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Neuroscience

Um romance imagens Live In Vitro e fagocitose mediada por ensaio de Astrocyte usando pH sinaptossomas conjugada com indicador

doi: 10.3791/56647 Published: February 5, 2018

Summary

Este protocolo apresenta um em vitro de imagem live fagocitose ensaio para medir a capacidade fagocitária dos astrócitos. Microglia e astrócitos rat purificados são usados juntamente com sinaptossomas conjugada com indicador de pH. Esse método pode detectar a cinética de absorção e degradação em tempo real e fornece uma plataforma de triagem adequada para identificar fatores modulando a fagocitose de astrocyte.

Abstract

Astrócitos são o tipo de grandes células no cérebro e contatar diretamente as sinapses e vasos sanguíneos. Embora microglial células foram consideradas as principais células do sistema imunológico e somente os fagócitos no cérebro, estudos recentes têm mostrado que astrócitos também participam de vários processos fagocíticas, tais como eliminação de sinapse desenvolvimento e apuramento das placas de amiloide beta na doença de Alzheimer (AD). Apesar destas constatações, a eficiência de incorporações de astrocyte e a degradação de suas metas é claros comparado com o de micróglia. Esta falta de informação é principalmente devido à falta de um sistema de ensaio em que a cinética de astrocyte e microglia-mediada por fagocitose são facilmente comparáveis. Para atingir este objetivo, temos desenvolvido um longo prazo de imagem ao vivo em vitro fagocitose do ensaio para avaliar a capacidade fagocitária de purificado astrócitos e microglia. Neste ensaio, detecção em tempo real de absorção e degradação é possível usando sinaptossomas conjugada com indicador pH, que emitem fluorescência vermelha brilhante em organelas ácidas, tais como lisossomos. Nosso romance ensaio fornece detecção simples e eficaz de fagocitose através de imagem ao vivo. Além disso, este ensaio de fagocitose em vitro pode ser usado como uma plataforma de triagem para identificar os produtos químicos e compostos que podem melhorar ou inibir a capacidade fagocitária dos astrócitos. Como o mau funcionamento de poda sináptica e acúmulo de proteínas patogênicas foram mostrados para causar distúrbios mentais ou doenças neurodegenerativas, produtos químicos e compostos que modulam a capacidade fagocitária das células gliais devem ser útil no tratamento de várias doenças neurológicas.

Introduction

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Células gliais, que se referem às células não-excitáveis no cérebro, são o tipo de células importantes no sistema nervoso central (SNC). Anteriormente, as células gliais foram consideradas como meras células comprovativos que principalmente desempenham um papel passivo na manutenção da sobrevivência neuronal e basais Propriedades sinápticas. No entanto, surgir provas revelou que as células gliais desempenham um papel mais ativo em vários aspectos da neurobiologia, tais como a manutenção da homeostase do cérebro, mediando a sinapse formação1,2,3 e sinapse eliminação de4,5e modulando plasticidade sináptica6,7. Células gliais no SNC incluem astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Entre essas células, astrócitos e microglia têm sido mostrados para desempenhar funções fagocíticas por incorporação de sinapses4,5, de células apoptóticas8, detritos neural9e proteínas patogênicas, tais como beta amyloid placas de10,11. No cérebro em desenvolvimento, astrócitos eliminam sinapses em dorsal geniculado (dLGN) através de de fagocitose dependente MERTK - e MEGF10-4. Da mesma forma, microglia também eliminar sinapses C1q-revestido durante estágios do desenvolvimento até a cascata de complemento clássico5. Curiosamente, tem sido sugerido que defeitos na poda de sinapse podem ser um dos iniciadores de vários distúrbios neurológicos. Por exemplo, ficou demonstrado que mutações no componente do complemento 4 (C4), que aumenta a poda mediada por complemento sinapse por microglia, estão fortemente associadas com a prevalência da esquizofrenia em seres humanos12. Um estudo recente também mostrou que o caminho de complemento clássica é hiperactivos na fase de iniciação da AD e induz a perda precoce da sinapse nesta doença13.

Comparado com fagocitose mediada por microglia, se fagocitose mediada por astrocyte contribui para a iniciação e a progressão de várias doenças neurológicas é menos clara. No entanto, um estudo recente sugere que fatores que alteram a taxa de poda normal sinapse por astrócitos podem perturbar a homeostase do cérebro e contribuir para AD susceptibilidade e patologia14. A taxa de poda sinapse por astrócitos poderosamente é controlada pela ApoE isômeros, com um alelo protetor para AD (ApoE2) fortemente, aumentando a taxa e um alelo de risco para AD (ApoE4), diminuindo significativamente a taxa. Além disso, ratos transgênicos expressando ApoE4 acumularam C1q sináptica muito mais do que controle ou ApoE2 ratos14. Estes dados sugerem que deficientes auditivos fagocitose mediada por astrocyte no início da cérebro AD pode induzir o acúmulo de detritos senescentes C1q-revestido sinapses/sináptica que ativa a fagocitose mediada por complemento microglial, dirigindo a degeneração sináptica . A capacidade fagocitária prejudicada de astrócitos em portadores de ApoE4 também pode contribuir para a descontrolada acumulação de placas de amiloide beta nos cérebros afetados por AD.

Além disso, ficou demonstrado que as células gliais no cérebro envelhecido Drosophila perdem sua capacidade fagocitária devido à diminuição da tradução de Draper, um homólogo de Megf10 que astrócitos usam para fagocitose sinapses. Restaurar níveis Draper resgatou a capacidade fagocitária das células gliais, que eficientemente limpo de detritos axonal danificados no cérebro envelhecido uma medida semelhante que que no cérebro jovem, indicando que envelhecimento induzido por alterações na capacidade fagocítica de astrócitos podem contribuir para interrupção do cérebro homeostase15.

Com base nesses resultados novos, modulando a capacidade fagocitária de astrócitos pode ser uma estratégia terapêutica atraente para prevenir e tratar várias doenças neurológicas. A este respeito, houve várias tentativas de aumentar a capacidade fagocítica dos astrócitos, por exemplo, induzindo a acidificação de lisossomos com nanopartículas de ácido16 e superexpressão do fator da transcrição EB (TFEB), que pode melhorar lisossoma biogênese17. Apesar destas tentativas, é ainda não está claro como astrócitos e células microglial diferem em sua cinética fagocítica e se devemos aumentar ou diminuir sua capacidade fagocitária em várias doenças.

Neste trabalho, apresentamos um ensaio de romance em vitro para detectar a capacidade fagocitária de astrócitos em tempo real. Os dados mostram diferente cinética de absorção e degradação em astrócitos e microglia. Astrocyte-condicionado médio (ACM), que contém fatores secretados de astrócitos, é essencial para a eficaz fagocitose de astrócitos e microglia. Além disso, Megf10, um receptor fagocítica em astrócitos e um homólogo do Ced-1 e Draper, tem um papel crítico na fagocitose mediada por astrocyte8,18.

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Protocol

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Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo The Korea Advanced Institute of Science e cuidado tecnologia institucional Animal e Comissão de utilização (IACUC), KA2016-08.

1. purificação de synaptosome

Nota: Estes procedimentos são adaptados de um artigo anteriormente publicado19 com várias modificações para melhorar o rendimento do sinaptossomas purificados (Figura 1).

  1. Prepare a mídia gradiente descontínuo de densidade.
    1. Coloque o seguinte no gelo: 3%, 10% e 23% soluções de gradiente de densidade no buffer de gradiente (trazer a 250 mL de água com 5 mL de EDTA 0,2 M, pH 7,4, 606 mg de Tris e 109,54 g de sacarose); tampão de homogeneização (adicionar 25 mL de 4x do buffer de gradiente e 500 µ l de 50 mM DTT 74,5 ml de água); homogenizador almofariz e pilão.
      Nota: Preparação e solução de gradiente de densidade são apresentados na tabela 1. Para preparar a 3%, 10% e 23% densidade gradientes soluções, use solução de gradiente de densidade cru.
    2. Prepare-se seis tubos de centrífuga ultra-fino por três ratos adultos.
    3. Adicione 3 mL de solução de gradiente de densidade 23% na parte inferior de cada tubo de centrifugação com uma pipeta de 1 mL. Então, lentamente faça uma camada com 3 mL de solução a 10% densidade gradiente em cima a solução de gradiente de densidade 23% com um pasto pipeta e pipeta de 1 mL. Finalmente, adicione 3 mL de solução de gradiente de densidade 3% em cima. Nesta etapa, tenha cuidado para evitar a introdução de bolhas.
    4. Cobrir os tubos de centrífuga com filme plástico e manter os tubos em gelo.
  2. Precool uma centrífuga de alta velocidade e se a 4 ° C.
  3. Esterilize equipamentos cirúrgicos (tesoura, tesoura de mola Castroviejo e pinça curva de funcionamento) com etanol a 70%. Preparar um copo de vidro pequeno com 25 mL de tampão de homogeneização no gelo e pesar o béquer.
  4. Extrai os cérebros de ratos macho adulto três (aproximadamente 12 semanas de idade).
    1. Deslocar a vértebra cervical e cortar o pescoço com uma tesoura de funcionamento. Tire a pele da cabeça e crânio ao longo da linha mediana usando operacional tesoura e pinça curvada. Impostos especiais de consumo os bulbos olfatórios e cerebelo com tesoura de mola Castroviejo.
  5. Colocar o restante cérebro no copo com pinça curvada e pesar o cérebro. Enxague a cabeça várias vezes com tampão de homogeneização gelada para remover sangue na superfície do cérebro.
    Nota: Anteriormente, 9 mL de tampão de homogeneização a 1 g de tecidos cerebrais foi recomendado.
  6. Adicione 4 mL de homogeneização de buffer e 1g de tecidos do cérebro para a argamassa homogenizador. Enquanto homogeneizando o cérebro, adicionar homogeneização do buffer de 8 mL.
  7. Divida o homogeneizado em dois tubos de centrífuga de alta velocidade de 50 mL. Lave a argamassa com 1 mL de tampão de homogeneização fresca e adicioná-lo aos tubos.
    Cuidado: Proceda por etapas 1.3-1.7 tão rapidamente quanto possível. Recomenda-se a menos de 20 min.
  8. Centrifugue o homogenates em tubos de centrífuga de alta velocidade a 1.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C com freios mais lentos.
    Nota: Defina a taxa de desaceleração (freio) em dois ou três, quando a taxa máxima de desaceleração é nove.
  9. Cuidadosamente, adicione o sobrenadante para um novo tubo de 50 mL e adicionar até 12 mL de tampão de homogeneização.
  10. Lentamente e com cuidado Pipetar 2 mL do sobrenadante diluído sobre a solução de gradiente de densidade de 3%, com uma pipeta de 1 mL e coloque os tubos no gelo.
  11. Centrifugar a 31.000 x g por 5 min a 4 ° C sem freios.
    Nota: Definir a taxa de desaceleração em um (zero) ou da costa.
  12. Coloque os tubos no gelo e coletar a fração de synaptosome entre a solução de gradiente de densidade 23% e 10% solução de gradiente de densidade com uma pipeta 2 mL em um tubo de 50 mL. Adicionar gelada sacarose/EDTA buffer até 80 mL e divida-o em quatro tubos de centrífuga de alta velocidade de 50 mL.
    Nota: Consulte a Figura 3 para sinaptossomas fracionadas com gradientes rotulados.
  13. Centrifugar a 20.000 x g, durante 30 min a 4 ˚ c com menos interrupções.
    Nota: Defina a taxa de desaceleração em dois ou três, quando a taxa máxima de desaceleração é nove.
  14. Cuidadosamente, remover o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL, resuspenda o pellet de synaptosome com 1 mL de solução fisiológica isotônica (140 mM de NaCl, KCl de 3 mM, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES e glicose 10 mM, pH 7,4)20. Adicionar 1 mL de DMSO 10% em solução fisiológica isotônica (concentração final de DMSO: 5%) e recolher as sinaptossomas para um tubo de centrifugação de alta velocidade de 50 mL.
  15. Alíquota 1 mL em tubos de 1,5 mL. Medir a concentração de proteína das sinaptossomas usando o ensaio de Bradford.
  16. Rapidamente congelar os tubos e armazenar os tubos em um congelador de-80 ° C até conjugação de indicador de pH.

2. conjugação de indicador de pH

  1. Centrifugar tubos de 1,5 mL em sinaptossomas a 21.092 x g, durante 3-4 min a 4 ° C.
  2. Remover o sobrenadante, adicionar 200 µ l de 0,1 M Na2CO3 e misture bem por pipetagem.
    Nota: Na2CO3 foi adicionado elevar o pH como succinimidil éster mais eficientemente reage com aminas primárias em um pH ligeiramente alcalino.
  3. Adicione 2 µ l de indicador de pH para o tubo e delicadamente o vórtice.
    Atenção: Utilize 1 µ l de indicador de pH por 0,3 mg de solução de synaptosome.
  4. Minimizar a exposição à luz, cobrindo os tubos com folha de alumínio e incube-os por 1-2 h à temperatura ambiente (RT) em um shaker de torção com agitação suave em 30-40 rpm.
  5. Pare a agitação e adicione 1 mL de DPBS.
  6. Centrifuga os tubos a 21.092 x g, durante 1-2 min.
  7. Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de DPBS para Ressuspender o pipetando suave.
  8. Repita as etapas de 2,6-2,7 pelo menos sete vezes para remover o indicador de pH não acoplado.
  9. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 200 µ l de DPBS com 5% DMSO.
    Nota: neste ponto, todos sinaptossomas são não-funcional. Confirmamos a fosfatidilserina (PS) foi exposta para a membrana externa da literatura, que funciona como um "coma-me" sinal (Figura 4).

3. astrócitos e Microglia purificação

Nota: Este protocolo para a purificação de astrocyte é uma adaptação de um artigo anteriormente publicado21. Neste protocolo, a purificação de astrócitos de ratos e microglia é descrita. Procedimentos específicos para a purificação de astrocytes do rato e microglia também são descritos nas notas.

  1. Dia antes da purificação
    1. Prepare pratos de cultura celular pré-pintados e soluções.
    2. Prepare os pratos de Petri cinco 145 mm x 20 mm com 25 mL de 50 mM Tris-HCl (pH 9,5). Coloque o tratamento anticorpo primário ou secundário nos pratos de Petri separadamente conforme descrito abaixo. Incube os pratos no congelador durante a noite.
      BSL-1 prato: 20 µ l de 5mg/mL BSL-1 (Griffonia simplicifolia lectina)
      Prato somente secundária: 60 µ l de 2,4 mg/mL cabra anti-rato IgG + IgM (H + L)
      Prato de CD45: 60 µ l de 2,4 mg/mL cabra anti-rato IgG + IgM (H + L)
      Prato de O4: 60 µ l de 2,4 mg/mL cabra anti-rato IgM (µ-específica cadeia)
      Itgb5 (integrina β5) prato para astrócitos de ratos: 60 µ l de 2,4 mg/mL cabra anti-rato IgG + IgM (H + L)
      Nota: Para anexar o anticorpo secundário à superfície hidrofóbica da caixa de Petri, é recomendável fixação lenta em baixas temperaturas. No entanto, é possível revestir a placa de Petri com anticorpo secundário durante 2 h a 37 ° C. Anticorpos para garimpar astrocyte são usados diferentemente dependendo da espécie animal; por exemplo, HepaCAM prato para astrócitos rato: 60 µ l de 2,4 mg/mL cabra anti-rato IgG + IgM (H + L)
  2. Dia de purificação
    1. Prepare-se para immunopanning.
    2. Preparar os tubos de 50 mL e adicionar ações para os tubos. A preparação da solução estoque detalhado é apresentada na tabela 1.
      1. Prepare 1 tubo (enzima): 22 mL de caldo de enzima (estoque de enzima: 1 x solução salina equilibrada de Earle (EBSS)+0.46% D (+)-glicose + 26 mM NaHCO3 e0,5 mM EDTA).
      2. Prepare 2 tubo (baixa do Ovo): 42 mL de estoque inibidor (estoque de inibidor: 1 x EBSS+0.46% D (+)-glicose + 26 Mm NaHCO3).
      3. Preparar o tubo 3 (alto do Ovo): 10 mL de caldo de inibidor.
    3. Anexe filtros de seringa 0,22 µm para as pontas de pipetas de 2 mL, conectadas a um tanque de2 (95% O2 e 5% CO2) CO. Bolha de CO2 para tubos de 1-3. Pare de borbulhar quando as soluções liga laranja.
    4. As soluções completas.
      Atenção: Preencha e incubar a solução no tubo 1 a 34 ° C por 15 min antes de usar para a ativação da enzima.
      1. Prepare 1 tubo (enzima): 22 mL de caldo de enzima + 180 U de papaína + 0,004 g de L-cisteína.
      2. Prepare 2 tubo (baixa do Ovo): 42 mL de estoque inibidor + 3 mL de baixo do Ovo + 200 µ l de DNase.
      3. Prepare o tubo 3 (alto do Ovo): 10ml de estoque inibidor + 2 mL de Ovo alta + 20 µ l de DNase.
      4. Prepare o tubo 4 (0,2% de BSA): 19 mL de 1 X DPBS + 1 mL de 4% de BSA + 8 µ l de DNase.
      5. Prepare o tubo 5 (0,02% BSA): 45 mL de 1 X DPBS + 5 mL de tubo 4 + 50 µ l de DNase.
    5. Pré-aqueça um bloco de banho e de calor de água a 34 ° C.
  3. Extraia o córtex de rato.
    1. Esterilizar equipamentos cirúrgicos com 70% de etanol e preparar pratos de Petri-100mm com DPBS.
    2. Prepare uma caixa de acrílico. Coloque duas ou três camadas de tecidos na parte inferior da caixa e adicionar 1 mL de isoflurano na caixa.
    3. ANESTHETIZE filhotes para 20-40 s na caixa e confirme anesthetization pitada de pé com fórceps. Expor o coração22 e perfundir filhotes usando uma seringa de 10 mL com DPBS.
      Nota: A perfusão é usada para evitar a contaminação de células do sangue durante a etapa de panning microglia.
    4. Cortar linha cervical superior do filhote do pescoço com uma tesoura de funcionamento e faça uma incisão na pele de cabeça ao longo da linha mediana. Fazer uma incisão no crânio ao longo da linha mediana e abrir o crânio com pinça curvada.
    5. Excisar o cerebelo com tesoura de mola Castroviejo. Tirar o cérebro restante e coloque-o em um prato de Petri de 100mm cheio de DPBS.
    6. Retire outras áreas tais como o mesencéfalo e o hipocampo córtex com tesoura de mola Castroviejo sob o microscópio. Remova as meninges com pinça fina.
    7. O córtex de transferência para uma nova placa de 60 mm e remover o restante DPBS no prato. Corte o tecido com uma lâmina n º 10.
  4. Dissociar o córtex em uma suspensão de célula única
    1. Despeje a solução filtrada do tubo 1 em um prato de 60 mm e adicionar 50 µ l de DNase1. Agite a solução no prato.
      Nota: DNase é usado para inibir a agregação do DNA de células de ruptura.
    2. Coloque o prato em um bloco de calor de 34 ° C e cubra com uma tampa que tem um buraco no meio. Use um ferro de solda para fazer o furo na tampa da caixa de Petri 60mm.
    3. Conectar um tubo de tanque CO2 filtros de seringa 22-µm e coloque a ponta do filtro para o buraco.
    4. Incube o prato a 34 ° C, durante 45 min. redemoinho a solução no prato cada 10 a 15 min.
  5. Termine a preparação dos pratos panning.
    1. Remova os panning pratos que têm sido revestidos com anticorpos secundários do freezer um dia antes do tempo. Deixar o BSL-1 prato e prato de somente anticorpo secundário no RT
    2. Lave três vezes com 20 mL de DPBS outros pratos.
    3. Despeje uma quantidade adequada de 0.02% BSA os pratos. Coloque os pratos correspondentes anticorpos primários específicos:
      Prato de CD45: 12 mL de 0,02% de BSA + 20 µ l de anti-rato de rato CD45 de 0,5 mg/mL
      Prato de Itgb5: 12 mL de 0,02% de BSA + 20 µ l de 0,5 mg/mL Itgb5
      Prato de O4: 8 mL de 0,02% de BSA e 4 mL de anticorpo O4
      Nota: Para o utilizar para immunopanning de rato, anti-rato de rato CD45 (0,5 mg/mL) para microglia e HepaCAM (0,5 mg/mL) por astrócitos.
    4. Prepare 30 mL de 30% FBS com mídia neurobasal e 10 mL de 1 X EBSS. Ambas as soluções em um banho de água de 34 ° C de aquecimento.
  6. Iniba a reação de papaína.
    1. Transferi os tecidos tratados com papaína para um novo tubo de 50 mL. Espere que os tecidos resolver. Aspire o líquido por sucção.
    2. Adicionar 4 mL de solução de baixo do Ovo ao tubo e agite a solução para lavar as células.
    3. Repita as etapas 3.6.1-3.6.2 três vezes para parar a reação enzimática.
  7. Triture os tecidos do córtex.
    1. Adicione 6 mL de Ovo de baixa da banheira. Aspire e liberar os tecidos rapidamente com uma pipeta de 5 mL.
      Cuidado: Não introduza bolhas.
    2. Prepare um novo tubo de 50 mL e adicionar 5 mL de baixo do Ovo. Colete células individuais em um tubo de novo.
    3. Repita as etapas 3.6.1-3.6.2 duas vezes e altere a pipeta de 5 mL para uma pipeta de 1 mL.
    4. Repita a trituração até mais de 95% dos tecidos não são visíveis.
    5. Faça uma camada de Ovo alta solução de células do tubo 3, com uma pipeta de 10 mL abaixo do Ovo-contendo baixa dissociado.
    6. Centrifugar a 190 x g, durante 6 minutos com alguns freios.
      Nota: Defina a taxa de desaceleração em um ou dois, quando a taxa máxima de desaceleração é nove.
  8. Filtrado de células únicas.
    1. Cuidadosamente, aspirar o sobrenadante por aspiração, em seguida, resuspenda o pellet com 3 mL de solução de 0,02% BSA com uma pipeta de 1 mL.
    2. Adicionar a solução de 0,02% BSA até 9 mL.
    3. Prepare um novo tubo de 50 mL e filtro de célula 20 µm em cima do tubo. Molhe o filtro célula com 1 mL de solução de BSA de 0,02%.
    4. Transferi a suspensão de célula única para o filtro da célula. Filtro de 1 mL de cada vez.
    5. Lave o filtro de célula com 3 mL de solução de BSA de 0,02%. Não faça mais do que 15 mL da suspensão filtrada única célula.
    6. Incube o tubo em um banho de água de 34 ° C por 45-60 min para recuperação de célula. O passo da recuperacao de célula permite a relocalization de proteínas de superfície celular para a membrana.
  9. Realize a visão panorâmica das células.
    1. Lave o prato panning CD45 três vezes com 20 mL de DPBS. Lave cada prato três vezes com 20 mL de DPBS imediatamente antes do uso.
    2. Despeje a suspensão de célula única para a CD45 Garimpando o prato. Deixe o prato para 28 min e agitar o prato para 14 min. Para remover células desacopladas do fundo, agite cuidadosamente o prato.
    3. Transferi a suspensão de células para o prato apenas secundária. Aguarde 20 min e agite cuidadosamente o prato por 10 min. Para obter a microglia do prato CD45, vá para a etapa 3.9.2.
    4. Transferi a suspensão de células para o prato de BSL-1. Deixe o prato para 10 a 12 min.
    5. Transferir para o prato de O4. Aguarde 20 min e agitar durante 10 min.
    6. Transferir para o prato de Itgb5. Deixe o prato por 40 min e agite suavemente a cada 10 min.
      Nota: Para rato garimpar, transferi a suspensão de células para o prato de HepaCAM.
  10. Separe as células do prato.
    1. Mix 400 µ l de tripsina (30.000 U/mL em EBSS) com pré-incubada 8mL de 1 X EBSS.
    2. A suspensão de célula destacada no prato despeje um balde de lixo.
    3. Lave o prato oito vezes com DPBS.
    4. Despeje o prato 8 mL de EBSS com tripsina.
    5. Incube o prato por 5 a 10 min na incubadora 37 ° C. Incube durante 10 min para o prato de CD45 e 5 min para os pratos de Itgb5 e HepaCAM.
    6. Toque o prato e observar o prato sob um microscópio.
      Nota: Se a maioria dos astrócitos não ter destacado, devolva o prato aos incubadora para mais 5 minutos.
    7. Despeje 10 mL de 30% FBS no prato para neutralizar a tripsina.
    8. Pipete acima e para baixo no prato inteiro para desanexar astrócitos ou microglia.
    9. Transferi a solução para um tubo de 50 mL.
    10. Adicionar 10 mL de 30% FBS e 200 µ l de DNase no prato. Separe as células novamente. DNase é usado para inibir a agregação do DNA de células de ruptura.
    11. Transferi a solução para o tubo. Se as células permanecem no prato, adicione outro 10ml de 30% FBS e separar as células novamente.
  11. As células da placa.
    1. Centrifugar o tubo a 213 x g durante 10 minutos.
    2. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com a mídia.
      Nota: Use mídia básico de immunopanned astrocyte (IP-ABM) para astrócitos e microglia retinal mídia básico (MBM) com immunopanned astrocyte-condicionado mídia (IP-ACM) para microglia. O IP-ABM e MBM composições são apresentadas na Tabela de materiais.
    3. Conte as células com um hemocytometer.
    4. Placa de astrócitos e microglia separadamente em placas com revestimento em PDL.
      Nota: Prepare o prato revestido PDL antes do uso. Para preparar placas revestidas PDL, adicionar 50 µ l de poli-D-lisina de 1 mg/mL em 5 mL de água destilada e despeje uma quantidade suficiente de solução o placa/prato bem e esperar por 30 min. Lave o prato/prato três vezes com água destilada.
    5. Incube a placa. Mude metade dos meios de comunicação cada 7 dias para astrócitos e 3 dias para microglia.

4. recolher IP-ACM

  1. Prepare um prato de 100mm quando astrócitos são excessivamente confluentes.
  2. Descartar os meios de comunicação e lave o prato três vezes com 10 mL de DPBS.
  3. Despeje o prato 15 mL de mídia de baixa proteína.
    Nota: A composição de mídia de baixa proteína é apresentada na Tabela de materiais.
  4. Incube o prato por 7 a 10 dias na incubadora 37 ° C.
  5. Coletar e concentrar os meios de comunicação com 10k (ou 30K) tubos de filtro centrífugo.
  6. Centrifugar os tubos a 851 x g a 4 ° C.
    Nota: Os tubos de centrifuga, até que os restantes meios de comunicação são menos de 1 mL.
  7. Coletar mídia concentrada (IP-ACM) para um novo tubo de 1,5 mL.
  8. Medir a concentração de IP-ACM usando análise quantitativa

5. a fagocitose de imagem ao vivo ensaio (Figura 2)

  1. Preparar uma placa de 24 (ou qualquer placa/prato que está preparado para viver de imagem) no quais astrócitos são confluentes (geralmente, de 7 a 10 dias de incubação, após a purificação é ideal para estabilizar as células).
  2. Remova a mídia em cada poço e lavar os poços com 1 mL de DPBS, três vezes. Para minimizar a exposição do ar, lave os poços rapidamente.
  3. Adicione 300 µ l de IP-ABM com 5 µ l de sinaptossomas conjugada com indicador de pH e fatores adicionais, tais como IP-ACM que pode modular a fagocitose da célula glial.
  4. Incube a placa numa incubadora de CO2 por 40 min. Este passo permite que o pH sinaptossomas conjugada com indicador acertar a parte inferior das placas.
  5. Remova a mídia com sinaptossomas conjugada com indicador de pH não acoplado e lavar cada poço com 1 mL de DPBS, três vezes.
    Atenção: Não lave duramente. Para minimizar a exposição do ar, lave os poços rapidamente.
  6. Adicione 500 µ l de IP-ABM com fatores adicionais para testar nos poços.
  7. Levar o prato para um instrumento de geração de imagens ao vivo e selecione posições. Ajuste o foco, tempo de exposição, brilho e poder de LED.
    Nota: As configurações de tempo de exposição, brilho e poder de LED são variável dependendo da intensidade de fluorescência e a finalidade do experimento. No ensaio de geração de imagens ao vivo com sinaptossomas conjugada com indicador de pH, normalmente definimos os valores da seguinte forma: exposição: ~ 150-200 ms, brilho: 15 e LED de energia: 4-6.
  8. Defina o formato de imagem, intervalo de tempo e o número total de ciclos para geração de imagens ao vivo. Definir o intervalo de tempo de 1 ou 2 h, dependendo de quantas posições são selecionados. 2 hora intervalos são recomendados quando mais de 150 posições são selecionadas para geração de imagens ao vivo.
  9. Inicie as experiências de imagens ao vivo.
  10. Analise os dados.
    1. Abra o programa de Fiji.
    2. Importe uma sequência de imagens. Converta imagens em tons de cinza de 8 bits.
    3. Execute a subtração de fundo com um rolamento bar raio de 50 pixels.
    4. Inicie o tempo série analisador V3 plugins.
      Nota: O endereço para o analisador de tempo série V3 plugins é apresentado na Tabela de materiais.
    5. Arrastar a região de interesse (ROI) na imagem e clique em Adicionar-no Gerenciador de ROI.
    6. Clique em "Obter intensidade total" da série de tempo V3_0.
    7. Salvar os resultados e integrar os dados.

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Representative Results

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Em vitro fagocitose ensaio com imagens de viver a longo prazo, nós usamos sinaptossomas de homogenates de cérebro de rato adulto, que foram separados na solução de gradiente entre solução gradiente de 23% e 10% solução gradiente por ultracentrifugação ( A Figura 3). Depois da preparação, sinaptossomas expostos PS em sua membrana externa (Figura 4), sugerindo que eles perderam a sua função e podem ser reconhecidos por receptores de PS em astrócitos e microglia. Como mostrado na Figura 5, sinaptossomas conjugada com indicador de pH emitido fluorescência vermelha brilhante quando eles foram engolfados por astrócitos. Comparação em tempo real das capacidades de absorção e degradação das células gliais é possível tomando várias imagens de um ROI cada 1 ou 2 h (1 de filme suplementar, complementar Movie 2). Com este método, temos demonstrado diferente cinética de astrocyte e microglia-mediada por fagocitose (Figura 6). Para quantificar a fagocitose de células gliais, foi medida a área (µm2) do sinal de fluorescência vermelha, que é referido índice phagocytic na Figura 6B e Figura 7. Apesar de astrócitos apareceram para serem eficientes na fagocitose grandes quantidades de sinaptossomas conjugada com indicador de pH, microglia foram mais rápidos em engolindo e degradante sinaptossomas (Figura 6B). Microglia mostrou intensidade de indicador de pH máximo a 26 h após o tratamento de synaptosome conjugada com indicador de pH, Considerando que os astrócitos mostraram seu máximo a 45 h (p-valor < 0.05, ANOVA de duas vias entre astrocyte com 1 X ACM e microglia com 1 X ACM). Da mesma forma, pilhas microglial mostraram uma redução de 20,7% na intensidade de luz indicadora de pH total 40 h após o ponto de pico, Considerando que os astrócitos mostraram uma redução de 17% na intensidade do indicador de pH total durante o mesmo período de tempo. Curiosamente, nossos dados mostraram que fatores secretados por astrocyte, que foram objecto de ACM, são essenciais para aumentar ambos astrocyte e microglia-mediada por fagocitose (Figura 6B). Astrócitos têm sido mostrados para liberar a ponte de moléculas, tais como MFGE8, GAS6 e proteínas, que podem colmatar e induzem interações entre receptores fagocíticas e "coma-me" sinais como PS23. Como mencionado acima, astrócitos eliminam sinapses através os caminhos MERTK e MEGF104. MEGF10 só é expresso por astrócitos no cérebro e participa de incorporações de sinapse através de reconhecendo "coma-me" sinais com identidades desconhecidas. De acordo com as conclusões anteriores, o ensaio mostrou que, em comparação com astrócitos de rato selvagem-tipo (WT), Megf10 nocaute (KO) rato astrócitos possuído significativamente prejudicada capacidade fagocitária (Figura 7). Comparado com astrócitos WT, Megf10 KO astrócitos mostraram uma redução de aproximadamente 40% na intensidade de indicador de pH total no ponto de pico (31 h) (Figura 7).

Figure 1
Figura 1. Esquemático da purificação astrocyte usando métodos de immunopanning. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Esquemática de ensaio de geração de imagens ao vivo de fagocitose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Fracionamento de homogenate cérebro representativo nas soluções gradientes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Imagens representativas de PS-expostos sinaptossomas. (A), A imagem de campo brilhante de astrócitos com sinaptossomas. Sinaptossomas estão anexadas ao astrócitos. (B) A imagem fluorescente de sinaptossomas tdTomato-positivo, que são purificados de mouse tdTomato-expressando o cérebro. (C) pSIVA vincula-se ao PS, que é exposta a membrana exterior de synaptosome e emite fluorescência verde. PS (D) detectado pelo pSIVA (verde) é co localizadas com sinaptossomas tdTomato-positivo (vermelhas). Barra de escala: 20 µm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. Campo claro representativo e imagens fluorescentes de astrócitos com sinaptossomas conjugada com indicador de pH em dois pontos do tempo. Às 11 h após o tratamento (painel inferior), sinaptossomas conjugada com indicador de pH são tragadas por astrócitos e emitem fluorescência vermelha, Considerando que eles fazem não a 1 h após o tratamento (painel superior). Barra de escala: 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. Fagocítica cinética de astrócitos de ratos e microglia através de imagens de viver a longo prazo. (A), A diagrama esquemático de um ensaio fagocitose em vitro usando purificados astrócitos e microglia juntamente com sinaptossomas conjugada com indicador de pH. Observe que antes de serem tomado imagens ao vivo, desacopladas sinaptossomas são lavadas após 40 min. de incubação. (B) representante gráficos mostrando a cinética de absorção e degradação de astrócitos e microglia. ACM, que contém factores astrocyte-secretada, aumenta significativamente tanto absorção de synaptosome astrocyte e microglia-mediada. Astrocyte: Controle vs Astrocyte com ACM 1 X, * * *, Tukey do teste de comparações múltiplas. Microglia: Controle vs Microglia com ACM 1 X, * * *, Tukey é o teste de comparação múltipla. Barras de erro indicam no MEV mostrou *p ≤ 0.05, * * * p ≤ 0,0001, ANOVA de duas vias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7. Diminuição da capacidade fagocitária de astrócitos de rato Megf10 KO com 1 X ACM comparado com o de astrócitos de rato WT com 1 X ACM. WT vs Megf10 KO astrócitos com 1 X ACM, * * *, ANOVA de duas vias. Barras de erro indicam no MEV mostrou * p ≤ 0.05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001 ANOVA de duas vias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: receitas solução. Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme suplementar 1. Um representante de imagem ao vivo vídeo mostrando a fagocitose de pH sinaptossomas indicador-conjugados por astrócitos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementar filme 2. Um vídeo de viver de imagem representativo mostrando fagocitose de pH sinaptossomas indicador-conjugados por pilhas microglial. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

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Neste artigo, apresentamos os métodos para um longo prazo de imagem ao vivo em vitro fagocitose ensaio usando células gliais purificadas e sinaptossomas conjugada com indicador de pH. Mostramos que, em comparação com microglia, astrócitos possuem capacidade de absorção e degradação diferente durante a fagocitose de sinaptossomas. Além disso, nossos dados sugerem que fatores astrocyte-secretado, que contêm pontes moléculas como proteínas, GAS6 e MEGE8, são essenciais para a fagocitose eficiente de PS-dependente de células gliais no cérebro. Além disso, Megf10 KO astrócitos mostram defeituoso fagocitose de sinaptossomas.

Para executar com êxito este experimento, a mídia e DPBS precisam ser trocados com cuidado durante as etapas de lavagem (secção 5). Primária cultivadas astrócitos e microglia, especialmente microglia, são vulneráveis à exposição do ar. Portanto, reduzir os intervalos de tempo entre as etapas de lavagem é fundamental para a manutenção de células vivas. Para criação de imagens de viver a longo prazo com instrumentos de geração de imagens ao vivo, foco manual é recomendado uma vez que o foco automático pode aumentar o tempo de exposição do laser/LED, que pode danificar as células.

Neste método, o synaptosome purificação protocolo19 é ligeiramente modificado. O papel original separa soluções gradientes em 3%, 10%, 15% e 23%. No entanto, montamos 3%, 10% e 23% gradientes soluções para aumentar o rendimento de sinaptossomas purificadas. As instruções para immunopanning astrócitos e células microglial também são modificadas neste método. O objetivo do original panorâmica protocolo21 é purificar apenas astrócitos e usar BSL-1, somente secundária, CD45, O4 e Itgb5 (HepaCAM para mouse) como a ordem de immunopanning. Desde placas BSL-1 e somente secundária irão remover as células endoteliais, bem como a microglia, mudámos a ordem para CD45, somente secundária, BSL-1, O4 e Itgb5 (HepaCAM para mouse) para aumentar o rendimento da microglia da CD45 Garimpando o prato. Neste protocolo, nós também perfundidos SD filhotes (~ P7-P10) com DPBS através do sistema circulatório para remover vários glóbulos para minimizar a contaminação de populações não-microglial de CD45-positivo.

Existem várias vantagens do ensaio em vitro fagocitose. O indicador de pH usado em conjugação synaptosome apenas emite fluorescência vermelha em condições de baixo pH. Portanto, quando o processamento de dados, nós diretamente pode quantificar fluorescência vermelha como um sinal de fagocíticas eventos sem um processo de resfriamento para remover sinais de fundo ou complicada análise de imagem para obter sinais co localizados de material tragado dentro de fagócitos. Além disso, este método permite o acompanhamento em tempo real de fagocitose glia tomando imagens de intensidade de luz indicadora de pH dentro de um determinado ROI em vários pontos de tempo. Gerando um gráfico com a intensidade de luz indicadora de pH até 100 h, a imersão, bem como degradação das capacidades podem ser facilmente controladas entre células diferentes e condições. Outra vantagem é o uso de literatura. Desde ensheathe de astrócitos sinapses processa o tempo todo com sua multa e tem sido mostrado para engolfar sinapses na vivo4, usar sinaptossomas é muito apropriado para medir a em vitro capacidade fagocitária de astrócitos. Finalmente, este ensaio de fagocitose em vitro tem potencial para ser desenvolvido para estudar glia fagocitose de mielina detritos ou amiloide beta, o que está relacionado a várias doenças neurológicas.

Com o aumento da esperança de vida, um aumento dramático no número de pacientes com doenças neurodegenerativas é inevitável. Perda de sinapse através das células gliais é um dos principais fatores em vários Neurodegenerativas Doenças13,14. Além disso, poda de sinapse anormal e um desequilíbrio da homeostase do cérebro podem ser associados a fagocitose gliais defeitos. Portanto, identificação de fatores e compostos que podem controlar as capacidades de absorção e degradação de astrócitos pode ser crítico para encontrar tratamentos bem sucedidos para vários distúrbios neurológicos. Desde que este ensaio em vitro fagocitose pode ser facilmente dimensionado com placas do multiwell, este método pode ser usado como uma plataforma adequada para várias seleções para identificar tais fatores.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecer Jung Joo Yeon dela apoio experimental durante a purificação de synaptosome e parque de Jungjoo para imagens de sinaptossomas com exposição de PS. Além disso, agradecemos a todos os membros no laboratório de Chung para discussão útil. Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de pesquisa de subvenção de Coreia (NRF), financiada pelo governo coreano (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 e 2016R1C1B3006969-NRF) (W.-S. C).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synaptosome purification
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 BIO-RAD 5000202
pH indicator conjugation
Dimethyl sulfoxide(DMSO) LPS solution DMSO100
pHrodo red, succinimidyl ester Molecula probes P36600
Immunopanning
10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) Sigma E7510
Bovine serum albumin Bovogen BSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase) Worthington Is002007
(DMEM) Gibco 11960-044
(dPBS) Welgene LB001-02
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) Vector Labs L-1100
Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) Jackson ImmunoResearch 115-005-044
Goat anti-mouse IgM (μ-chain) Jackson ImmunoResearch 115-005-020
Heparin-binding epidermal growth factor Sigma E4643
Human HepaCAM antibody R&D systems MAB4108
Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) eBioscience 14-0497-82
L-cysteine Sigma C7880
L-glutamate Gibco 25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC) Sigma A8199
Neurobasal media Gibco 21103-049
O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) Bansal et al.23
Papain Worthington Is003126
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Pluristrainer 20 μm PluriSelect 43-50020-03
Poly-D-lysine Sigma P6407
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Purified rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen 550539
Purified mouse anti-rat CD45 BD Pharmingen 554875
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Sodium selenite Sigma S5261
Transferrin Sigma T1147
Trypsin Sigma T9935
Trypsin inhibitor Worthington LS003086
Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) Beckman Coulter 344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) PALL MAP010C37
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) PALL MAP030C37
Phagocytosis live imaging assay
Juli stage NanoEntek
Time Series Analyzer V3 plugins https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164, (1-2), 183-196 (2016).
  2. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486, (7403), 410-414 (2012).
  3. Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13, (1), 22-24 (2010).
  4. Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504, (7480), 394-400 (2013).
  5. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, (4), 691-705 (2012).
  6. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539, (7629), 428-432 (2016).
  7. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155, (7), 1596-1609 (2013).
  8. Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36, (19), 5185-5192 (2016).
  9. Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28, (1), 20-33 (2014).
  10. Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8, (1), 301-311 (2013).
  11. Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model. Cell. 160, (6), 1061-1071 (2015).
  12. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530, (7589), 177-183 (2016).
  13. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352, (6286), 712-716 (2016).
  14. Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (36), 10186-10191 (2016).
  15. Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
  16. Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. (2015).
  17. Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34, (29), 9607-9620 (2014).
  18. Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
  19. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, (11), 1718-1728 (2008).
  20. Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96, (3), 656-668 (2006).
  21. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, (5), 799-811 (2011).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, (1), 264-278 (2008).
Um romance imagens Live <em>In Vitro e</em> fagocitose mediada por ensaio de Astrocyte usando pH sinaptossomas conjugada com indicador
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Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).More

Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).

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