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Neuroscience

貪食能アッセイのアストロ サイトを介した新規体外ライブ イメージングを使用して pH インジケーター共役シナプトソーム

doi: 10.3791/56647 Published: February 5, 2018

Summary

このプロトコルは、アストロ サイトの貪食能を測定するライブ イメージングの in vitro貪食アッセイを提示します。精製したラット アストロ サイトやミクログリアは、pH インジケーター共役シナプトソームと共に使用されます。このメソッドは、リアルタイムの貪食・分解速度を検出することができ、アストロ サイト細胞貪食の変調の要因を識別するために適切なスクリーニングのプラットフォームを提供します。

Abstract

アストロ サイトは脳の主要な細胞型であり、シナプスや血管に直接お問い合わせください。アストロ サイトはまた発達シナプスの除去とのクリアランスなど、様々 な貪食プロセスに参加を最近の研究で示されているミクログリア細胞は、主要な免疫細胞と脳の食のみと考えられてきたがアルツハイマー病 (AD) におけるアミロイド β 斑。これらの調査結果にもかかわらずアストロ貪食の効率とそのターゲットの劣化は不明ミクログリアのそれと比較します。情報の欠如は、たいがいは、アストロ サイト、ミクログリアによる貪食能の動態が簡単に匹敵するアッセイ システムの欠如です。この目標を達成するためには、精製されたアストロ サイトやミクログリアの貪食能を評価する長期的なライブ イメージングの in vitro貪食能試の金を開発しました。このアッセイで貪食・分解のリアルタイム検出は、リソソームなどの酸性オルガネラの明るい赤の蛍光を発する pH インジケーター共役シナプトソームを使用して可能です。当社の新規アッセイは、ライブ イメージングによる貪食のシンプルで効果的な検出を提供します。さらに、このin vitro貪食アッセイは、化学物質とを強化したり、アストロ サイトの貪食能を阻害する化合物を識別するためにスクリーニングのプラットフォームとして使用できます。シナプスの刈り込みの異常と病原性蛋白質の蓄積は、精神疾患や神経変性疾患の原因と示されている、化学薬品およびグリア細胞の貪食能を調節する化合物を様々 な治療に役立つはず神経疾患。

Introduction

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脳の非興奮性細胞を参照、グリア細胞は、中枢神経系 (CNS) における主要な細胞タイプです。以前は、グリア細胞は、主に神経細胞の生存と基底のシナプス特性を維持するために受動の役割を果たす単なる支持細胞として見なされていた。ただし、出現の証拠は明らかにしたグリア細胞がシナプス形成1,2,3とシナプスを媒介する脳のホメオスタシス維持などの神経生物学のさまざまな側面でより積極的な役割を果たしています。除去45、および変調シナプス可塑性6,7。中枢神経系のグリア細胞には、オリゴデンドロ サイト、ミクログリア、アストロ サイトが含まれます。これらの細胞、アストロ サイト、ミクログリアの中でシナプス4,5、アポトーシス細胞8、ニューラル破片9、およびアミロイド β などの病原性タンパク質を巻き込むによる貪食の役割を果たすことが示されています。斑10,11。脳の発達、アストロ サイトから MERTK と神経: MEGF10 依存貪食4背側外側膝状核 (dLGN) でシナプスを排除します。同様に、ミクログリアはまた古典的な補体カスケード5を通じて発達段階のシナプスの C1q コーティングを除去します。興味深いことに、シナプス刈り込みの欠陥がいくつかの神経疾患の創始者の 1 つをすることができますが示唆されています。たとえば、(C4) に補体成分 4 の変異ミクログリアによって補体を介したシナプス刈り込みを生じ、強く人間12で統合失調症の有病率に関連付けられて示されています。最近の論文では、古典的補体経路 hyperactivated は、広告の開始段階とこの疾患13初期シナプス損失を誘発することも示しています。

ミクログリアを介した貪食と比べると、アストロ サイトを介した貪食が開始し、さまざまな神経疾患の進行に寄与するかどうかは不明瞭です。しかし、最近の論文は示唆やアストロ サイトによる通常のシナプス刈り込みの率を変える要素脳のホメオスタシスを混乱させる可能性があります広告感受性と病理14に貢献。アストロ サイトによるシナプス刈り込みの力強く、アポの異性、広告 (ApoE2) の保護の対立遺伝子と強く強化率と率を大幅に削減 (ApoE4) の広告の危険の対立遺伝子によって制御されます。また、 ApoE4を発現するトランスジェニック マウスの制御やApoE2マウス14よりもはるかに多くのシナプス C1q 蓄積。これらのデータは、初期のアストロ サイトを介した貪食能を障害する示唆している AD 脳活性化補体を介したミクログリア細胞貪食、シナプス変性を運転する老齢 C1q コーティング シナプス/シナプスの残骸の蓄積を引き起こす可能性があります.ApoE4キャリアにおけるアストロ サイトの障害の貪食能も広告の影響を受けた脳アミロイド ・ ベータ斑の制御不能な蓄積に貢献するかもしれない。

さらに、高齢者のショウジョウバエ脳のグリア細胞がドレイパー、アストロ サイトがシナプスを phagocytosing 用神経: Megf10の相同物の減らされた翻訳による貪食能力を失うことが示されています。ドレイパー レベルを復元救出効率的に瓦礫損傷した軸索が老化誘導を示す若い脳と同程度に高齢者の脳のグリア細胞の貪食能の貪食能の変化アストロ サイト脳のホメオスタシスの15の破壊に貢献するかもしれない。

これらの新しい調査結果に基づいて、予防し、様々 な脳神経疾患を治療する魅力的な治療戦略になる可能性がありますアストロ サイトの貪食能を調節すること。この点で、リソソーム酸性ナノ16の酸性化を誘導し、トランスクリプション要因 EB (TFEB) は、強化することができますを過剰発現によるアストロ サイトなどの貪食能を強化するいくつかの試みがずっとあります。リソソーム器官17。これらの試みにもかかわらずまだわかりにくい各アストロ サイトやミクログリア細胞の貪食反応速度論で異なると増加か各種疾患における貪食能力を減少する必要がありますか。

アストロ サイトの貪食能をリアルタイムで検出するための新規の in vitroアッセイを提案します。データは、アストロ サイト、ミクログリアの貪食・分解の別の速度を表示します。アストロ エアコン媒体 (ACM)、アストロ サイトから分泌因子が含まれ、アストロ サイト、ミクログリアの効果的な貪食能に不可欠です。さらに、神経: Megf10、アストロ サイト、 Ced 1ドレイパーの相同物の貪食受容体貪食のアストロ サイトを介した8,18で重要な役割を果たしています。

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Protocol

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ここで説明するすべての方法は、韓国先端科学技術機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、KA2016-08 によって承認されています。

1. synaptosome 浄化

注: これらの手順は精製シナプトソーム (図 1) の収量を改善するためにいくつかの変更以前に発行された紙19から合わせられます。

  1. 不連続密度勾配メディアを準備します。
    1. 氷の上の次の場所: グラデーションのバッファーで 3%、10%、23% の密度勾配ソリューション (ショ糖の 109.54 g、トリス、606 mg 0.2 M の EDTA、pH 7.4 の 5 mL と水 250 mL に持って来る);均質化バッファー (グラデーション バッファー x 4 の 25 mL と 50 mm DTT 74.5 mL の水に 500 μ L を追加)。ホモジナイザー乳鉢と乳棒。
      注: 密度勾配ソリューションと準備は、表 1に掲載されています。3%、10%、23% の密度勾配のソリューションを準備するには、生密度勾配ソリューションを使用します。
    2. 3 アダルト マウスごとに六つの超クリアな遠心チューブを準備します。
    3. 1 mL ピペットでそれぞれ遠心管の底に 23% 密度勾配液 3 mL を加えます。その後、徐々 に牧草地ピペット 1 mL ピペットと 23% の密度勾配ソリューションの上位 10% 密度グラデーション溶液 3 mL を含むレイヤー。最後に、上 3% 密度勾配液 3 mL を加えます。このステップでは、気泡を導入することを避けるために注意を使用します。
    4. 遠沈管プラスチック製のラップをカバーし、チューブを氷の上。
  2. 高速遠心分離機、4 ° C を超遠心機を precool します。
  3. 70% エタノール (カストロヴィーホー春はさみ、はさみそしてカーブタイプ鉗子を営業) 手術用機器を滅菌します。25 mL の氷の上の均質化バッファーと小さなガラスのビーカーを準備し、ビーカーの重量を量る。
  4. 3 大人 (約 12 週齢) 男性マウスから脳を抽出します。
    1. 頚椎骨折、脱臼、はさみを動作で首を切る。営業はさみとカーブタイプ鉗子を使用して正中線に沿って頭蓋骨と頭の皮をはがします。カストロヴィーホー春ハサミ嗅球と小脳を切除します。
  5. カーブタイプ鉗子でビーカーに残りの脳を入れ、脳の重量を量る。数回で冷たい均質化バッファーを脳の表面に血液を削除して脳をすすいでください。
    注: 以前は、9 mL の 1 g 脳組織の均質化バッファーを推奨されました。
  6. バッファーと 1 g ホモジナイザー モルタルに脳組織の均質化の 4 つの mL を追加します。脳を均質化中、追加 8 mL のバッファーを均質化します。
  7. 磨砕液を 50 mL 高速遠心管を 2 つに分割します。1 ml の新鮮な均質化バッファーのモルタルを洗浄し、チューブを追加します。
    注意: は、できるだけ早く 1.3 1.7 の手順を続行します。20 分未満をお勧めします。
  8. 低速ブレーキが 4 ° C で 10 分間 1,000 x g で高速遠心分離機管のホモジネートを遠心します。
    注: は、減速率の最大は 9 時 2 つまたは 3 つで減速 (ブレーキ) を設定します。
  9. 慎重に新しい 50 mL チューブに上清を追加し、最大 12 mL の均質化バッファーを追加します。
  10. 慎重に、ゆっくりと 1 mL ピペットで 3% の密度勾配ソリューションで希薄化後の上澄みの 2 mL のピペットし、氷の上にチューブを配置します。
  11. ブレーキ無しで 4 ° C で 5 分間 31,000 × g で遠心分離機します。
    注: 1 つ (ゼロ) 減速レートを設定または海岸します。
  12. 氷の上にチューブを配置し、50 mL チューブに 23% 密度勾配液 10% 密度勾配溶液 2 mL ピペットと synaptosome 分画を収集します。冷たいスクロース/EDTA を追加バッファー 80 mL と 50 mL 高速遠心分離機管の 4 つに分割します。
    注: ラベル付きグラデーションで分別されたシナプトソームの図 3を参照してください。
  13. 少ない区切りで 4 ° C で 30 分間 20,000 × g で遠心分離機します。
    注: は、減速率の最大は 9、2 つまたは 3 つで減速レートを設定します。
  14. 慎重に 1 mL ピペットで上澄みを除去、1 ml の等張生理バッファー (140 mM の NaCl、3 mM KCl、1.2 mM MgCl2、1.2 mM NaH2PO4、10 mM HEPES、および 10 mM グルコース、pH 7.4)20synaptosome ペレットを再懸濁します。等張生理バッファーに 1 mL の 10 %dmso を追加 (DMSO の最終濃度: 5%) 1 つ 50 mL 高速遠心管に、シナプトソームを収集。
  15. 1.5 mL チューブに分注 1 mL。ブラッドフォードの試金を使用してシナプトソームの蛋白濃度を測定します。
  16. すぐにチューブを凍結し、-80 ° C ディープ フリーザーで pH インジケーターの活用までチューブを格納します。

2. pH インジケーターの活用

  1. 4 ° C で 3 〜 4 分 21,092 x g でシナプトソームと 1.5 mL チューブを遠心分離します。
  2. 上澄みを除去、ピペッティングでよく 200 μ L 0.1 M Na2CO3とミックスを追加します。
    注: Na2CO3サクシニミジルエステルとして最も効率的に pH が上昇する pH は弱アルカリ性でアミンと反応を追加しました。
  3. チューブと優しく渦に pH 指示薬の 2 μ L を追加します。
    注意: は、synaptosome ソリューションの 0.3 mg 当たり pH 指示薬の 1 μ L を使用します。
  4. アルミ箔の管を覆うことによって光照射を最小限に抑え、30 40 rpm で穏やかな攪拌とツイスト シェーカーで室温 (RT) で 1-2 時間のそれらを孵化させなさい。
  5. 撹拌を停止し、DPBS の 1 mL を追加します。
  6. 1-2 分の 21,092 x g でチューブを遠心します。
  7. 上澄みを除去し、穏やかなピペッティングでペレットを再懸濁しますに DPBS 1 mL を加えます。
  8. 非連結 pH インジケーターを削除する手順 2.6 2.7 少なくとも 7 回を繰り返します。
  9. 上澄みを除去し、5% dmso DPBS の 200 μ L でペレットを再懸濁します。
    注: この時点で、すべてシナプトソームが機能しません。シナプトソームとして機能するの外膜にさらされた、ホスファチジルセリン (PS) を確認して、"食べる-私」信号 (図 4)。

3. アストロ サイトやミクログリア浄化

注: アストロ サイト浄化のためこのプロトコルは以前に発行された紙21から適応です。このプロトコルでは、ラット アストロ サイトやミクログリアの浄化を説明します。ノートにマウスのアストロ サイトやミクログリアを浄化するための特定の手順について述べる。

  1. 精製前に、の日
    1. プレコート細胞培養皿とソリューションを準備します。
    2. 5 145 mm × 20 mm のペトリ皿 50 mm トリス-HCl (pH 9.5) 25 ml を準備します。下記のとおり別途ペトリ皿にプライマリまたはセカンダリの抗体治療を配置します。一晩冷凍庫で料理を孵化させなさい。
      BSL 1 皿: 5 mg/mL BSL 1 の 20 μ L (グリフォニア simplicifolia レクチン)
      二次だけの料理: 2.4 mg/mL ヤギ抗マウス IgG + IgM (H + L) 60 μ
      CD45 料理: 2.4 mg/mL ヤギ抗マウス IgG + IgM (H + L) 60 μ
      O4 料理: 60 μ L の 2.4 mg/mL ヤギ抗マウス igm 抗体 (μ 鎖特異的)
      ラット アストロ サイトの Itgb5 (インテグリン β5) 料理: 2.4 mg/mL ヤギ抗マウス IgG + IgM (H + L) 60 μ
      注: ペトリ皿の疎水性表面に二次抗体を付ける低温低速添付ファイルが推奨です。しかし、それは 37 ° C で 2 時間二次抗体とペトリ皿をコーティングすることがアストロ サイトのパンのための抗体は動物種によって使い分けるマウスのアストロ サイトのための例えば、HepaCAM 料理: 2.4 mg/mL ヤギ抗マウス IgG + IgM (H + L) 60 μ
  2. 浄化の日
    1. Immunopanning を準備します。
    2. 50 mL チューブを用意し、チューブに株式を追加します。詳細な在庫ソリューション準備は、表 1で示されます。
      1. 酵素株式の管 1 (酵素) を準備: 22 mL (酵素株式: Earle 平衡塩溶液 x 1 (EBSS)+0.46% D-(+)-グルコース + 26 mM NaHCO30.5 mM EDTA).
      2. 阻害剤ストック チューブ 2 (低 Ovo) の準備: 42 mL (阻害剤株式: 1 x EBSS+0.46% D (+)-グルコース + 26 Mm NaHCO3)。
      3. 阻害剤在庫のチューブ 3 (高 Ovo) の準備: 10 mL
    3. 0.22 μ m シリンジ フィルターを CO2 (95% O2と 5% CO2) タンクに接続されている 2 mL ピペットの先端に取り付けます。1-3 の管にバブルの CO2 。ソリューションにオレンジをバブリングを停止します。
    4. ソリューションを完了します。
      警告: 完了し、酵素の活性化のため使用する前に 15 分の 34 ° c 管 1 のソリューションを孵化させなさい。
      1. 酵素株式 + パパイン + 0.004 g L-システインの 180 U チューブ 1 (酵素) を準備: 22 mL
      2. チューブ 2 (低 Ovo) の準備: 42 mL 阻害剤ストック + 低 Ovo の 3 mL + DNase の 200 μ L。
      3. チューブ 3 (高 Ovo) の準備: 10 mL 阻害剤ストック + 高 Ovo の 2 mL + DNase の 20 μ L。
      4. チューブ 4 (0.2 %bsa) の準備: 19 mL 1 X DPBS + 4 %bsa の 1 mL + DNase の 8 μ L。
      5. チューブ 5 (0.02 %bsa) の準備: 1 X DPBS の 45 mL + 5 mL チューブ DNase の 4 + 50 μ L。
    5. 34 ° C で水お風呂と熱ブロックを予熱します。
  3. ラット皮質を抽出します。
    1. 70% エタノール手術装置を殺菌し、DPBS の 100 mm ペトリ皿を準備します。
    2. アクリル ボックスを準備します。ボックスの下部に組織の 2 〜 3 層を入れ、ボックスにイソフルランの 1 つの mL を追加します。
    3. ボックスで 20-40 s のための子犬を麻酔し、鉗子で足ピンチで anesthetization を確認します。10 mL のシリンジを用いた DPBS 子犬を灌流、心22を公開します。
      注: 灌流、血液細胞ミクログリア パン ステップ中に汚染を避けるために使用されます。
    4. 営業はさみで子犬の首の上部頚線をカットし、正中線に沿って頭の皮膚を切開します。正中線に沿って頭蓋骨を切開しカーブタイプ鉗子で頭蓋骨を開きます。
    5. カストロヴィーホー春ハサミで小脳を切除します。残りの脳を取り出し、100 mm のペトリ皿 DPBS でいっぱいに配置。
    6. 顕微鏡下でカストロヴィーホー春ハサミ皮質から海馬、中脳など他の領域を削除します。微細鉗子で髄膜を削除します。
    7. 新しい 60 mm ディッシュに皮質を転送し、皿に残りの DPBS を削除します。第 10 刃を持つ組織を切る。
  4. 単一細胞懸濁液に皮質を切り離す
    1. 60 mm ディッシュにフィルタ リング チューブ 1 ソリューションを注ぐし、DNase1 の 50 μ L を追加します。皿にソリューションを旋回します。
      注: DNase 破裂セルからの DNA の凝集を阻害するためです。
    2. 34 ° C の熱ブロックに皿を置き、真ん中に穴のある蓋でカバーします。はんだごてを使って、60 mm のシャーレの蓋に穴をあけます。
    3. 22 μ m シリンジ フィルター CO2タンク チューブを接続し、穴にフィルター チップを配置します。
    4. 45 分旋回 34 ° C で料理皿 10 に 15 分毎にソリューションを孵化させなさい。
  5. パン料理の準備を完了します。
    1. 一日早めに冷凍庫から二次抗体でコーティングされてパン料理を削除します。BSL 1 皿と室温の二次抗体だけ皿をまま
    2. 3 回を 20 mL DPBS の他の皿を洗います。
    3. 0.02 %bsa の十分な量を皿に注ぐ。特定の一次抗体を対応する料理に配置します。
      CD45 料理: 0.02 %bsa + 0.5 mg/mL ラット抗マウス CD45 の 20 μ L の 12 mL
      Itgb5 皿: 0.02 %bsa + 0.5 mg/mL Itgb5 の 20 μ L の 12 mL
      O4 料理: 0.02 %bsa、O4 抗体 4 mL 8 mL
      注: 使用マウス抗ラット CD45 マウス immunopanning (0.5 mg/mL) ミクログリアやアストロ サイトの HepaCAM (0.5 mg/mL) のため。
    4. 30 ml 30% の FBS neurobasal メディアと 1 X EBSS 10 mL。34 ° C の水浴の両方のソリューションを暖かい。
  6. パパイン反応を阻害します。
    1. 新しい 50 mL チューブにパパイン処理組織を転送します。組織が解決するを待ちます。吸い上げることによって液体を吸い出しなさい。
    2. 管に低 Ovo 溶液 4 mL を追加し、セルを洗浄するソリューションを旋回します。
    3. 手順 3.6.1-3.6.2 を 3 回繰り返す酵素反応を停止します。
  7. 皮質組織をカップ刻んだ。
    1. 低 Ovo の 6 mL を浴槽に追加します。吸引し、5 mL のピペットで迅速に組織を離します。
      注意: は、泡を取り上げないでください。
    2. 新しい 50 mL チューブを準備し、低 Ovo の 5 mL を追加します。新しい管に単一細胞を収集します。
    3. 繰り返しの手順 3.6.1-3.6.2 2 回、1 mL ピペット 5 mL ピペットに変更します。
    4. 製粉を繰り返して組織の 95% 以上は表示されません。
    5. チューブ 3 低 Ovo を含む下記 10 mL ピペットで解離細胞から高 Ovo ソリューションのレイヤーを確認します。
    6. いくつかのブレーキを 6 分 190 x g で遠心分離機します。
      メモ: は、減速率の最大は 9、1 つまたは 2 つの減速率を設定します。
  8. 単一細胞をろ過します。
    1. 慎重に吸引、上清を吸引し、0.02 %bsa 溶液 1 mL ピペット 3 mL にペレットを再懸濁します。
    2. 0.02 %bsa 溶液を追加 9 mL です。
    3. 新しい 50 mL のチューブとチューブの上に 20 μ m の細胞ストレーナーを準備します。0.02 %bsa 溶液 1 mL とセル ストレーナーを濡れています。
    4. セル ストレーナーに単一細胞懸濁液を転送します。一度に 1 つの mL をフィルター処理します。
    5. 0.02 %bsa 溶液 3 mL とセル ストレーナーを洗浄します。フィルター選択された単一細胞懸濁液 15 mL 以上をしないでください。
    6. 細胞回復のための 45-60 分の 34 ° C の水浴のチューブを孵化させなさい。染色体膜セル表面蛋白質の細胞回復ステップことができます。
  9. セルのパンを実行します。
    1. 3 回を 20 mL の DPBS CD45 パン皿を洗ってください。3 回使用の直前に DPBS 20 mL で一皿一皿を洗ってください。
    2. 単一細胞懸濁液、CD45 にパン皿に注ぐ。28 分の料理を残して、14 分の料理を振る。底からバインドされていないセルを削除、慎重に料理を振る。
    3. 細胞懸濁液を二次専用皿に転送します。20 分待つし、10 分間料理を慎重に振る。CD45 皿からミクログリアを取得、3.9.2 のステップに移動します。
    4. BSL 1 皿に細胞懸濁液を転送します。10 に 12 分の皿を残します。
    5. O4 の皿に移します。20 分待つし、10 分間振る。
    6. Itgb5 皿に移します。40 分の料理を残すし、10 分ごとを軽く振る。
      注: マウスをパンすると、HepaCAM 皿に細胞懸濁液を転送します。
  10. お皿からセルをデタッチします。
    1. 1 X EBSS の授精 8 mL のトリプシン (EBSS で 30,000 U/mL) のミックス 400 μ。
    2. 廃棄物バケツに皿に独立した細胞懸濁液を注ぐ。
    3. 8 回 DPBS と皿を洗ってください。
    4. EBSS の 8 mL のトリプシンを皿に注ぐ。
    5. 37 ° C の定温器で 5 〜 10 分の皿を孵化させなさい。10 分 CD45 皿のため、Itgb5 と HepaCAM の料理の 5 分間インキュベートします。
    6. 皿をタップし、顕微鏡下で皿を観察します。
      注: アストロ サイトのほとんどが切り離されていない場合、皿に戻す別の 5 分のためのインキュベーター。
    7. 30% の 10 mL を注ぐトリプシンを中和するために皿に FBS。
    8. 上下のピペット アストロ サイトやミクログリアをデタッチするのには全体の料理に。
    9. 50 mL チューブにソリューションを転送します。
    10. 30% の 10 mL を追加し FBS と皿に DNase を 200 μ l 添加します。セルをデタッチし直します。DNase は破裂のセルからの DNA の凝集を阻害するためです。
    11. チューブにソリューションを転送します。皿の中の細胞が残っている場合の追加 30% の別の 10 mL FBS とセルをデタッチし直します。
  11. 細胞をプレートします。
    1. 10 分の 213 x g でチューブを遠心します。
    2. 上清を吸引し、メディアで細胞ペレットを再懸濁します。
      メモ: は、ミクログリアのアストロ エアコン メディア immunopanned (IP ACM) とアストロ サイトおよび網膜マイクログリア基本的なメディア (MBM) immunopanned アストロ サイト基本的なメディア (IP ABM) を使用します。IP ABM と MBM 組成材料の表に掲載されています。
    3. 診断とセルをカウントします。
    4. アストロ サイトやミクログリア PDL コーティング プレートで個別にプレートします。
      注: 使用する前に歯根膜被覆板を準備します。PDL コーティング プレートを準備するには、5 mL の蒸留水に 1 mg/mL ポリ-D-リジンの 50 μ L を追加しよくプレート/皿にソリューションの十分な量を注ぎし、待つ 30 分洗浄 3 回蒸留水が付いているプレート/皿。
    5. プレートを孵化させなさい。メディアすべての 7 日間アストロ サイトやミクログリアの 3 日間の半分を変更します。

4. IP ACM を収集します。

  1. アストロ サイトに過度に合流する場合は、100 mm ディッシュを準備します。
  2. メディアを破棄して 3 回 DPBS 10 mL でお皿を洗ってください。
  3. 皿に低蛋白質の 15 mL を注ぐ。
    注: 低蛋白質メディア組成材料表で提示されます。
  4. 37 ° C の定温器で 7 ~ 10 日間、皿を孵化させなさい。
  5. 収集し、10 k でメディアを集中 (または 30 k) 遠心フィルター チューブ。
  6. 4 ° C で 851 x g でチューブを遠心分離します。
    注: 残りのメディアが 1 mL 以下になるまでチューブを遠心します。
  7. 新しい 1.5 mL チューブに収集集中メディア (IP ACM)。
  8. 定量的な解析を用いた IP ACM の濃度を測定します。

5. 貪食ライブ イメージング法 (図 2)

  1. 24 ウェル プレート (または任意のプレート/皿ライブ イメージング用に準備されている) 準備するアストロ サイトが合流 (孵化後浄化、細胞を安定させる最適の一般的には、7 ~ 10 日)。
  2. 各ウェルからメディアを取り出して、3 回 DPBS、1 mL で洗浄します。大気暴露を最小限に抑えるため、井戸をすぐに洗って。
  3. IP ABM の pH インジケーター共役シナプトソーム、グリア細胞の貪食能を調節することができます IP ACM など付加的な要因の 5 μ L 300 μ L を追加します。
  4. 40 分間の CO2インキュベーターでプレートを孵化させなさい。この手順では、pH インジケーター共役シナプトソーム プレートの底に解決するをことができます。
  5. 非連結 pH インジケーター共役シナプトソームでメディアを取り出し、洗って DPBS の 1 mL の各ウェル、3 回。
    注意: は厳しく洗わないでください。大気暴露を最小限に抑えるため、井戸をすぐに洗って。
  6. 井戸にテストする付加的な要因と IP ABM の 500 μ L を追加します。
  7. ライブ イメージング計測器にプレートを取るし、位置を選択します。フォーカス、露光時間、明るさ、および LED の電力を調整します。
    注: 露光時間、明るさ、および LED 電源の設定は、蛍光強度に応じて可変と実験の目的。PH インジケーター共役シナプトソーム ライブ イメージング抗体、我々 通常の値を設定、次のとおり: 露出: ~ 150-200 ms、輝度: 15、および LED の電源: 4-6。
  8. 画像形式、時間間隔、およびライブ イメージングのためのサイクルの合計数を設定します。時間間隔を 1 に設定、またはどのように多くのポジションに応じて 2 h が選択されています。2 時間間隔はライブ イメージングの以上 150 の位置が選択されている場合に推奨されます。
  9. ライブ イメージング実験を開始します。
  10. データを分析します。
    1. フィジー プログラムを開きます。
    2. イメージ シーケンスをインポートします。画像を 8 ビットのグレースケールに変換します。
    3. 50 ピクセルの半径バー ローリングと背景差分を実行します。
    4. 時間シリーズ ・ アナライザー V3 プラグインを起動します。
      注: 時間シリーズ ・ アナライザー V3 プラグインのアドレスは、材料表に提示されます。
    5. ドラッグ イメージとクリックで利益 (率 ROI) の領域を ROI マネージャーに追加します。
    6. 時系列 V3_0「全磁力を取得」をクリックします。
    7. 結果を保存し、データを統合します。

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Representative Results

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このin vitro貪食のアッセイで長期的なライブ イメージングによる成体マウス脳ホモジネート遠心 (23% 勾配液と 10% 勾配ソリューションのグラデーションのソリューションで分離されたから得たシナプトソームを使いました図 3)。調製後シナプトソームは彼らが機能を失ったし、アストロ サイトやミクログリアにおける PS 受容体によって認識されることを示唆している (図 4)、外膜に PS を公開しました。図 5のように、彼らはアストロ サイトで包まれたとき明るい赤い蛍光性が pH インジケーター共役シナプトソームに出力されます。グリア細胞の貪食・分解能力のリアルタイム比較は、投資収益率の複数の画像 (附則ムービー 1補足の映画 2) すべて 1 または 2 時間で可能です。この方法では、アストロ サイトやミクログリアによる貪食 (図 6) の異なる反応を示した。グリア細胞の貪食能を定量化する赤い蛍光性信号の領域 (μ2) 測定した、図 6Bで貪食能インデックスと呼ばれて、 図 7。Phagocytosing pH インジケーター共役シナプトソームを大量に効率的に現れましたがアストロ サイト、ミクログリア シナプトソーム (図 6 b) を分解を巻き込むと高速になる.アストロ サイトは 45 h で最大を示したに対し、ミクログリアは pH インジケーター共役 synaptosome 治療後 26 h、最大 pH インジケーター強度を示した (p-< 0.05、二元 ACM X 1 とアストロ サイトと 1 X ACM とミクログリアの間の値)。同様に、ミクログリア細胞アストロ サイトは、同じ期間中に合計 pH インジケーター強度で 17% 減少を示したに対し、ピーク ポイント後の pH インジケーター強度 40 h 20.7% 減少を示した。興味深いことに、我々 のデータは、ACM に含まれていたアストロ分泌因子 (図 6 b) 両方のアストロ サイトやミクログリアによる貪食を高めるため不可欠であることを示した。アストロ サイトは、MFGE8、GAS6、ブリッジ、貪食受容体間の相互作用を誘導するタンパク質などのブリッジの分子を解放する示されている、"食べる-私"PS23などの信号。前述のように、アストロ サイトは MERTK と神経: MEGF104経路を介してシナプスを排除します。神経: MEGF10 脳内アストロ サイトによる表現のみとの認識機能を通じてシナプス貪食に参加"を食べる-私"不明な id を持つ信号。前の調査結果と一致してアッセイは、野生型 (WT) マウスのアストロ サイト、神経: Megf10ノックアウト (KO) マウスのアストロ サイト保有有意な低下貪食能 (図 7) と比較することを示した。神経: Megf10 KO アストロ サイトを示した WT アストロ サイトと比較して、pH インジケーター強度ピーク時点 (31 h) (図 7) を約 40% 削減。

Figure 1
図 1。Immunopanning メソッドを使用してアストロ サイト浄化のスケマティックこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2。貪食ライブ イメージング法の概略図この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3。グラデーションのソリューションの代表的な脳ホモジネート分別しますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4。PS 公開シナプトソームの代表的なイメージです。シナプトソームとアストロ サイトの A (A) 明るいフィールド画像。シナプトソームはアストロ サイトに接続されます。(B) A tdTomato 発現マウスから浄化される tdTomato 陽性シナプトソームの蛍光イメージ脳します。(C) pSIVA は、synaptosome の外膜にさらされると緑色の蛍光を発する PS にバインドします。(D) PS pSIVA (緑) によって検出された、tdTomato 陽性シナプトソーム (赤) と共局在。スケール バー: 20 μ mこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5。代表的な明視野/蛍光画像 2 時点において pH インジケーター共役シナプトソームとアストロ サイトの。(底板) の治療後 11 h、pH インジケーター共役シナプトソーム アストロ サイトで包まれて、治療 (上部パネル) 後 1 h でしないでください彼らに対し赤の蛍光を発する。スケール バー: 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6。ラットおよび長期的なライブ イメージングによる貪食反応。(A) の精製および pH インジケーター共役シナプトソームと共にを使用しての in vitro貪食アッセイの模式図。ライブ映像が取られる前に非連結シナプトソームが洗い流されたとインキュベーションの 40 分後に注意してください。(B) 代表的なグラフがアストロ サイトやミクログリアの貪食・分解の速度論を示します。ACM は、アストロ サイト分泌因子を含んでいる、両方のアストロ サイトやミクログリアを介した synaptosome 吸収が向上します。ACM 1 X とアストロ サイト対アストロ サイト: コントロール * * *、テューキーの多重比較検定。ACM 1 X とミクログリアとミクログリア: コントロール * * *、テューキーの多重比較検定。誤差範囲を示す S.E.M. *p ≤ 0.05 * * * p ≤ 0.0001、二元。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7。1神経: Megf10 KO マウスのアストロ サイトの減少した貪食能力 X ACM 1 X ACM と WT マウスのアストロ サイトのそれと比較します。1 X ACM と神経: Megf10 KO アストロ サイト対 WT * * *、二元。誤差範囲を示す S.E.M. * p ≤ 0.05 * * p ≤ 0.01 * * * p ≦ 0.001 二元。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

表 1: ソリューションのレシピこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください

補足ムービー 1。アストロ サイトによるインジケーター共役シナプトソーム pH の貪食能を示す代表的なライブ イメージング ビデオ。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

補足ムービー 2。インジケーター共役シナプトソーム ミクログリア細胞によって pH の貪食能を示す代表的なライブ イメージング ビデオこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください

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Discussion

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この記事では、長期ライブ イメージングの in vitro貪食能試金精製のグリア細胞と pH インジケーター共役シナプトソームを使用しての手法を提示します。ミクログリアと比較して示すアストロ サイト シナプトソーム貪食刺激による別の貪食・分解能力を持っています。さらに、我々 のデータは、架橋分子 GAS6、蛋白質、MEGE8 などが含まれて、アストロ サイト分泌の要因が効率的な PS と脳のグリア細胞の細胞貪食のため不可欠である提案します。さらに、神経: Megf10 KO アストロ サイトはシナプトソームの欠陥の貪食能を示します。

この実験を正常に実行するには、メディアと DPBS は、洗浄のステップ (セクション 5) の中に慎重に交換する必要があります。一次培養アストロ サイト、ミクログリア、ミクログリア、大気暴露に弱いは特に。したがって、洗浄のステップ間の時間間隔を削減は、生きた細胞を維持するために重要です。ライブ イメージング計測器と長期的なライブ イメージングの設定、マニュアル フォーカスのオート フォーカスは、LED/レーザー露光時間は、細胞に損傷を与える可能性がありますを高める可能性がありますのでが推奨されます。

このメソッドは、synaptosome の浄化のプロトコル19少し変更されます。元のペーパーは、3%、10%、15%、23% にグラデーションのソリューションを分離します。ただし、精製シナプトソームの収穫を増加する, 3%, 10%, 23% のグラデーション ソリューションをセットアップします。Immunopanning アストロ サイトやミクログリア細胞についても、この方法で修正されます。パン プロトコル21元の目標はアストロ サイトのみを浄化し、BSL 1、二次のみ、CD45、O4、および Itgb5 を使用 (マウスの HepaCAM) immunopanning 順序として。CD45、二次のみ、BSL 1、O4、そして Itgb5 に順序を変えた私たち BSL 1 とセカンダリ専用プレートは、血管内皮細胞とミクログリア削除されます、ので (マウスの HepaCAM) 皿をパン、CD45 からミクログリアの収穫を増加します。このプロトコルでは我々 はまた、SD ラットの子犬を灌流 (~ P7 P10) CD45 陽性ミクログリア非集団からの汚染を最小限に抑えるために様々 な血液細胞を除去する循環系を通じて DPBS と。

In vitro貪食アッセイのいくつかの利点があります。Synaptosome 活用で使用される pH 指示薬は、低 pH 条件赤い蛍光を発するのみ。したがって、データを処理するとき直接測れる包まれて内部材の共局在信号を取得するバック グラウンド信号または複雑な生体イメージング解析を削除する手順を急冷しないで貪食イベントの信号として赤い蛍光性食細胞。さらに、このメソッドでは、複数の時点で指定された ROI 内 pH インジケーター強度の撮影によるグリア細胞の貪食性をリアルタイムで追跡ができます。100 h、貪食、分解まで pH インジケーター強度のグラフを生成することで、条件と異なるセルの容量を簡単に監視できます。別の利点は、シナプトソームの使用です。罰金とすべての時間を処理し、されているアストロ サイト ensheathe シナプスからシナプス生体内で4を巻き込むように、アストロ サイトの in vitro貪食能を測定するために非常に適してはシナプトソームを使用して。最後に、このin vitro貪食アッセイ様々 な脳神経疾患に関連しているミエリン破片やアミロイド β のグリア細胞の貪食能を研究開発する可能性があります。

高められた平均余命、神経変性疾患患者数の劇的な増加は避けられないです。グリア細胞によるシナプス損失はいくつか神経変性疾患13,14に主要な要因の 1 つです。さらに、異常なシナプス刈り込みと脳の恒常性の不均衡がグリア細胞貪食欠陥を関連付けることができます。したがって、要因とアストロ サイトの貪食・分解能力を制御することができます化合物を識別する、様々 な神経疾患の成功した治療法を見つけるための重要な可能性があります。以来、このin vitro貪食試験簡単にスケール アップが可能 multiwell プレートと、このメソッドなどの要因を識別するために様々 な上映のための適切なプラットフォームとして使用できます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

作者ありがとう淵チュ チョン彼女の実験的なサポート synaptosome 精製と Jungjoo 公園の中に PS 露出シナプトソームのイメージの。さらに、役に立つ議論のため鄭研究室のすべてのメンバーに感謝いたします。この作品は、韓国 (NRF) 交付金 (MSIP) (NRF 2016M3C7A1905391 と NRF 2016R1C1B3006969) の韓国の政府によって資金を供給の国立研究財団によって支えられた (W. S.C)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synaptosome purification
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 BIO-RAD 5000202
pH indicator conjugation
Dimethyl sulfoxide(DMSO) LPS solution DMSO100
pHrodo red, succinimidyl ester Molecula probes P36600
Immunopanning
10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) Sigma E7510
Bovine serum albumin Bovogen BSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase) Worthington Is002007
(DMEM) Gibco 11960-044
(dPBS) Welgene LB001-02
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) Vector Labs L-1100
Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) Jackson ImmunoResearch 115-005-044
Goat anti-mouse IgM (μ-chain) Jackson ImmunoResearch 115-005-020
Heparin-binding epidermal growth factor Sigma E4643
Human HepaCAM antibody R&D systems MAB4108
Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) eBioscience 14-0497-82
L-cysteine Sigma C7880
L-glutamate Gibco 25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC) Sigma A8199
Neurobasal media Gibco 21103-049
O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) Bansal et al.23
Papain Worthington Is003126
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Pluristrainer 20 μm PluriSelect 43-50020-03
Poly-D-lysine Sigma P6407
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Purified rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen 550539
Purified mouse anti-rat CD45 BD Pharmingen 554875
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Sodium selenite Sigma S5261
Transferrin Sigma T1147
Trypsin Sigma T9935
Trypsin inhibitor Worthington LS003086
Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) Beckman Coulter 344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) PALL MAP010C37
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) PALL MAP030C37
Phagocytosis live imaging assay
Juli stage NanoEntek
Time Series Analyzer V3 plugins https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

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References

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貪食能アッセイのアストロ サイトを介した新規<em>体外</em>ライブ イメージングを使用して pH インジケーター共役シナプトソーム
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Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).More

Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).

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