio e pestello.
      Nota: Preparazione e soluzione di gradienti di densità sono presentati nella tabella 1. Per preparare 3%, 10% e 23% densità gradiente soluzioni, utilizzare soluzione gradienti di densità grezza.
    2. Preparare sei provette da centrifuga ultra-trasparente a tre topi adulti.
    3. Aggiungere 3 mL di soluzione gradienti di densità 23% sul fondo di ogni provetta da centrifuga con una pipetta 1 mL. Poi, lentamente e fare uno strato con 3 mL di soluzione al 10% densità gradiente in cima la soluzione di gradienti di densità 23% con una pipetta di pascolo e pipetta 1 mL. Infine, aggiungere 3 mL di soluzione gradienti di densità 3% sulla parte superiore. In questo passaggio, è necessario prestare attenzione per evitare l'introduzione di bolle.
    4. Coprire le provette per centrifuga con involucro di plastica e mantenere i tubi sul ghiaccio.
  2. Preraffreddare una centrifuga ad alta velocità e ultracentrifuga a 4 ° C.
  3. Sterilizzare l'apparecchiatura chirurgica (operativo forbici, forbici di primavera di Castroviejo e pinzetta) con etanolo al 70%. Preparare un bicchiere di vetro piccolo con 25 mL di buffer di omogeneizzazione su ghiaccio e pesare il beaker.
  4. Estrarre i cervelli di topo maschio adulto tre (circa 12 settimane).
    1. Dislocare la vertebra cervicale e tagliare il collo con forbici di funzionamento. Togliere la pelle della testa e del cranio lungo la linea mediana con delle forbici operative, forcipe curvo. Asportare i bulbi olfattivi e del cervelletto con forbici di primavera di Castroviejo.
  5. Mettere il cervello rimanente nel bicchiere graduato con il forcipe curvo e pesare i cervelli. Sciacquare i cervelli più volte con tampone di omogeneizzazione ghiacciata per rimuovere il sangue sulla superficie del cervello.
    Nota: In precedenza, 9 mL di buffer di omogeneizzazione a 1 g di tessuti cerebrali è stato consigliato.
  6. Aggiungere 4 mL di tampone e 1 g di tessuti cerebrali nel mortaio omogeneizzatore di omogeneizzazione. Mentre i cervelli di omogeneizzazione, aggiungere fino a 8 mL di buffer di omogeneizzazione.
  7. Dividere l'omogenato in due provette da centrifuga ad alta velocità da 50 mL. Lavare il mortaio con 1 mL di tampone fresco di omogeneizzazione e aggiungerlo ai tubi.
    Attenzione: Procedere con passaggi 1.3-1.7 come rapidamente come possibile. Meno di 20 min è raccomandato.
  8. Centrifugare gli omogeneati in provette da centrifuga ad alta velocità a 1.000 x g per 10 min a 4 ° C con freni più lenti.
    Nota: Impostare la velocità di decelerazione (freno) a due o tre, quando il tasso massimo di decelerazione è nove.
  9. Con attenzione aggiungere il surnatante ad un nuovo tubo da 50 mL e aggiungere fino a 12 mL di buffer di omogeneizzazione.
  10. Lentamente e con cautela Pipettare 2 mL di surnatante diluito rispetto alla soluzione di gradienti di densità 3% con una pipetta 1 mL e posizionare i tubi sul ghiaccio.
  11. Centrifugare a 31.000 x g per 5 min a 4 ° C senza freni.
    Nota: Impostare la velocità di decelerazione a uno (zero) o costa.
  12. Posizionare i tubi sul ghiaccio e raccogliere la frazione di synaptosome tra la soluzione gradienti di densità di 23% e 10% soluzione gradienti di densità con una pipetta di 2 mL in una provetta da 50 mL. Aggiungere saccarosio/EDTA ghiacciata fino a 80 mL di tampone e dividerlo in quattro provette da centrifuga ad alta velocità da 50 mL.
    Nota: Vedere la Figura 3 per sinaptosomi frazionati con gradienti con etichettate.
  13. Centrifugare a 20.000 x g per 30 min a 4 ° c con meno interruzioni.
    Nota: Impostare la velocità di decelerazione a due o tre, quando il tasso massimo di decelerazione è nove.
  14. Con attenzione rimuovere il surnatante con una pipetta 1 mL, risospendere il pellet di synaptosome con 1 mL di tampone fisiologico isotonica (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES e 10 millimetri di glucosio, pH 7.4)20. Aggiungere 1 mL di 10% DMSO nel buffer fisiologica isotonica (concentrazione finale di DMSO: 5%) e raccogliere i sinaptosomi in una provetta da centrifuga ad alta velocità da 50 mL.
  15. Aliquotare 1 mL in provette da 1,5 mL. Misurare la concentrazione di proteina di sinaptosomi usando l'analisi di Bradford.
  16. Rapidamente congelare i tubi e conservare i capillari in un congelatore-80 ° C fino a coniugazione di indicatore di pH.

2. pH indicatore coniugazione

  1. Centrifugare provette da 1,5 mL con sinaptosomi a 21.092 x g per 3-4 min a 4 ° C.
  2. Eliminare il surnatante, aggiungere 200 µ l di 0.1 M Na2CO3 e mescolare bene di pipettaggio.
    Nota: Na2CO3 è stato aggiunto per aumentare il pH come succinimidyl ester più efficientemente reagisce con le ammine primarie a pH leggermente alcalino.
  3. Aggiungere 2 µ l di indicatore di pH per la provetta e agitare delicatamente.
    Attenzione: Utilizzare 1 µ l di indicatore di pH per 0,3 mg di soluzione synaptosome.
  4. Minimizzare l'esposizione alla luce coprendo i tubi con carta stagnola e li Incubare per 1-2 h a temperatura ambiente (TA) in uno shaker di torsione con movimentazione delicata a 30-40 giri/min.
  5. Interrompere l'agitazione e aggiungere 1 mL di DPBS.
  6. Centrifugare le provette a 21.092 x g per 1-2 min.
  7. Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di DPBS per risospendere il pellet pipettando delicato.
  8. Ripetere i passaggi da 2.6-2.7 almeno sette volte per rimuovere l'indicatore di pH non associato.
  9. Rimuovere il supernatante e risospendere il sedimento con 200 µ l di DPBS con 5% DMSO.
    Nota: A questo punto, tutti i sinaptosomi sono non funzionali. Abbiamo confermato che la fosfatidilserina (PS) è stato esposto alla membrana esterna dei sinaptosomi, che funziona come un "mangiare-me" segnale (Figura 4).

3. gli astrociti e Microglia purificazione

Nota: Questo protocollo per purificazione di astrociti è adattato da un articolo precedentemente pubblicato21. In questo protocollo, la purificazione del ratto astrociti e microglia è descritto. Procedure specifiche per la purificazione del mouse astrociti e microglia inoltre sono descritti nelle note.

  1. Giorno prima purificazione
    1. Preparare piatti di cultura cellulare prepatinato e soluzioni.
    2. Preparare piatti Petri cinque 145 mm x 20 mm con 25 mL di 50 mM Tris-HCl (pH 9,5). Posto trattamento dell'anticorpo primario o secondario nei piatti Petri separatamente come descritto di seguito. Incubare i piatti nel congelatore per una notte.
      BSL-1 piatto: 20 µ l di 5 mg/mL BSL-1 (Griffonia simplicifolia lectina)
      Piatto di sola secondaria: 60 µ l di anti-topo di 2,4 mg/mL capra IgG + IgM (H + L)
      Piatto di CD45: 60 µ l di anti-topo di 2,4 mg/mL capra IgG + IgM (H + L)
      Piatto di O4: 60 µ l di anti-topo IgM (µ-catena specifica) di capra 2,4 mg/mL
      Itgb5 (integrina β5) piatto per astrocytes del ratto: 60 µ l di anti-topo di 2,4 mg/mL capra IgG + IgM (H + L)
      Nota: Per collegare anticorpo secondario alla superficie idrofoba del piatto Petri, lento attaccamento alle basse temperature è consigliato. Tuttavia, è possibile per il rivestimento della capsula di Petri con anticorpo secondario per 2 ore a 37 ° C. Anticorpi per il panning astrociti sono usati in modo diverso a seconda della specie animale; ad esempio, il HepaCAM piatto per gli astrociti del mouse: 60 µ l di anti-topo di 2,4 mg/mL capra IgG + IgM (H + L)
  2. Giorno di purificazione
    1. Preparare per immunopanning.
    2. Preparare le provette da 50 mL e aggiungere azioni ai tubi. La preparazione della soluzione stock dettagliata è presentata nella tabella 1.
      1. Preparare tubo 1 (enzima): 22 mL di brodo di enzima (Stock in enzima: 1x soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS)+0.46% D (+)-glucosio + 26 mM NaHCO3 e0,5 mM EDTA).
      2. Preparare il tubo 2 (bassa Ovo): 42 mL di brodo di inibitore (Stock in inibitore: 1 x EBSS+0.46% D (+)-glucosio + 26 Mm NaHCO3).
      3. Preparare tubo 3 (alta Ovo): 10 mL di brodo di inibitore.
    3. Fissare dei filtri per siringa da 0,22 µm per le punte di pipette 2 mL collegate ad un serbatoio di CO2 (95% O2 e 5% CO2). Bolla CO2 nelle provette 1-3. Smettere di bubbling quando le soluzioni diventano arancione.
    4. Le soluzioni complete.
      Attenzione: Completare e incubare la soluzione nella provetta 1 a 34 ° C per 15 min prima di utilizzare per l'attivazione degli enzimi.
      1. Preparare 1 tubo (enzima): 22 mL di brodo di enzima + 180 U di papaina + 0,004 g L-cisteina.
      2. Preparare il tubo 2 (bassa Ovo): 42 mL di brodo di inibitore + 3 mL di basso Ovo + 200 µ l di dnasi.
      3. Preparare il tubo 3 (alta Ovo): 10 mL di brodo di inibitore + 2 mL di Ovo alta + 20 µ l di dnasi.
      4. Preparare il tubo 4 (0,2% di BSA): 19 mL di 1 X DPBS + 1 mL di 4% BSA + 8 µ l di dnasi.
      5. Preparare la provetta 5 (0,02% BSA): 45 mL di 1 X DPBS + 5 mL di tubo 4 + 50 µ l di dnasi.
    5. Preriscaldare un blocco di calore e bagno di acqua a 34 ° C.
  3. Estratto di corteccia del ratto.
    1. Sterilizzare l'apparecchiatura chirurgica con etanolo al 70% e preparare piatti Petri-100mm con DPBS.
    2. Preparare una scatola acrilica. Mettere due o tre strati di tessuti nella parte inferiore della scatola e aggiungere 1 mL di isoflurane nella casella.
    3. Anestetizzare cuccioli per 20-40 s nella casella e confermare amputate con pizzico di piede con il forcipe. Esporre il cuore22 e irrorare cuccioli utilizzando una siringa da 10 mL con DPBS.
      Nota: Perfusione viene utilizzato per evitare la contaminazione delle cellule del sangue durante il passaggio di panning di microglia.
    4. Tagliare superiore linea cervicale del pup del collo con forbici operative e incise la pelle testa lungo la linea mediana. Praticare un'incisione sul cranio lungo la linea mediana e aprire il cranio con il forcipe curvo.
    5. Asportare il cervelletto con forbici di primavera di Castroviejo. Prendere il restante cervello e metterlo in una capsula Petri 100 mm riempito con DPBS.
    6. Rimuovere le altre zone come il mesencefalo e ippocampo dalla corteccia con forbici di primavera di Castroviejo sotto il microscopio. Rimuovere le meningi con una pinzetta.
    7. Trasferire la corteccia in un nuovo piatto di 60 mm e rimuovere i restanti DPBS nel piatto. Tagliare il tessuto con una lama n. 10.
  4. Dissociare la corteccia in una sospensione singola cella
    1. Versare la soluzione di tubo 1 filtrata in un piatto di 60 mm e aggiungere 50 µ l di DNase1. Agitare la soluzione nel piatto.
      Nota: Dnasi viene utilizzata per inibire l'aggregazione del DNA dalle cellule rotte.
    2. Mettere la teglia in un blocco di calore di 34 ° C e coprire con un coperchio che ha un buco nel mezzo. Utilizzare un saldatore per fare il buco nel coperchio di Petri di 60 mm.
    3. Collegare filtri per siringa 22-µm ad un tubo serbatoio di CO2 e posizionare la punta del filtro nel foro.
    4. Incubare il piatto a 34 ° C per 45 min. ricciolo la soluzione nel piatto ogni 10-15 min.
  5. Terminare la preparazione dei piatti panning.
    1. Rimuovere i panning piatti che sono stati rivestiti con anticorpi secondari dal congelatore un giorno prima del tempo. Lasciare il BSL-1 piatto e piatto solo anticorpo secondario a TA.
    2. Lavare gli altri piatti tre volte con 20 mL di DPBS.
    3. Versare una quantità adeguata di 0,02% BSA nei piatti. Inserire gli anticorpi primari specifici i piatti corrispondenti:
      Piatto di CD45: 12 mL di 0,02% BSA + 20 µ l di 0,5 mg/mL ratto anti-topo CD45
      Itgb5 piatto: 12 mL di 0,02% BSA + 20 µ l di 0,5 mg/mL Itgb5
      Piatto di O4: 8 mL di 0,02% BSA e 4 mL di anticorpo O4
      Nota: Per immunopanning del mouse, utilizzare anti-ratto di topo CD45 (0,5 mg/mL) per HepaCAM (0,5 mg/mL) per gli astrociti e la microglia.
    4. Preparare 30 mL di 30% FBS con neurobasal media e 10 mL di 1 X EBSS. Riscaldare entrambe le soluzioni in un bagno di acqua di 34 ° C.
  6. Inibire la reazione di papaina.
    1. Trasferire i tessuti trattati con papaina ad un nuovo tubo da 50 mL. Attendere che i tessuti a stabilirsi. Aspirare il liquido di aspirazione.
    2. Aggiungere 4 mL di soluzione di basso Ovo la provetta e agitare la soluzione per lavare le cellule.
    3. Ripetere i passaggi 3.6.1-3.6.2 tre volte per fermare la reazione enzimatica.
  7. Triturare i tessuti di corteccia.
    1. Aggiungere 6 mL di basso Ovo alla vasca. Aspirare e rilasciare i tessuti rapidamente con una pipetta 5 mL.
      Attenzione: Non introdurre bolle.
    2. Preparare un nuovo tubo da 50 mL e aggiungere 5 mL di basso Ovo. Raccogliere le singole cellule in un nuovo tubo.
    3. Ripetere due volte i passi 3.6.1-3.6.2 e modificare la pipetta 5 mL in una pipetta 1 mL.
    4. Ripetere triturazione fino a oltre il 95% dei tessuti non sono visibili.
    5. Fare uno strato di Ovo alta soluzione dalle cellule tubo 3 con una pipetta 10 mL sotto basso Ovo-contenente dissociato.
    6. Centrifugare a 190 x g per 6 min con pochi freni.
      Nota: Impostare la velocità di decelerazione a uno o due, quando il tasso massimo di decelerazione è nove.
  8. Celluli filtrato.
    1. Accuratamente aspirare il supernatante di aspirazione, quindi risospendere il sedimento con 3 mL di soluzione di BSA 0.02% con una pipetta 1 mL.
    2. Aggiungere 0.02% BSA soluzione fino a 9 mL.
    3. Preparare un nuovo tubo da 50 mL e 20 µm colino di cella sulla parte superiore del tubo. Bagnare il filtro cella con 1 mL di soluzione di BSA di 0,02%.
    4. Trasferire la sospensione unicellulare nel filtro cella. Filtro 1 mL alla volta.
    5. Lavare il filtro cella con 3 mL di soluzione di BSA di 0,02%. Non fare più di 15 mL della sospensione unicellulare filtrata.
    6. Incubare la provetta nel bagnomaria a 34 ° C per 45-60 minuti per il recupero delle cellule. Il passo di recupero cellulare permette per la rilocalizzazione delle proteine della superficie cellulare alla membrana.
  9. Eseguire il panning delle cellule.
    1. Lavare il piatto di panning CD45 tre volte con 20 mL di DPBS. Lavare ogni piatto tre volte con 20 mL di DPBS immediatamente prima dell'uso.
    2. Versare la sospensione unicellulare nel CD45 panning piatto. Lasciare il piatto per 28 min e scuotere il piatto per 14 min. Per rimuovere le celle non legate dal fondo, agitare accuratamente il piatto.
    3. Trasferire la sospensione cellulare al piatto solo secondario. Attendere 20 min e agitare accuratamente il piatto per 10 min. Per ottenere le microglia dal piatto di CD45, andare al punto 3.9.2.
    4. Trasferire la sospensione cellulare nel piatto BSL-1. Lasciare il piatto per 10-12 min.
    5. Trasferire nel piatto O4. Attendere 20 minuti e agitare per 10 min.
    6. Trasferire nel piatto Itgb5. Lasciare il piatto per 40 min e agitare delicatamente ogni 10 min.
      Nota: Per il mouse panning, trasferire la sospensione cellulare nel piatto HepaCAM.
  10. Staccare le cellule dal piatto.
    1. Mix 400 µ l di tripsina (30.000 U/mL in EBSS) con preincubato 8 mL di 1 X EBSS.
    2. Versare la sospensione cellulare staccato nel piatto in un secchio dei rifiuti.
    3. Lavare il piatto otto volte con DPBS.
    4. Versare 8 mL di EBSS con tripsina nel piatto.
    5. Incubare il piatto per 5/10 minuti nell'incubatore 37 ° C. Incubare per 10 minuti per il piatto di CD45 e 5 min per i piatti Itgb5 e HepaCAM.
    6. Toccare il piatto e osservare il piatto sotto un microscopio.
      Nota: Se la maggior parte degli astrociti non siano staccate, rimettere il piatto dell'incubatrice per un altro 5 min.
    7. Versare 10 mL di 30% FBS nel piatto per neutralizzare la tripsina.
    8. Pipettare su e giù nel piatto intero per staccare gli astrociti o microglia.
    9. Trasferire la soluzione in una provetta da 50 mL.
    10. Aggiungere 10 mL di 30% FBS e 200 µ l di dnasi nel piatto. Scollegare le cellule di nuovo. Dnasi viene utilizzata per inibire l'aggregazione del DNA dalle cellule rotte.
    11. Trasferire la soluzione nella provetta. Se le cellule rimangono nel piatto, aggiungere 10 mL di 30% FBS e staccare le cellule nuovamente.
  11. Le cellule della piastra.
    1. Centrifugare la provetta a 213 x g per 10 min.
    2. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare con i media.
      Nota: Utilizzare immunopanned multimediale di base di astrociti (IP-ABM) per gli astrociti e microglia retinica (MBM) multimediale di base con immunopanned Astrocita-condizionato media (IP-ACM) per microglia. L'IP-ABM e composizioni di MBM sono presentati nella Tabella materiali.
    3. Contare le celle con un emocitometro.
    4. Piastra l'astrociti e microglia separatamente in piastre rivestite con PDL.
      Nota: Preparare la piastra rivestite con PDL prima dell'uso. Per preparare piastre rivestite con PDL, aggiungere 50 µ l di 1 mg/mL poli-D-lisina in 5 mL di acqua distillata e versare una quantità adeguata di soluzione ben piatto/piatto e attendere 30 min lavare il piatto/piatto tre volte con acqua distillata.
    5. Incubare la piastra. Cambiare la metà dei media ogni 7 giorni per gli astrociti e 3 giorni per microglia.

4. raccogliere IP-ACM

  1. Preparare un piatto di 100 mm quando gli astrociti sono eccessivamente confluenti.
  2. Scartare i media e lavare il piatto tre volte con 10 mL di DPBS.
  3. Il piatto, versare 15 mL di media povera in proteine.
    Nota: La composizione media povera in proteine è presentata nella Tabella materiali.
  4. Incubare il piatto per 7-10 giorni nell'incubatore 37 ° C.
  5. Raccogliere e concentrare i media con 10k (o 30K) tubi filtro centrifugo.
  6. Centrifugare le provette a 851 x g a 4 ° C.
    Nota: Centrifugare le provette fino a quando i rimanenti media è meno di 1 mL.
  7. Raccogliere media concentrata (IP-ACM) in una provetta da 1,5 mL nuova.
  8. Misurare la concentrazione di IP-ACM usando l'analisi quantitativa

5. test di imaging Live fagocitosi (Figura 2)

  1. Preparare una piastra a 24 pozzetti (o qualsiasi piatto/piatto che viene preparato per l'imaging di vivere) in cui gli astrociti sono confluenti (generalmente, 7-10 giorni di incubazione dopo la purificazione è ideale per stabilizzare le cellule).
  2. Rimuovere il supporto in ciascun pozzetto e lavare i pozzetti con 1 mL di DPBS, tre volte. Per ridurre al minimo l'esposizione all'aria, lavare i pozzetti rapidamente.
  3. Aggiungere 300 µ l di IP-ABM con 5 µ l di pH indicatore-coniugato sinaptosomi e fattori supplementari quali IP-ACM che possono modulare la fagocitosi delle cellule gliali.
  4. Incubare la piastra in un incubatore a CO2 per 40 min. Questo passaggio consente il pH indicatore-coniugato sinaptosomi di depositarsi sul fondo delle piastre.
  5. Rimuovere il supporto con sinaptosomi coniugato con indicatore di pH non associato e lavare ogni pozzetto con 1 mL di DPBS, tre volte.
    Attenzione: Non lavare duramente. Per ridurre al minimo l'esposizione all'aria, lavare i pozzetti rapidamente.
  6. Aggiungere 500 µ l di IP-ABM con ulteriori fattori di testare nei pozzetti.
  7. Prendere la piastra per uno strumento di imaging live e selezionare posizioni. Regolare la messa a fuoco, tempo di esposizione, luminosità e LED di potenza.
    Nota: Le impostazioni per il tempo di esposizione, luminosità e LED di potenza sono variabile a seconda dell'intensità di fluorescenza e lo scopo dell'esperimento. Nell'analisi live-imaging con sinaptosomi coniugato con indicatore di pH, impostiamo solitamente quei valori come segue: esposizione: ~ 150-200 ms, luminosità: 15 e LED di potenza: 4-6.
  8. Impostare il formato di immagine, intervallo di tempo e il numero totale di cicli per l'imaging di vivere. Impostare l'intervallo di tempo su 1 o 2 ore a seconda di quante posizioni sono selezionati. 2 ora intervalli sono raccomandati quando sono selezionati più di 150 posizioni per l'imaging di vivere.
  9. Iniziare gli esperimenti di live-imaging.
  10. Analizzare i dati.
    1. Aprire il programma di Fiji.
    2. Importare una sequenza di immagini. Convertire le immagini in scala di grigi a 8 bit.
    3. Eseguire la sottrazione di sfondo con un rolling bar raggio di 50 pixel.
    4. Avviare ora serie analizzatore V3 plugin.
      Nota: L'indirizzo per analizzatore di tempo serie V3 plugin è presentato nella Tabella materiali.
    5. Trascina la regione di interesse (ROI) per l'immagine e fare clic su Aggiungi nel gestore di ROI.
    6. Fare clic su "Get intensità totale" della serie di tempo V3_0.
    7. Salvare i risultati e l'integrazione dei dati.

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Representative Results

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In questo in vitro test di fagocitosi con imaging di vivere a lungo termine, abbiamo usato sinaptosomi da omogenati di cervello di topo adulto, che sono stati separati nella soluzione gradiente tra soluzione gradiente 23% e 10% pendenza soluzione per ultracentrifugazione ( Figura 3). Dopo la preparazione, sinaptosomi esposti PS nella loro membrana esterna (Figura 4), suggerendo che hanno perso la loro funzione e potrebbero essere riconosciuti dai recettori di PS in astrociti e microglia. Come illustrato nella Figura 5, sinaptosomi coniugato indicatore pH emessa fluorescenza rosso brillante quando essi sono stati inghiottiti dai astrocytes. Confronto in tempo reale delle capacità engulfment e degradazione delle cellule gliali è possibile prendendo immagini multiple di un ROI ogni 1 o 2 h (complementare Movie 1, complementare Movie 2). Con questo metodo, abbiamo dimostrato cinetiche diverse della fagocitosi mediata da astrociti e microglia (Figura 6). Per quantificare la fagocitosi delle cellule gliali, è stata misurata l'area (µm2) del segnale di fluorescenza rossa, che viene definito indice fagocitico in Figura 6B e Figura 7. Anche se gli astrociti sembravano essere efficiente nel phagocytosing grandi quantità di sinaptosomi coniugato con indicatore di pH, microglia erano più veloci a inghiottendo e degradanti sinaptosomi (Figura 6B). Microglia ha mostrato l'intensità indicatore pH massimo a 26 h dopo il trattamento di synaptosome coniugato con indicatore di pH, mentre gli astrociti hanno mostrato il loro massimo a 45 h (p-valore < 0.05, ANOVA a due vie tra astrociti con 1 X ACM e microglia con 1 X ACM). Allo stesso modo, le cellule microglial ha mostrate una riduzione di 20,7% nell'intensità dell'indicatore pH totale 40 h dopo il punto di picco, mentre gli astrociti hanno mostrato una riduzione del 17% nell'intensità dell'indicatore di pH totale durante lo stesso periodo di tempo. Interessante, i nostri dati hanno mostrato che fattori Astrocita-secreto, che erano contenuti in ACM, sono essenziali per aumentare entrambi fagocitosi mediata da astrociti e microglia (Figura 6B). Gli astrociti sono stati indicati per rilasciare molecole passerella, come MFGE8, GAS6 e proteine, che possono colmare e indurre interazioni tra recettori fagocitici e "mangiare-me" segnali come PS23. Come accennato in precedenza, gli astrociti eliminano sinapsi attraverso le vie MERTK e MEGF104. MEGF10 è espresso solo da astrociti nel cervello e partecipa a engulfment sinapsi attraverso riconoscendo "mangiare-me" segnali con identità sconosciuta. In accordo con i risultati precedenti, l'analisi ha mostrato che confrontato con i astrocytes del mouse di wild type (WT), Megf10 knock-out (KO) del mouse astrociti posseduto significativamente alterata capacità fagocitica (Figura 7). Confrontato con i astrocytes WT, Megf10 KO astrocytes hanno mostrato una riduzione di circa il 40% nell'intensità dell'indicatore pH totale presso il punto di picco (31H) (Figura 7).

Figure 1
Figura 1. Schematica di purificazione di astrociti utilizzando metodi di immunopanning. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Schematica del test di fagocitosi live-imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Frazionamento di omogenato di cervello rappresentante nelle soluzioni gradiente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Immagini rappresentative di sinaptosomi esposte al PS. (A), A immagine di campo luminoso dei astrocytes con sinaptosomi. Synaptosomes sono attaccati al astrociti. (B) un immagine fluorescente di sinaptosomi tdTomato-positivi, che sono purificati dal mouse che esprimono tdTomato cervelli. (C) pSIVA si lega al PS, che è esposto alla membrana esterna di synaptosome ed emette fluorescenza verde. (D) PS rilevato da pSIVA (verde) è co-localizzato con sinaptosomi tdTomato-positivo (rossi). Barra della scala: 20 µm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Nella figura 5. Rappresentativo del campo luminoso e immagini fluorescenti dei astrocytes con sinaptosomi coniugato con indicatore di pH in due punti temporali. A 11 h dopo il trattamento (pannello inferiore), pH indicatore-coniugato sinaptosomi sono inghiottiti dai astrocytes ed emettono fluorescenza rossa mentre lo fanno non a 1 h dopo il trattamento (pannello superiore). Barra della scala: 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Nella figura 6. Fagocitica cinetica del ratto astrociti e microglia attraverso immagini di vivere a lungo termine. (A) A diagramma schematico di un test in vitro fagocitosi usando purificati astrociti e microglia insieme sinaptosomi coniugato con indicatore di pH. Nota prima di immagini in diretta sono presi, non associati sinaptosomi vengono lavati via dopo 40 min di incubazione. (B) rappresentante grafici che mostrano la cinetica engulfment e degradazione di astrociti e microglia. ACM, che contiene fattori secreti Astrocita, aumenta significativamente entrambi assorbimento di synaptosome mediata da astrociti e microglia. Astrocita: Controllo vs Astrocyte con ACM 1 X, * * *, di Tukey test comparazioni multiple. Microglia: Controllo vs Microglia con ACM 1 X, * * *, Tukey di più test di confronto. Barre di errore indicano s.e.m. *p ≤ 0.05, * * * p ≤ 0,0001, ANOVA a due vie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Nella figura 7. Diminuita capacità fagocitica dei astrocytes del mouse Megf10 KO con 1 X ACM paragonato a quello dei astrocytes del mouse WT con 1 X ACM. WT vs Megf10 KO astrociti con 1 X ACM, * * *, ANOVA a due vie. Barre di errore indicano s.e.m. * p ≤ 0.05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001 ANOVA a due vie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: ricette soluzione. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Film supplementare 1. Un rappresentanza live-imaging per applicazioni video che mostra la fagocitosi del pH indicatore-coniugato sinaptosomi dai astrocytes. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Film supplementare 2. Un video live-formazione immagine rappresentativo risultati fagocitosi di pH indicatore-coniugato sinaptosomi di cellule microgliali. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

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In questo articolo, presentiamo metodi per un lungo termine test di fagocitosi live-imaging in vitro utilizzando cellule gliale purificate e sinaptosomi coniugato con indicatore di pH. Indichiamo che confrontato con microglia, astrociti possiedono diverse capacità engulfment e degradazione durante la fagocitosi dei sinaptosomi. Inoltre, i nostri dati suggeriscono che fattori Astrocita-secreto, che contengono molecole passerella come GAS6, proteine e MEGE8, sono essenziali per efficiente fagocitosi di PS-dipendente delle cellule glial nel cervello. Inoltre, Megf10 KO astrociti Visualizza fagocitosi difettosa di sinaptosomi.

Per eseguire correttamente questo esperimento, i media e DPBS devono essere scambiati con attenzione durante le fasi di lavaggio (sezione 5). Primario coltivati astrociti e microglia, soprattutto microglia, sono vulnerabili per l'esposizione all'aria. Di conseguenza, ridurre gli intervalli di tempo tra i passaggi di lavaggio è fondamentale per mantenere le cellule vive. Per l'impostazione a lungo termine live-imaging con strumenti live-imaging, messa a fuoco manuale è consigliato poiché la messa a fuoco automatica può aumentare il tempo di esposizione laser/LED, che poteva danneggiare le cellule.

In questo metodo, il protocollo di purificazione synaptosome19 è leggermente modificata. La carta originale separa soluzioni gradienti in 3%, 10%, 15% e 23%. Tuttavia, abbiamo istituito soluzioni gradiente 3%, 10% e 23% per aumentare il rendimento dei sinaptosomi purificati. In questo metodo vengono modificate anche le istruzioni per immunopanning astrociti e microglia. L'obiettivo dell'originale panning protocollo21 è purificare solo astrociti ed usare BSL-1, solo secondaria, CD45, O4 e Itgb5 (HepaCAM per mouse) come l'ordine di immunopanning. Poiché sola secondaria e BSL-1 piastre rimuoverà le cellule endoteliali, nonché microglia, abbiamo cambiato l'ordine per CD45, sola secondaria, BSL-1, O4 e Itgb5 (HepaCAM per mouse) per aumentare il rendimento di microglia dal CD45 panning piatto. In questo protocollo, abbiamo anche irrorati cuccioli del ratto SD (~ P7-P10) con DPBS attraverso il sistema circolatorio per rimuovere vari globuli per minimizzare la contaminazione da popolazioni non-microglial CD45-positivi.

Ci sono diversi vantaggi del test di fagocitosi in vitro . L'indicatore di pH utilizzato nella coniugazione synaptosome solo emette fluorescenza rossa in condizioni di basso pH. Pertanto, durante l'elaborazione dei dati, possiamo quantificare direttamente fluorescenza rossa come un segnale di fagocitici eventi senza una procedura di spegnimento per rimuovere sfondo segnali o analisi di imaging complesse per ottenere segnali co-localizzati di tratta materiale all'interno di fagociti. Inoltre, questo metodo consente l'inseguimento in tempo reale della fagocitosi glial prendendo immagini di intensità dell'indicatore di pH all'interno di un determinato ROI più intervalli di tempo. Generando un grafico con intensità dell'indicatore di pH fino a 100 h, il engulfment così come degradazione capacità possono essere facilmente monitorate tra condizioni e celle diverse. Un altro vantaggio è l'uso di sinaptosomi. Dal momento che gli astrociti ensheathe sinapsi elabora tutto il tempo con loro belle e sono stati indicati per fagocitare sinapsi in vivo4, utilizzando sinaptosomi è molto adatto a misurare la capacità fagocitica in vitro degli astrociti. Infine, questo test di fagocitosi in vitro ha il potenziale per essere sviluppato per studiare glial fagocitosi dei detriti o amiloide beta mielina, che è legato a vari disturbi neurologici.

Con maggiore aspettativa di vita, un drammatico aumento del numero di pazienti con malattie neurodegenerative è inevitabile. Perdita di sinapsi attraverso cellule gliali è uno dei fattori più importanti in diversi neurodegenerative malattie13,14. Inoltre, potatura sinapsi anomale e uno squilibrio dell'omeostasi del cervello può essere associati con i difetti gliali fagocitosi. Pertanto, identificazione di fattori e composti in grado di controllare le capacità di engulfment e degradazione degli astrociti potrebbe essere critico per l'individuazione dei trattamenti di successo per vari disturbi neurologici. Poiché questo test di fagocitosi in vitro possono essere facilmente scalato con piastre multipozzetto, questo metodo può essere utilizzato come una piattaforma adatta per varie proiezioni per identificare tali fattori.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Jung Yeon-Joo per il suo sostegno sperimentale durante la purificazione di synaptosome e Jungjoo Park per le immagini degli synaptosomes con esposizione di PS. Inoltre, ringraziamo tutti i membri nel laboratorio di Chung per utile discussione. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Research Foundation di sovvenzione di Corea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 e NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. C).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synaptosome purification
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 BIO-RAD 5000202
pH indicator conjugation
Dimethyl sulfoxide(DMSO) LPS solution DMSO100
pHrodo red, succinimidyl ester Molecula probes P36600
Immunopanning
10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) Sigma E7510
Bovine serum albumin Bovogen BSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase) Worthington Is002007
(DMEM) Gibco 11960-044
(dPBS) Welgene LB001-02
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) Vector Labs L-1100
Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) Jackson ImmunoResearch 115-005-044
Goat anti-mouse IgM (μ-chain) Jackson ImmunoResearch 115-005-020
Heparin-binding epidermal growth factor Sigma E4643
Human HepaCAM antibody R&D systems MAB4108
Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) eBioscience 14-0497-82
L-cysteine Sigma C7880
L-glutamate Gibco 25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC) Sigma A8199
Neurobasal media Gibco 21103-049
O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) Bansal et al.23
Papain Worthington Is003126
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Pluristrainer 20 μm PluriSelect 43-50020-03
Poly-D-lysine Sigma P6407
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Purified rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen 550539
Purified mouse anti-rat CD45 BD Pharmingen 554875
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Sodium selenite Sigma S5261
Transferrin Sigma T1147
Trypsin Sigma T9935
Trypsin inhibitor Worthington LS003086
Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) Beckman Coulter 344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) PALL MAP010C37
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) PALL MAP030C37
Phagocytosis live imaging assay
Juli stage NanoEntek
Time Series Analyzer V3 plugins https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Un romanzo <em>In Vitro</em> Live-imaging dosaggio del Astrocyte-mediata fagocitosi utilizzando pH indicatore-coniugato sinaptosomi
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Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).More

Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).

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